pBV220大肠表达质粒

pBV220大肠表达质粒

基本信息

启动子: pR/pL

复制子: pUC ori

质粒分类: 大肠杆菌载体；蛋白表达质粒

质粒大小: 3666bp

原核抗性: 氨苄青霉素Amp

克隆菌株: 大肠杆菌DH5α

培养条件: 30℃，有氧，LB

表达宿主: 大肠杆菌

培养条件: 30℃，有氧，LB

5'测序引物: pBV220-F: 5′-AAGAAGGGCAGCATTCAAAG-3‘

3'测序引物: pBV220-R: 5′-CTGCGTTCTGATTTAATCTG-3‘

备注: 温控表达质粒

质粒简介

pBV220质粒的SD sequence（用于结合原核生物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白。

载体含有强的转录终止子可 防止出现"通读"现象，有利于质粒-宿主系统的稳定。

载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。pBV220含有PL启动子和编码对该启动子具有抑制作用而又对温度敏感的cI蛋白基因cIts857调控基因cI，因此可用温度对插入其中的外源基因的转录进行调控。

温控型原核表达载体，高拷贝数，大容量，强启动子，强转录终止子，可在任何受体菌中诱导表达。

pBV220载体是λPL/PR-cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 ℃表达非融合的目的蛋白。

在利用pBV220载体进行质粒构建的时候，需要加入ATG起始密码子。

PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ℃，诱导温度为42 ℃。

Ampr, 氨苄抗性基因;

ori, 质粒复制起点;

cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达目的基因;

PRPL, 来自于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动子，保证基因的高水平表达;

SD, Shine-Dalgarno序列;

rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终止信号;

pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体,目前仍在广泛使用.

质粒图谱

扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
        1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）
        ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；
        ②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

        ③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

        ④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

        ⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

        ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

        2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

        3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

        4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。