真菌RNA小量提取试剂盒说明书

真菌RNA小量提取试剂盒说明书

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名称：真菌RNA小量提取试剂盒

品牌：Omega

供应商：上海远慕

英文名/型号：Fungal RNA Kit(5)    

英文名/型号：Fungal RNA Kit(50)    

英文名/型号：Fungal RNA Kit(200)

用途：从小于100mg真菌组织或真菌细胞中提取总RNA

真菌RNA小量提取试剂盒特性与优点：
可靠－－操作简单，每次都能获得理想的效果
快速－－可在30min内完成一次抽提工作
RNA完整－－纯化的RNA不会发生降解，纯度高

真菌RNA小量提取试剂盒说明书操作步骤：

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇! 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl  β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。 提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶或者lysostaphin的TE(10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/ml。

1.离心收集1-2ml菌液(108-109细胞)到一个1.5ml离心管, 尽可能去除上清，注意残留的上清不能超过20μl/每使用100μl TE(见下面步骤2)。

2.根据细胞的种类和数量,充分重悬细胞在100μl(5x108细胞)/ 200μl(5x108-7.5x108细胞) TE中(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA),TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin,浓度为1mg/ml,或者直接用TE重悬后,用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。

3.室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶, 或者37℃温育15分钟/ lysostaphin,破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。注意各种细菌破壁的难易程度不一样,一般革兰氏阴性菌使用上面的条件就足够了,甚至可能省略该步骤,但是某些阳性难破壁需要提高溶菌酶浓度或者使用lysostaphin, 玻璃珠机械破壁,蛋白酶K消化或者联合使用等方法, 需要根据用户自己的具体情况调节酶的工作浓度和温育温度、时间和选择正确的方法。

4.加入350μl（如果上面使用100μl TE/酶）或者700μl（如果上面使用200μl TE/酶）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。

5.加入250μl 96－100％乙醇（曾加入100μl TE/350μl RLT管）或者500μl96－100％乙醇（曾加入200μl TE/700μl RLT管），立即吹打混匀。

6.立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。

7.加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。

8.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。

9.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。  

11.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤10, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度gao)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度gao,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。

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