pEE12.4哺乳抗体质粒
基本信息
启动子: hCMV-MIE
复制子: pEE6 ori
终止子: SV40 poly(A) signal
质粒分类: 哺乳细胞,抗体表达载体
质粒大小: 5067bp
原核抗性: 氨苄青霉素Amp
克隆菌株: 大肠杆菌DH5α
培养条件: 37℃,有氧,LB
表达宿主: 哺乳细胞
诱导方式: 无须诱导,瞬时表达
5'测序引物: CMV-F:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
3'测序引物: 根据序列设计引物
质粒简介
Lonza生物公司的Glutamine Synthetase(GS, 谷氨酰胺合成酶)基因表达系统载体pEE6.4载体,利用谷氨酰胺合成酶筛选标记,能够高水平的在哺乳细胞内表达目的基因。GS酶是生物体内以谷氨酸和氨为底物合成谷氨酰胺的酶。GS酶的活性能够被甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine,MSX)选择性的抑制。一些哺乳动物细胞,例如小鼠骨髓瘤细胞(NSO细胞系)无法表达GS,所以在不添加谷氨酰胺的情况下, 细胞将无法生长。对于这些细胞系,在无谷氨酰胺的培养基内,一个转染的GS基因可以作为一个筛选标记。其他的一些细胞系,例如CHO-KI,能够产生内源 性的GS酶。对于这些细胞,在无谷氨酰胺培养基内,在高水平足够抑制GS酶合成的MSX(甲硫氨酸砜亚胺)的作用下,可以对细胞的生长提供一个选择压力。
质粒图谱
![](http://shqshengbio.com/uploads/allimg/200827/1-200RGK502135.png)
扩增流程
收到产品后,请先根据产品管壁标签来判断产品形式,并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉(请务必转化挑单克隆重提后使用)
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl 无菌水溶解质粒;
②取2μl质粒加至100μl 感受态中,冰浴30min后,42℃热激60s,不要搅动,再冰浴2min;
(从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作)
③加入500μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
④取10μl、100μl复苏液,并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
(可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布,可以比传统涂布方法获得更多转化子)
⑤将平板正向培养1h,再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h;
(如果菌落过多,请将质粒稀释后再转化。如果无菌落,请加入10μl质粒离心全涂转化)
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220rpm震荡培养14h,根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌:四区划线后挑单菌落培养,酵母菌需要先液体复苏再四区划线,再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌:穿刺接种,液体培养后四区划线,再挑单菌落液体培养。
4、平板:直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒:单独提取的液体质粒收到后可直接使用。