SepaFlash氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究

SepaFlash氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究

背景介绍

糖类化合物亦称碳水化合物，是多羟基（2个以上）的醛类或酮类化合物，在水解后能变成以上两者之一的有机化合物，在化学上由于其碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合，故又称碳水化合物。糖类主要分为单糖、多糖、低聚糖。所有的糖都是以单糖为基本单位构成，从单糖开始，如葡萄糖和果糖，可以形成双糖、三糖或四糖，甚至有上亿个糖分子组成的复合聚合物--多糖。

糖类化合物是植物、动物和微生物的重要组分，与人类生活密切相关，是人体能量的主要来源。它不仅是营养物质，而且有些还具有特殊的生理活性。当其与脂质、肽、蛋白质甚至核酸结合时在医学上有相当大的应用，例如：人需要葡萄糖注射液、右旋糖酐作血浆制剂，肝脏中的肝素有抗凝血作用，血型中的糖与免疫活性有关。此外，核酸的组成成分中也含有糖类化合物--核糖和脱氧核糖。 糖类化合物在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。

糖类化合物缺乏发色基团，导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱，传统快速液相色谱法通常只配备紫外 (UV) 检测器，不能检测低含量或缺乏发色团的目标化合物。而低温蒸发光散射检测器（ELSD）作为一种近乎通用的技术，具有紫外检测器不可比拟的优越性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，此外ELSD的检测灵敏度也较高，可检测到更多微弱的信号。

本研究探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化，结合UV检测器和ELSD检测器（蒸发光散射检测器）共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品，由于样品为极性很强的糖类分子，在普通C18反相柱上保留很弱，针对样品的具体性质，应用工程师利用Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与ELSD检测器联用，成功对样品进行了纯化，为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。

实验部分

样品信息：

葡萄糖：Glucose，C₆H₁₂O₆，葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。

果糖：Fructose，C₆H₁₂O₆，广泛应用于食品、医药、保健品生产中。

乳糖：Lactose，C₁₂H₂₂O₁₁，乳糖主要用于制造婴儿食品和配制药物，例如制药片、药粉时用作稀释剂。

以上样品极性很大，易溶于水，其分子结构式示意图参见图1。

图1. 糖类样品分子结构式示意图

由于样品分子极性很大，易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低，因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中，C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱，适合各类极性较大样品的分离，因此我们首先尝试用一根C18反相分离柱对样品进行制备纯化。称取2g葡萄糖，2g果糖，4g乳糖样品溶于50ml水中，利用注射器取1ml混合样品上样至Flash分离柱上。相同的上样量条件下，我们也尝试用氨基柱进行实验，相较于C18反相分离柱，氨基分离柱适用于极性更大的样品纯化，样品的Flash制备纯化实验参数如表1所示。

表1.  Flash制备纯化实验参数设置

结果与讨论

样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知，由于样品极性较大，样品在普通C18反相柱上基本没有保留，随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来，未能获得有效的纯化。此外，从Flash制备图谱也可以看出，样品在紫外波段没有吸收信号，必须利用外接的ELSD检测器才能检测样品

的信号。

图2. 样品在C18分离柱上的Flash制备纯化图谱

实验结果显示普通C18反相柱对物质保留较弱，这就是常用的反相模式的短板。众所周知，亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction chromatography, HILIC）采用强亲水性的极性固定相，适合于极性较大的样品的分离纯化。因此后考虑采用HILIC模式对样品进行制备纯化，如三泰科技推出的SepaFlash 氨基分离柱，其填料表面键合有极性很强的氨基基团（参见图3），可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。

图3. SepaFlash氨基柱固定相键合基团示意图

  HILIC色谱分离模式，与传统正相色谱相似，固定相比流动相具有更强的亲水性，极性物质倾向于与固定相作用，从而增加保留。然后逐渐增加流动相的极性而使样品依次洗脱。但其所用的溶剂又与反相色谱相似，采用与水互溶的极性有机溶剂 (一般为乙腈)； 而不用传统正相色谱中所用溶剂(如正己烷、三氯甲烷) 。通常以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相，其中有机部分是弱溶剂, 水溶液是强溶剂。水相比例在洗脱过程中逐步提高，因此适合于极性较大的样品的分离纯化。

利用SepaFlash氨基分离柱对样品制备纯化图谱如图4所示。样品在氨基分离柱上获得了有效的保留，三个样品分离度良好，成功对糖类化合物进行了制备纯化。

图4. 样品在氨基分离柱上的Flash制备纯化图谱

氨基柱的键合官能团氨丙基比反相色谱中常用的C18、C8等官能团更容易水解，因此当氨基柱在反相模式下使用时，其使用寿命会稍逊于普通的C18柱。需要特别注意控制所使用的流动相，流动相PH值越低或者含水比例越高造成氨基柱键合相水解的危险就越大。HILIC模式下，流动相选择时，首先确保流动相中至少含有3~5%的极性溶剂（如5%水，5%甲醇），以保证氨基柱中的硅胶始终处于被水浸润的状态；其次流动相体系中至少含有50%的有机相（一般情况下，有机相比例尽量不低于 70%）。氨基柱使用结束后，为保证其使用寿命，以95%乙腈/5%水作为氨基柱的保存溶剂。若需长期保存不用时，需将氨基柱用异丙醇保存起来。

 SepaFlash 氨基柱订购信息

三泰科技推出的SepaFlash 氨基柱系列产品具有多种规格（参见表2）。

表2. SepaFlash 氨基柱参数

（Ultra-pure irregular NH2, 40 – 63 μm, 60 Å, amino content: 1.3 mmol/g, end-capped, surface area: 500m2/g, loading capacity: 0.1-2%）

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