pRSFDuet-1大肠双表达质粒
基本信息
启动子: T7/Lac
复制子: RSF ori
终止子: T7 terminator
质粒分类: 大肠系列质粒;大肠其它质粒;大肠双框质粒
质粒大小: 3829bp
质粒标签: N-6×His,C-S
原核抗性: 卡那青霉素Kan(50μg/ml)
克隆菌株: DH5α等大肠杆菌
培养条件: 37℃,有氧,LB
表达宿主: BL21(DE3)等大肠杆菌
培养条件: 37℃,有氧,LB
诱导方式: IPTG或乳糖及其类似物
5'测序引物: ACYCDuetUP1-F(GGATCTCGACGCTCTCCCT) DuetUP2-F( TTGTACACGGCCGCATAATC)
3'测序引物: DuetDOWN1-R( GATTATGCGGCCGTGTACAA) T7-ter-R( TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)
备注: 同时表达两个外源蛋白
质粒简介
pRSFDuet-1质粒是一种原核表达载体, N端含有一个6×His标签,C端含有一个S标签。该质粒含有多个常用的酶切位点,便于不同基因克隆。表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导,目的基因被克隆到质粒载体上,受噬菌体强转录及翻译信号控制。
该质粒还携带有RSF复制因子、lacI基因和氯霉素抗性基因。可以使这个pETDuet-1载体在一个适当的宿主菌株的coexpression 4目标基因插入MCS1的基因可以使用ACYCDuetUP1引物和DuetDOWN1引物进行测序。插入MCS2的基因可以用DuetUP2引物和T7进行排序。
pRSFDuet-1 is designed for the coexpression of two target ORFs. The vector contains two multiple cloning sites (MCS), each of which is preceded by a T7lac promoter and ribosome binding site (rbs). The vector also carries the RSF1030-derived RSF replicon, lacI gene and kanamycin resistance gene (KnR). This vector can be used in combination with pACYCDuet™-1 , pCDFDuet™-1 , and pETDuet™-1 in an appropriate host strain for the coexpression of 4 to 8 target proteins. ORFs inserted into MCS1 can be sequenced using the ACYCDuetUP1 Primer and DuetDOWN1 Primer . ORFs inserted into MCS2 can be sequenced using the DuetUP2 Primer and T7 Terminator Primer . Unique sites are shown on the circle map.
质粒图谱
扩增流程
收到产品后,请先根据产品管壁标签来判断产品形式,并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉(请务必转化挑单克隆重提后使用)
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl 无菌水溶解质粒;
②取2μl质粒加至100μl 感受态中,冰浴30min后,42℃热激60s,不要搅动,再冰浴2min;
(从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作)
③加入500μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
④取10μl、100μl复苏液,并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
(可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布,可以比传统涂布方法获得更多转化子)
⑤将平板正向培养1h,再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h;
(如果菌落过多,请将质粒稀释后再转化。如果无菌落,请加入10μl质粒离心全涂转化)
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220rpm震荡培养14h,根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌:四区划线后挑单菌落培养,酵母菌需要先液体复苏再四区划线,再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌:穿刺接种,液体培养后四区划线,再挑单菌落液体培养。
4、平板:直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒:单独提取的液体质粒收到后可直接使用。