pFastBac1昆虫胞内质粒

pFastBac1昆虫胞内质粒

基本信息

别名: pFastBacI，pFastBac 1

复制子: pUC ori，F1 ori

终止子: SV40 poly(A) signal

质粒分类: 广宿主系列，昆虫细胞载体

质粒大小: 4776bp

原核抗性: 氨苄青霉素Amp

筛选标记: 庆大霉素Gen

克隆菌株: 大肠杆菌DH5α

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 昆虫细胞

诱导方式: 无须诱导，瞬时表达

5'测序引物: pFastbac-F: TATTCCGGATTATTCATACC

3'测序引物: pFastBac-R: ACAAATGTGGTATGGCTGA

质粒简介

       pFastBac1载体是非融合性蛋白表达载体，在载体内部不带有其他融合性的蛋白标签。为了保证目的基因的正确表达，插入片段必须包含ATG起始密码子，保证蛋白起始翻译。插入片段最好包含终止密码子，保证蛋白质不会翻译出多余的氨基酸。在pFastBacI载体多克隆位点中，对于所有的三种读码框分布，都包含有终止密码子。

     The Bac-to-Bac® Vector Kit contains a pFastBac™ 1 vector, as well an expression control vector, intended for use as part of the Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System , which enables the efficent production of recombinant baculovirus for expression testing in insect cells. The Bac-to-Bac® System relies on generation of recombinant baculovirus by site-specific transposition in E. colirather than homologous recombination in insect cells (Figure 1). This system features:

    Time-saving expression bacmid. With Bac-to-Bac®, the expression cassette of the pFastBac™ vector recombines with the parent bacmid in DH10Bac™ E. coli Competent Cells (not included with this vector kit) to form an expression bacmid. The bacmid is then transfected into insect cells for production of recombinant baculovirus particles.

    Easy colony screening. The parent bacmid in DH10Bac™ E. colicontains a segment of the lacZα gene. The lacZα gene is disrupted upon transposition of the expression cassette into the bacmid allowing for blue/white selection of recombinants. This makes identification  of recombinant colonies easy.    .

质粒图谱

扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
        1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）
        ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；
        ②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

        ③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

        ④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

        ⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

        ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

        2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

        3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

        4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。