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名称:质粒中量提取试剂盒
品牌:Omega
供应商:上海远慕
型号:Plasmid Midi Kit(2)
用途:从小于15ml培养过夜的菌液提取50-70ug高纯度质粒DNA
![mega质粒中量提取试剂盒Plasmid Midi Kit(2)](https://img1.17img.cn/17img/images/201710/uepic/f1035ec1-7461-4cdc-9116-c8ac6814c6c9.jpg)
质粒中量提取试剂盒Plasmid Midi Kit(2)操作步骤:
提示:将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,使用后置于2-8℃保存。
1.取过夜培养菌40-60ml(最大不超过90 ml)菌液,装入50ml离心管中,4,500~6,000 x g于4℃离心5 min沉淀菌体(也可12,000 x g离心2分钟),完全弃除上清。
2.加入2.5 ml 溶液P1,充分混悬震荡菌体沉淀,使其完全分散开,至无絮块存在。室温放置3~5 min。如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3.加入2.5 ml 溶液P2,轻轻颠倒离心管6~8次,室温放置5 min,使细菌完全裂解,溶液透明。 温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
4.加2.5 ml溶液PⅢ,立即颠倒离心管6~8次,充分混匀,至白色絮状物产生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min,小心吸出上清,移入新的50 ml离心管中。加入溶液PⅢ后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。
注意: 使用异丙醇沉淀,蛋白杂质和盐离子共沉淀较少,可能看不到明显的较大团块沉淀,但是质粒还是可以完全沉淀下来,不影响实际的质粒产量。如果你习惯看见较大的沉淀团块操作,可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。
5.加入5 ml 异丙醇,颠倒离心管,充分混匀。
6.于4℃ 12,000~16,000 x g离心10 min,小心弃去上清,倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体,加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍,最高速离心5分钟,弃上清,晾干沉淀。
质粒中量提取试剂盒Plasmid Midi Kit(2)注意事项:
1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2.提取大质粒时操作动作要轻柔,应该使用剪大了开口的吸头,防止机械剪切对DNA的损坏。
3.DNA沉淀液沉淀离心后,可能看不到明显沉淀。如未见沉淀,担心DNA丢失,可保留上清液,待完成全部操作后电泳鉴定,以确定是否获得终产物(数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上,可能无法看到明显团块)。
4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。
5.质粒DNA确切分子大小, 必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道确切大小。
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