质粒高纯（高性能）小量提取试剂盒

上海远慕生物新品供应美国Omega品牌旗下的质粒高纯（高性能）小量提取试剂盒，质粒小量提取试剂盒I型，质粒小量提取试剂盒II型，快速过滤超大量质粒提取试剂盒，超快速96孔质粒小量提取试剂盒，无内毒素小量质粒提取试剂盒 I/II，BAC/PAC大型质粒提取试剂盒，胶回收/PCR纯化试剂盒，RNA探针纯化试剂盒，磁珠寡核苷酸纯化试剂盒，循环DNA提取试剂盒，法医样品DNA提取试剂盒，其他系列等，本司为美国Omega品牌代理商，了解更多提取试剂盒资讯请来电洽谈！

名称：质粒高纯（高性能）小量提取试剂盒

品牌：Omega

供应商：上海远慕

货号/型号：D7043-01/HP Plasmid Mini Kit I(50)

货号/型号：D7043-02/HP Plasmid Mini Kit I(200)

货号/型号：D7045-01/HP Plasmid Mini Kit II（50）

货号/型号：D7045-02/HP Plasmid Mini Kit II（200）

用途：从富含核酸核酸的菌株中纯化高纯度的质粒DNA

质粒小量提取试剂盒特性与优点：

安全－无酚氯仿等危险的有机物抽提

可靠－操作简单，每次都能获得理想的效果

高纯－几乎不含蛋白质的污染，可长期保存

稳定－彻底去除核酸酶，质粒更稳定

质粒高纯（高性能）小量提取试剂盒操作步骤：

提示：第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! e 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。  

1. 取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液，12,000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌 体。  收集超过1.5 ml菌液， 可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。 

 2. 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。    如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。  

3. 加250μl的溶液P2，温和地上下翻转6 -8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。  温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。  

4. 加350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6 -8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。 13,000rpm离心10分钟，小心取上清。

加入溶液P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。 平衡液预处理吸附柱：  使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用” 

5. 将上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）， 12,000rpm离心 30-60秒，倒掉收集管中的废液。  

6. 可选步骤:加入500μl去蛋白液PE，12,000rpm 离心30-60秒，弃废液。  此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。 

 7. 加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒， 弃掉废液。  

8. 加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 

 9. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 

 10. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗 脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。  洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。

质粒高纯（高性能）小量提取试剂盒注意事项：

1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。  

3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。  

4.质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 

5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

说明：在某些大肠杆菌菌株内常常含有高活性的核酸酶，甚至多次接种的DH5α菌株(EndoA-)也会因发生突变而导致菌株的核酸酶复活。在常规的碱裂解法中，由于核酸酶不易失活而导致提取的质粒DNA发生降解，即使是纯化的质粒冷藏于-20°C，降解也常有发生。该系列试剂盒采用高活性的蛋白酶消化方法，能彻底去除菌株自身的核酸酶，从而保证纯化的质粒不会发生降解。因此，该系统适合于需要将纯化的质粒长期冷藏和频繁解冻使用的用户,适合于从含高活性核酸酶的菌株中纯化质粒DNA,适合于从动物身上刚分离出来的菌株中提取质粒。HP Plasmid Mini Kit I可以从1-5ml过夜培养菌液中提取出30ug 高纯质粒，HP Plasmid Mini Kit II可以从5-15ml过夜培养菌液中提取70ug 高纯质粒。

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