大极性水溶性较好类样品的分离纯化研究

‍

当大家在做分离纯化时遇到水溶性较好的样品首先会采用什么分离纯化方法进行分离呢？这里小编主要讲一些个人小经验，通常小编会优先选择C18 色谱柱进行尝试，因为该色谱柱具有更好的普适性，可解决80%左右的分离纯化任务，并且具有令人满意的分离度，因此成为最广泛应用的分离纯化方法，但它有自己的短板即采用高比例水相作为流动相时会导致疏水塌陷现象，使色谱柱瞬间保留能力下降甚至无保留作用，当遇到这种情况时小编一般会采用C18 AQ柱进行再次尝试。

C18 AQ色谱柱适用于当样品极性较大水溶性较好并且在C18 色谱柱上没有保留的情况，此色谱柱通过在硅胶基质表面进行修饰，如引入亲水的氰基，使硅胶表面的亲水性更强，从而防止疏水坍塌现象的发生，专门为高水相洗脱条件设计，可以耐受100%水相体系。但是如果采用此色谱柱样品依然没有保留怎么办呢？是不是就没有办法对此类样品进行分离？答案当然不是的，对于在C18 AQ柱上依然无保留或者没有得到很好分离效果的样品也可以采用ARG色谱柱尝试分离纯化，往往也能获得令人满意的效果。

ARG色谱柱，其填料表面键合有极性很强的Arg基团，可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。其保留机制是液-液分配、吸附作用、离子交换等多种作用组合，从而使HILIC与反相相比有独特的选择性。HILIC固定相是极性组分，可吸附极性溶剂和水相使固定相表面形成极性亲水层，基于相似相容的原理，则极性样品会与固定相相互作用，从而增加保留，所以流动相至少要含有3%的极性溶剂，这样才能在固定相表面形成亲水层。ARG二氧化硅专用于各种亲水性化合物的分离，适合于极性较大的样品的分离纯化，主要用于在AQ柱上依然无有效保留的场景。其常用的流动相体系是乙腈和水，水作为强溶剂，乙腈作为弱溶剂，某些情况下如果水相洗脱能量太强，可用极性有机溶剂代替部分水相可增加保留时间，但不可用甲醇、乙醇等极性醇类完全替换乙腈，否则会导致保留时间不充分。

如采用以上色谱柱仍没有获得另你满意的分离效果当然还可以尝试其他色谱柱，例如氨基柱、二醇基柱、苯基柱等等。

下面就以某客户提供的极性较大且水溶性较好的样品为例，对采用不同色谱柱分离纯化结果进行简单的对比。

样品由某位客户所提供，具有很好的水溶性，适合使用反相分离模式。本次纯化主要尝试3种不同型号的色谱柱，依次是C18(SW-8201-012,40-63um)、C18 AQ(SW-5223-025,15um)、ARG(SW-5622-025,20-45um)，最终发现分离效果最好的是C18 AQ柱，所有的分离过程均使用水和乙腈作为流动相，上样方式均是液体进样。

1.使用普通C18柱 (SW-8201-IR,40-63um) 的分离过程：

图1：C18色谱柱的分离图谱

2.使用C18 AQ柱(SW-5223-025,15um)的分离过程 ：

图2：C18 AQ色谱柱的分离谱图 

从上图可知，样品在C18 AQ色谱柱上得到了很好的分离效果，检测到目标物。接下来为了验证ARG色谱柱的分离效果，因此尝试ARG色谱柱进行分离纯化。3.使用ARG柱(SW-5622-025,20-45um)的分离过程： 

图3：ARG色谱柱的分离谱图 

从上图（图3）可以发现使用ARG柱，样品的出峰顺序与C18反相柱完全相反，而且峰1和峰2的分离度会显著提升。缺点是分离时间相对较长，而且柱子中有明显的色素残留，无法完全洗干净。

综上所述，采用C18 AQ柱分离效果最好，用时最短，且色谱柱使用冲洗后无明显色素残留。