转瓶机

作者： 陈文庆 王建超 刘华杰 高飞 张韧 （北京清大天一科技有限公司 102200 ） （《中国兽药杂志》 2010.44 （ 10 ）： 37-41 ）【摘要】 采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析，比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示，与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高，生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺，适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。【关键词 】 细胞培养；生物反应器；悬浮培养；微载体细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。根据细胞是否贴壁，又分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体培养。国际上该项技术发展较快，已趋向成熟，是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。与转瓶培养技术相比，该工艺具有操作简单、产率高、容易放大等优点，本文结合口蹄疫病毒和狂犬病毒的生产，分别对细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的经济效益等进行了分析和分析。1. 全悬浮培养口蹄疫病毒与转瓶培养案例对比高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，早在1962年Capstick PB等就实现FMDV的悬浮培养。1965年Telling, R.C.等实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。目前国外（Intervet公司、Merial公司）普遍已经采用2000~5000L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗。本文就本公司自主研发的650L生物反应器和无血清培养基进行悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗与转瓶培养工艺进行比较和分析。1.1主要材料细胞株：BHK21贴壁细胞株（中国兽医药品监察所）毒 株：FMDV-O型（某兽用疫苗企业）培养基：低血清MEM培养基(产品代号MD611)、BHK21细胞无血清培养基（北京清大天一科技有限公司）血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）仪 器：5 L反应器（德国贝朗），120L和650LCLAVORUS ® 生物反应器（北京清大天一科技有限公司）1.2实验方法1.2.1转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒将复苏的BHK21细胞在T75培养瓶中使用低血清培养基（含5％牛血清）培养，连续传代扩增接种15L转瓶，37 ℃培养48小时，传代比例为1:8-1:10，按常规方法接种病毒及维持液，细胞病变90%左右收获病毒液。1.2.2反应器全悬浮无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒（1）贴壁细胞悬浮驯化培养：用BHK21细胞无血清培养基在恒温摇床或者方瓶中无血清驯化贴壁BHK21细胞，可采用直接驯化或者逐级降低血清驯化等方法，每代观察细胞数量和细胞活率，直至BHK21细胞在无血清培养基中的生长增殖速率正常，细胞活率达95%以上，并可连续稳定传代，说明细胞已适应无血清悬浮培养。（2）反应器用种子细胞扩增：采用反应器罐倒罐逐级放大技术，细胞从摇瓶→5 L反应器→120 L反应器→650 L反应器进行逐级放大培养。细胞培养方式为批培养，控制反应器各参数在正常范围：温度37.0 ℃、pH7.2~7.4、溶氧（DO）20~70%、搅拌转速50~150 r/min。（3）反应器培养口蹄疫病毒：待650 L反应器中细胞达到一定密度，提高培养pH至7.5左右，按一定比例直接接种口蹄疫病毒进行病毒维持培养，控制温度、pH、DO、搅拌转速等参数在合适范围，在线无菌间隔取样判断细胞病变情况并检测病毒毒价（LD50,TCID50），确定收获的最佳时间。1.3 细胞培养结果对比分别对低血清培养基15 L转瓶培养的贴壁BHK21细胞进行观察和细胞计数，反应器全悬浮培养的BHK21细胞取样进行数量和活率检测。培养条件和结果对比见表1。表1 转瓶培养和反应器全悬浮培养BHK21细胞对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442105_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442106_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442107_small.jpg 图1 转瓶BHK21细胞低血清培养48 hr，100X 图2 反应器全悬浮无血清培养48 hr，100X 结果显示，转瓶培养的BHK21细胞，培养48小时显微镜观察成致密单层，见图1，96小时细胞开始出现脱落死亡；反应器无血清全悬浮培养BHK21细胞48小时的细胞显微镜观察状态如图2，生长至96小时细胞密度可达5.4x106 cells/ml，活率维持在94%左右。从细胞数量比较，650L反应器培养一批的细胞数量相当于500～700个15 L转瓶培养的细胞总量。1.4 病毒培养效果对比两种不同培养工艺，细胞在满足活力要求的基础上，以同等条件分别接种FMDV病毒，取样测定病毒毒价，结果见表2。 表2 转瓶和反应器全悬浮培养BHK21细胞病毒毒价对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442112_small.jpg结果表明，无血清悬浮培养的口蹄疫病毒毒价（TCID50和LD50）检测不低于转瓶培养工艺。根据反应器低血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫完整病毒粒子（146S）检测较转瓶高10倍左右的情况，应用无血清悬浮培养工艺，杂蛋白含量更少，口蹄疫完整病毒粒子和口蹄疫疫苗质量均提高。1.5 反应器和转瓶经济效益估算对比依据培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺过程要求，从细胞密度、病毒毒价、产品效力、资源环境、劳动力等方面进行简单对比，借以一窥二者的经济效益差别（见表3）。 表3 反应器无血清悬浮培养与转瓶培养BHK21细胞经济效益对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442114_small.jpg*按照反应器无血清悬浮培养一条生产线（5L-120L-650L）、转瓶体积15 L进行对比按照目前培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒质量要求，对悬浮无血清培养工艺的产能进行预估，一条5L-120L-650L的反应器生产线年生产病毒量约为2.1亿毫升，生产疫苗量约为4.2亿毫升。2. 人狂犬病毒微载体培养与转瓶培养的对比我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一，近年报告狂犬病死亡人数均在2400人/年以上，一直位居我国各类传染病报告死亡数的前三位，根据有关国家成功控制狂犬病的经验，世界卫生组织提出倡议，到2020年消除人狂犬病。我国距此倡议目标还有大量工作要做，国内也对人用和兽用狂犬病疫苗的生产做了大量研究工作。下面就120L反应器微载体培养Vero细胞生产狂犬病毒效果与转瓶培养工艺和培养效果比较分析。2.1主要材料细胞株：Vero细胞株毒 株：aG株（细胞株和毒株均来自某人用疫苗企业）培养基：低血清199培养基（产品代号MD504）、 Vero细胞反应器培养用培养基（产品代号MD505）, 均来自北京清大天一科技有限公司仪 器：5 L反应器（德国贝朗）、120LCLAVORUS ® 生物反应器（北京清大天一科技有限公司）血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）微载体：Cytodex 1 （美国GE

很多有关产品缺陷的信息，都是“出口转内销”。我国研究者在世界上最早得出了“双酚A对男性性功能有危害”的直接证据。为何监管部门没能在国内率先行动，是什么原因导致我们的监管总是慢半拍？　　据报道，欧盟认为含双酚A奶瓶会诱发性早熟，从3月1日起，将禁止生产含化学物质双酚A（BPA）的婴儿奶瓶。实际上，这并不是欧盟刚刚作出的决定，在去年11月25日，欧盟食物链和动物健康委员会（SCFCAH）就通过了相关决定。　　卫生部官员昨日也表示，目前中国正在清理包装材料，并出台了征求意见稿。征求意见稿中规定，未来婴幼儿奶瓶不能使用双酚A。　　有关部门虽然出台了征求意见稿，但反应已稍显滞后，含有双酚A的奶瓶还在商场出售。在历经了三聚氰胺等食品安全风波之后，民众对于与食品相关的安全格外敏感，一有相关的消息，就会格外紧张。　　其实，在欧盟宣布对含双酚A的塑料奶瓶全面禁止之前，已有不少国家和地区对此类产品作了禁止性规定。2008年，加拿大第一个宣布在所有食品包装和容器（包括奶瓶）上禁用双酚A，澳大利亚也从2010年7月1日起逐渐淘汰含双酚A的婴儿奶瓶；后来美国许多州和大型零售商，包括沃尔玛在内采取了同样的步骤。　　这些国家和地区之所以对含双酚A的塑料奶瓶采取禁止行为，一个很简单的理由就是：该类产品可能会对人体有害。尽管同样还有很多研究表明，虽然双酚A有毒，但并不意味着含有双酚A的容器都对人体有毒。　　也有一些研究结果提示，塑料奶瓶等塑料制品中的双酚A可能会影响婴幼儿的成长发育，并对儿童大脑和性器官造成损伤，但是迄今未有充足证据证明婴儿或者儿童因摄取PC奶瓶释放的双酚A成分而受到伤害。还有研究表明，制造塑料容器的PC材质可能会释放有毒的双酚A，温度愈高释放愈多速度也愈快。　　总之，塑料容器是否真会释放双酚A，目前仍存在很大争议，各界说法也不一致。　　正是在双酚A科学认识上的不同看法，才导致了世界上包括中国在内的很多国家都在正常使用它。那么，针对欧盟全面禁止含有双酚A的奶瓶，我们该得出什么启示呢？　　首先，在未决定是否禁用前，应将信息告知公众。监管部门应要求奶瓶生产厂家在其奶瓶上标明其成分，将相关信息告知公众，让消费者自己来决定是否使用。　　其次，在监管过程中增加公共参与。早在去年11月份，欧盟就双酚A奶瓶的使用开展讨论，包括厂家、科学家和消费者在内的社会各界广泛参与到该决策过程中来，使得决策既增加了公众的参与，又充分引入了专家的意见。相比较之下，我国的此类决策无论是在科学讨论还是公众参与，都有所欠缺。　　此外，人们会注意到，很多有关产品缺陷的信息，都是“出口转内销”，即首先在国外遭遇禁止，然后国内监管机构才注意到该问题的严重性。　　国外的某些研究固然高于我国，但是监管部门没有充分重视学界的研究成果，没有及时调整相关标准也不无关系。尤其是双酚A事件，我国研究者在世界上最早得出了“双酚A对男性性功能有危害”的直接证据。为何监管部门不能够在国内率先行动，是什么原因导致我们的监管总是慢半拍？ 我国对食品接触材料的法律法规总是慢半拍，是监管部门问题？还是行业利益使然？

用于盛放化学试剂的瓶子，按材质分为玻璃和塑料，按大小可分为广口瓶和细口瓶，按盛放物质可以分为固体和液体试剂瓶，广口瓶盛放固体，细口瓶盛放液体。瓶口内部为磨砂设计，保持密封，防止试剂外漏。盛装试剂的玻璃瓶。有无色、棕色；广口、细口；磨口、无磨口等多种。广口瓶用于盛固体试剂，细口瓶盛液体试剂；棕色瓶用于避光的试剂，磨口塞瓶能防止试剂吸潮和浓度变化。试剂瓶不耐热。瓶口带有磨口滴管的叫滴瓶。