2021/12/13 10:10
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产品配置单:
SepaBean machine T快速液相制备色谱
型号: SepaBean machine T-经济型
产地: 江苏
品牌: 三泰
¥10万 - 20万
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SepaBean machine快速液相制备色谱
型号: SepaBean machine
产地: 江苏
品牌: 三泰
¥20万 - 30万
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方案详情:
在样品纯化过程中你是否遇到过五花八门的难点,这个问题对于做制备纯化的小孙来说有太多值得吐槽的地方,如样品极性太小正相模式不保留、样品极性太大硅胶固定相洗脱不下来、样品溶解度太差纯化过程析出或拖尾严重及洗脱不下来等情况。在分离纯化的过程中,难免会碰到溶解性比较差的物质,这类物质有时会对分离纯化造成一些负面的影响,如由于拖尾而影响分离度,甚至是直接析出导致管路堵塞,或者少量试剂不能完全溶解至澄清,而样品纯化之前一定要有解决溶解度的办法,否则带着问题上样纯化效果一定不会很理想。解决样品溶解度的问题没有固定答案,具体样品需要具体分析,本文主要和大家分享小孙在纯化过程中如何处理溶解度较差的样品。主要常用以下几种方法:
1、加助溶试剂
解决溶解度问题最根本的是要找到样品最合适的溶解试剂,但是有时能溶解样品的试剂不适应于样品的分离模式。
如某样品极性很小,乙腈易溶解,但因极性太小在反相柱中不易洗脱,正相模式下正己烷-乙酸乙酯体系不能完全溶解样品导致拖尾致使样品没有分离度。最终解决办法添加第三路管路10%乙腈,虽然乙腈和正己烷不互溶,但是添加的10%乙腈解决了部分样品的溶解度问题,最终纯化结构是能提纯到一半纯品,一半交叉,回收交叉部分按此方法可继续纯化。
2、用极性相近的试剂置换
反相纯化时除了非水反相,其他体系如甲醇-水/乙腈-水等都会使用到水,但是很多样品用有机试剂溶解后遇水会析出,这种情况下即使可以正常实验也会使峰形拖尾或导致分离度降低,甚至有的样品会直接析出结块导致仪器超压不能运行等情况。
三泰科技的应用实验人员也遇到过上述情况,样品析出情况严重,如何解决这个问题,经过试验发现可以用一种有机试剂代替水相运行即甲酰胺,甲酰胺相对极性7.3,可以与水、甲醇等互溶,可以上样时临时代替水润柱,上样后就不会有析出的情况,甲酰胺在反相体系中没有洗脱能力,极性和水较相近可以代替水运行实验,考虑到成本问题成功运行后可以再用水置换过来。
3、等度洗脱
当样品在一方流动相中有溶解度时,可以考虑在最合适的分离度的情况下等度洗脱,不需要从低比例慢慢加,减少析出的情况,案例如下:
待分离物质是一种卟啉类化合物的分离过程,该化合物溶解性稍差。通过TLC点板(图1)精确筛选流动相比例的过程中发现,当二氯甲烷的比例低于50%极易拖尾,且各组分之间没有明显的分离度,可能是由于此时二氯甲烷比例偏低,导致溶剂体系的溶解性降低,故拖尾严重;当二氯甲烷高于50%时,各组分之间有一定的分离度,且无明显拖尾现象,但Rf偏大。
图1.从左至右二氯甲烷比例依次增大,左三为50%
综合上述信息,我们决定采用等度淋洗,控制流动相恒定在正己烷:二氯甲烷=1:1。因为此时Rf仍偏大,故在分离过程中,还需要使上样量/硅胶量保持在1/100左右,而且适当降低流速,这些措施都能有效提高各组分之间的分离度。具体分离条件见下表1。
表1. 样品的制备参数设置
仪器 | SepaFlash® machine U200 | |
色谱柱 | 120g SepaFlash® 标准正相硅胶柱 | |
检测波长 | 254nm,280nm | |
上样量 | 1.2g | |
流动相 | 溶剂A:正己烷(含0.3%三乙胺) 溶剂B:二氯甲烷 | |
流速 | 20 mL/min | |
洗脱梯度 | CV | 溶剂B/% |
0 | 50 | |
45 | 50 | |
分离结果 | 各组分均得到比较好的分离 |
按照上述分离条件,最终得到六个不同的组分(图2)第六个峰位于42 CV附近,通过TLC初步鉴定(图3),均为纯的化合物。
图2. 分离的色谱图
图3.分离前后对比点板(前四个产物)
上述3种方法是三泰科技技术人员遇到的样品纯化解决方案个例,相信大家在纯化时也会遇到这种情况,欢迎大家与我们分享解决方案。
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制药/生物制药
2023/09/27
SepaBean machine快速制备液相色谱系统 应用于脂质体类化合物分离纯化应用案例
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制药/生物制药
2023/08/02