日立-基因测序仪/基因分析仪-DS3000

使用了DS3000 Compact CE Sequencer的短DNA的读取精度的提高

在Sanger测序中，时有在开始读取的区域中无法获得峰波形，或者出现读取错误的情况。这是由于填充在毛细管中的电泳介质 (聚合物) 有无法正确检测，分离短DNA的情况。此实验是使用DS3000 Compact CE Sequencer，提高了开始读取区域的数据质量1的示例。为了改善，使用了加尾引物。尾部是添加到测序引物5’末端的任意碱基序列。由于尾部可延长反应产物，因此可通过电泳分离。当添加40个碱基至尾部时，可从测序引物的3’末端下游第1个碱基的DNA开始无错误地读取。另一方面，显示出读取碱基的长度缩短了相当于尾部的长度。在添加尾部时，请参考本报告，事先确认必要的分析区间。

使用DS3000 Compact CE Sequencer的GC-rich序列的解析实例

富含鸟嘌呤 (G) 与胞嘧啶 (C) 的序列 (GC-rich序列) 通常多出现在转录调控区域等的基因 组上功能重要的位置。在GC-rich序列中，时有发生聚合酶的延伸反应被阻碍，而在PCR与循环测序反应中，导致无法获得目标产物的情况。可以考虑到的原因是由于鸟嘌呤-胞嘧啶形成比腺嘌呤-胸腺嘧啶更稳定的碱基对，所以双链DNA不能很好地被解链。因此，可添加促进DNA解链的添加剂 (PCR添加剂)。代表性的PCR添加剂有甲酰胺 (FA) 与甜菜碱 。 在此实验中，使用GC-rich序列，针对FA与甜菜碱的浓度及添加时间进行了研究。结果是，通过添加PCR添加剂，即使在GC含量高于70%的情况下，也可获得PCR产物。另一方面，在循环测序中如果添加PCR添加剂，不仅会降低信号强度，还会在波形数据中混入干扰峰，碱基的错误读取 (读取错误) 也有所增加。

使用DS3000 Compact CE Sequencer新功能进行SNaPshot TM分析

DS3000 Compact CE Sequencer(DS3000)已添加新功能。 使用新型DS3000，可以单 独设定用于分析的荧光染料和Size Standard Protocol，并可以使用更多种试剂盒。 为了验证新功能，使用旧型DS3000不支持的的荧光染料组合，实施SNaPshotTM (Thermo Fisher Scientific)。 SNaPshotTM是一种利用单碱基的延伸反应，同时鉴定与引物邻接的碱基的技术。 通过改变各反应产物的泳动速度，可以同时检测多个SNP。 在本次实验中，利用DS3000的新功能，可一次性检测了6个SNP。

DS3000 Compact CE Sequencer上GlobalFiler TM Express PCR Amplification Kit的性能

GlobalFilerTM Express PCR Amplification Kit (Applied BiosystemsTM)是常用于DNA分析的试剂包之一，可通过单一/多重PCR扩增包括European Standard Set和CODIS (Combined DNA Index System) 推荐的基因座集的24个标记。本报告检测出从DS3000 Compact CE Sequencer上的GlobalFilerTM Express PCR Amplification Kit中获得的样 品的数据质量。通过分析灵敏度、精度、重复性，得出了DS3000 Compact CE Sequencer的性能满足使用GlobalFilerTM Express PCR Amplification Kit实现DNA分析的结论。

用DS3000 Compact CE Sequencer 检查下一代测序分析数据

在下一代测序分析中检测出的基因组上的突变（以下简称NGS），由于分析的简便性，通过Sanger测序可以检测出来（参考文献（1）。在此，介绍用 DS3000 Compact CE Sequencer以下简称DS3000）、进行NGS变体分析的实例。最初，通过从人类结肠癌细胞株（HCT116）中提取的基因组DNA，对12个单碱基替换进行了分析。DS3000的碱基识别程序可以检测出所有单碱基替换。此外，通过用Mutation Surveyor ver. 5.1.2, SoftGenetics公司）分析在DS3000中获取的波形数据，可以检测出突变率的定量、碱基的插入或缺失。 本仪器是研究专用仪器，并未获得基于药事法的医疗仪器的认证。因此，此仪器不可用于诊断。

使用DS3000 Compact CE Sequencer 进行亚硫酸氢盐测序分析的实例

在组成DNA的4个碱基中，胞嘧啶的5位碳原子可以通过甲基转移酶的作用甲基化。 胞嘧啶的甲基化对基因组功能的调控等基因组的各种事件起重要的作用，被视为遗传学上代表性标记。 所甲基化的胞嘧啶以单碱基为单位而分析的方法中有亚硫酸氢盐测序分析。 亚硫酸氢盐测序分析中，将从样品中提取的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理一段时间。 此时，胞嘧啶脱氨基后转变成尿嘧啶，但是已经甲基化的胞嘧啶将不被反应而将残留。 因此，通过反应产物的序列，可以区分已甲基化的胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶。在此，介绍使用DS3000 Compact CE Sequencer(以下简称DS3000)时的亚硫酸氢盐测序分析实例。 所使用样品为HCT116 细胞株的基因组DNA通过CpG methylase更深度地甲基化的标准样品。 而且将亚硫酸氢盐处理样品在DS3000上进行电泳而获取的碱基序列与亚硫酸氢盐处理之前的序列进行了比较。 结果，存在于分析区域中的20个已甲基化的胞嘧啶中检测出了19个。

使用DS3000 Compact CE Sequencer 进行细胞鉴定的实例

细胞株的误识别或污染，将对实验结果有很大的影响。 因此，推荐定期实施细胞株鉴定(Cell Line Authentication: CLA)，并确认无外来细胞的混入或置换。 在CLA中，广泛使用对STR(Short Tandem Repeat)进行分析的方法。 STR是散布在基因组中的以2-7个碱基短串联重复序列。 不同个体间的STR的重复次数（等位基因）各不相同，因此STR是DNA鉴定中很有用的标记。 在CLA中首先用PCR扩增多个STR后，通过毛细管电泳鉴定每个等位基因。 然后，将已鉴定的等位基因与在ATCC(American Type Culture Collection)等生物资源中心注册的各个的等位基因（以下，标记为参考等位基因）相比较而鉴定细胞株（1）。 此时，为了获取高可靠性的结果，仪器需要具有高分析性能。 在此，介绍使用DS3000 Compact CE Sequencer (以下简称DS3000)时的CLA实例。 用GenePrint® 10 System与GenePrint® 24 System (Promega®)验证的结果，以DS3000获取的等位基因与参考等位基因的一致程度为大于等于80%时，将其判断为相同细胞（2）。 由此可知，DS3000具有可进行CLA的分析性能。

紧凑型毛细管电泳测序仪中样品注入条件及泳动性能的验证

紧凑型毛细管电泳测序仪DS3000是将带负电荷的DNA分子注入到毛细管中，通过阳极与DNA溶液之间产生电位差的方式进行测定。此时，加载的电压（以下统称样品注入时电压）以及电压加载的时间（以下统称为样品注入的时间），对测定注入的DNA量或检测的峰值有很大的影响。因此，如果这些样品注入时的条件不正确，可能会导致数据的不准确。DS3000中预先设定电泳分析模式，充分发挥仪器的优良性能，一般情况下不需要对每个样品检测进行条件检查。（对于信号强度极低的样品，建议更改样品加入条件，以保证得到理想的数据。）

DS3000应用|微卫星不稳定性(MSI)分析在一胰腺癌切除术临床案例术后长期肿瘤基因型追踪分析中的应用

KRAS中一种普遍存在的突变在胰腺癌的发生过程中起着起始基因的作用，随后肿瘤抑制基因如TP53，CDKN2A，SMAD4导致侵袭性和转移性疾病前体的进展。一项研究表明，这些突变的数量与PDA患者的术后生存率显著相关。最近的遗传学研究也发现PDA之间的突变谱存在相当大的差异，这可能广泛对应于不同的分子亚型。即使存在转移，阐明PDA遗传背景的临床意义对于预测有效的长期生存和对患者进行选择性手术治疗也是必要的。

DS3000使用聚合物7进行片段分析

紧凑型毛细管电泳测序仪DS3000可根据实验需求，从两种聚合物聚合物4和聚合物7中择优选取。其中，聚合物7主要用于DNA测序分析，但也可用于片段解析。 此实验使用GenePrintTM 24 System（Promega®公司）验证了聚合物7的片段分析性能。

应用DS3000进行贝类过敏原检测

食物过敏在成人中的发生率为1% - 3%，在儿童中的发生率为4% - 6%，过敏严重时可能会危及生命。因此，过敏原的检测与标记在保障食品安全方面是一项十分重要的课题。ELISA是常用的过敏原检测方法，但从灵敏度、成本、操作的简便性等出发，可通过间接的方法，如PCR等来检测过敏原。 此实验将以贝类为主的软体动物中普遍存在的原肌球蛋白基因作为检测目标，介绍一种联合多重PCR与毛细管电泳，进行高灵敏度分析（片段分析）的方法。

应用DS3000进行微卫星不稳定性检测

微卫星不稳定性（MSI）是在短片段、重复的微卫星序列处产生的突变，因其可以作为多种肿瘤的生物标记物而广为人知。MSI是由用于DNA复制时修复错配碱基的DNA错配修复（MMR）系统的缺陷导致的。由于MSI分析需要以单个碱基的分辨率检测并对比每一个信号，因此，对片段大小识别准确度与重现性的要求较高。 此处以MSI分析举例，使用商品化的的石蜡包埋切片介绍从DNA提取到数据分析的一系列流程。