pFastBacDual昆虫双框质粒

pFastBacDual昆虫双框质粒

基本信息

别名: pFastBac Dual

启动子: P10+PH promoter

复制子: pUC ori，F1 ori

终止子: SV40 poly(A) signal

质粒分类: 广宿主系列，昆虫细胞载体

质粒大小: 5238bp

原核抗性: 氨苄青霉素Amp

筛选标记: 庆大霉素Gen

克隆菌株: 大肠杆菌DH5α

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 昆虫细胞

诱导方式: 无须诱导，瞬时表达

5'测序引物: pFastbac-F: TATTCCGGATTATTCATACC

3'测序引物: pFastBac-R: ACAAATGTGGTATGGCTGA

质粒简介

    pFastBac Dual昆虫细胞表达载体包含有两个启动子，能够同时表达两个外源基因，一个表达基因是polyhedrin (PH)启动子控制，另一个外源基因是由p10启动子控制。

pFastBacDual 载体的特点是在单个载体上有两个启动子，用于在使用 Bac-to-Bac® 杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System) 时在昆虫细胞中同时表达两个蛋白质。该载体具有两个强启动子，多角体蛋白启动子和p10 启动子，因此可实现高水平表达。包含 CAT和β-葡萄糖醛酸酶 (gus) 的表达对照。

   The Bac-to-Bac® Vector Kit contains a pFastBac™ 1 vector, as well an expression control vector, intended for use as part of the Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System , which enables the efficent production of recombinant baculovirus for expression testing in insect cells. The Bac-to-Bac® System relies on generation of recombinant baculovirus by site-specific transposition in E. colirather than homologous recombination in insect cells (Figure 1). This system features:

   Time-saving expression bacmid. With Bac-to-Bac®, the expression cassette of the pFastBac™ vector recombines with the parent bacmid in DH10Bac™ E. coli Competent Cells (not included with this vector kit) to form an expression bacmid. The bacmid is then transfected into insect cells for production of recombinant baculovirus particles.

   Easy colony screening. The parent bacmid in DH10Bac™ E. colicontains a segment of the lacZα gene. The lacZα gene is disrupted upon transposition of the expression cassette into the bacmid allowing for blue/white selection of recombinants. This makes identification of recombinant colonies easy.

质粒图谱

扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
        1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）
        ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；
        ②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

        ③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

        ④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

        ⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

        ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

        2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

        3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

        4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。