质谱扫描碰撞能量

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

第57届ASMS质谱年会落下了帷幕，会议为期五天。各大质谱仪器公司都非常看重此次会议，并集中展示了各自近期推出的质谱产品、解决方案以及相关软件系统。下面将对此次展出的质谱产品做一些简要介绍，以飨读者。 排名不分先后 　 赛默飞世尔科技　　赛默飞世尔科技在ASMS 2009上发布了两款新一代离子阱和轨道阱质谱仪：LTQ Velos 和 LTQ Orbitrap Velos。　　LTQ Velos™ 采用最新双压阱设计和大气压离子源(API),使离子处理和检测相互独立。此项设计允许分析中使用最优压力， 减少扫描时间的同时提高分辨率。　　LTQ Orbitrap Velos™ 将业界领先的 Orbitrap™ 质量分析仪, 新高能碰撞解离池，和双压阱技术完美结合，确保提供超高分辨率和精确质谱数据。　　 　　LTQ Velos　　LTQ Velos – 离子阱技术的根本创新　　LTQ Velos卓越的数据质量和灵敏度使它成为复杂分析物分析，如生物样品中低丰度蛋白质的确认和小分子代谢物结构鉴定的理想之选。　　在蛋白组学应用方面，速度和灵敏度方面的提升为复杂多肽混合物的分析提供更大的覆盖范围，并提高了小量样本中蛋白质鉴定的可信度。LTQ Velos的多级碎裂技术提供更为可信的序列分析和翻译后修饰(PTM)鉴定。更高速的扫描速率能将循环时间减少50%之多，并将鉴定的蛋白和肽段数量翻倍。　　在代谢组学应用方面，双压阱技术提高了离子碎裂效率，从而提供更快、更可信的结构鉴定。提高的速度和灵敏度与多级质谱能力充分结合，最大限度地提高通量的同时保持了鉴定和定量多个共洗脱化合物所需的卓越的数据质量。LTQ Velos可以升级为LTQ Orbitrap Velos，使实验室得以扩大其最初的投资，在保持灵敏度和分析速度的同时获得准确的质量和超高的分辨率的能力。　　LTQ Orbitrap Velos – 基于Orbitrap技术　　LTQ Orbitrap Velos是轨道阱质量分析仪的质量准确性和超高分辨率与LTQ Velos改善的灵敏度和分析速度的完美结合。　　 　　LTQ Orbitrap Velos　　LTQ Orbitrap Velos的高质量精确度通过降低假阳性结果从而为复杂样品中的蛋白质鉴定增加了速度和可信度。其超高分辨率能够提供完整蛋白质的分子量测定和等质量物种的深入分析，从而提供确定性的分析结果。对蛋白质组学研究人员来说，这些功能增加了序列覆盖范围和可信度，从而识别更多的蛋白质。　　LTQ Orbitrap Velos新的HCD碰撞池更加高效，提高了同位素标记肽段的定量分析功能,诸如需要应用串联质谱标记(TMT)的分析。电子转移解离 (ETD)为高度敏感的翻译后修饰(PTM)分析和从头测序生成互补性信息。 　 瓦里安公司　　瓦里安公司在ASMS 2009上展示了其全线的质谱仪器，200-MS系列气相色谱-离子阱质谱联用仪，300-MS系列系列三级四极杆气相、液相质谱，500-MS离子阱质谱仪，920-MS 三重四极杆傅立叶变换质谱仪(TQ-FTMS)。 920-MS 三重四极杆傅立叶变换质谱仪（TQ-FTMS）　　 　　920-MS　　瓦里安公司920-MS最新质谱产品，其离子源接口可以联用液相色谱或者气相色谱联用技术。920-MS以超高的分辨率(﹥1,000,000)和质量精确度(﹤0.5ppm)为蛋白组学、代谢组学、石油化学以及环境分析等领域的化学家们提供了更详细的信息。　　最新的920-MS结合了Varian 320-MS三级四极杆质谱仪和Varian FT-ICR(Ion Cyclotron Resonance)检测器技术。超导磁体包括7、9.4、 12.0Tesla以及15.0 Tesla——目前商品化的最强磁场强度的磁体，它提供了最宽的样品动态范围。既可以选用传统磁体，也可以选用零损耗(Zero boil-off)设计的磁体。磁体和离子源的多样化选择便于用户根据自身需求如灵敏度、质量精确度、动态范围和应用领域等的考虑选择不同的配置。　　920-MS三重四极杆质谱仪拥有完全独立于磁体中FT分析池的偏轴离子检测器，两种检测器使用户用一台仪器就可以获得更多的信息。除了利用FT检测器获得超高的分辨率和质量精确度外，用户还可以通过典型的三重四极杆质谱仪功能如母离子扫描、中性丢失扫描、多反应监测和定量分析获得其他数据。　　500-MS LC/MS Ion Trap　　 　　500-MS LC/MS Ion Trap　　500-MS离子阱质谱仪是在现有离子阱技术(第二代)基础上全新设计的第三代离子阱质谱仪，集中了诸如增强电荷容纳、离子三重共振扫描等专利技术，使离子阱的“低质量截止效应”和“空间电荷效应”和抗基质干扰能力差的弱点降到几乎可以忽略不计的程度，使得离子阱的定性和定量性能更加优异。500-MS离子阱质谱仪广泛应用于食品安全、药物开发、环境监测、生命科学研究和分析等领域。　　300-MS Series Triple Quadrupole Mass Spectrometers　　300-MS三重四极杆质谱主要用来提高常规实验室高通量的分析效率，它也可以通过单级四极杆质谱升级获得。一次进样可扫描或定量150多种化合物。样品引入和离子化的方法取决于常规GC/MS实验室遇到的样品类型，化学电离(CI)和电子轰击电离(EI)可用于高灵敏的检测和结构确认。　　 300-MS三重四极杆质谱　　200-MS Series GC/MS Ion Traps　　240-GC-MS/MS其专利的三重共振扫描技术，完全消除分子离子反应、谱图匹配等问题。可由单级MS升级为多级MSn(n=10)。　　220- GC-MS/MS可由单级MS升级为多级MSn(n=10)。完全可以替代单级四极杆质谱仪的应用。　　210-MS GC-MS是EI单级MS气相离子阱质谱仪，可以代替常规气相色谱多检测器系统，是实验室必备的常规分析仪器之一。 　 布鲁克.道尔顿　　在ASMS 2009上，布鲁克推出了三款高性能质谱系统。　　UltrafleXtremeTM是目前唯一采样速率达1,000Hz的MALDI-TOF/TOF质谱系统，结合最新的Smartbeam™ -II激光技术和4GHz数字转换器。在蛋白质组学研究中，质量分辨能力达40,000，质量精度达1ppm。该系统具有快速自清洁离子源，业界领先的成像软件系统，直径小到10 µ m的激光聚焦非常适合MALDI 成像。该设备的高度灵活性使LC-MALDI TOF/TOF广泛用在蛋白质组学、无标记蛋白质定量、MALDI成像、TOP-DOWN蛋白质组学技术、Edmass ™ 蛋白质测序技术、完整的蛋白质组分析和聚合物分析以及寡核苷酸的分析的方面。　　 　　MALDI-TOF/TOF质谱　　AmaZonTM离子阱质谱扫描速度可达52,000 u/s，并保持分辨率在0.58u 当与UHPLC耦合时，可以进行零延迟极性转换。该系统具备专利的双离子通道技术，灵敏度提高了一个数量级。第二代的ETD和PTR以其优雅、简单的设计为蛋白质组学研究提供了很高的灵敏度。该离子阱质谱在全扫描的模式下，50-3000 m/z的质量范围内分辨能力达20,000，其速度完全可匹配LC。其出色的全扫描质谱速度和MS / MS分析的灵敏度，使其在毒理学、食品安全、兴奋剂检测以及法医领域的快速定量方面可替代三重四极杆质谱的MRM定量方法。　　 　　amaZonTM离子阱质谱　　SolariXTM傅立叶变换质谱仪的灵敏度提高了10倍 其分辨率提高了8倍，在7 Tesla时大于1,000,000，在很宽的动态范围质量精度可达亚ppm级。其完整的工程学设计使得该仪器功能强大而且易于操作。该系统非常适合用在top-down蛋白质组学、石油组学、代谢组学、小分子药物和代谢物MALDI成像等方面。　　 　　solariXTM傅立叶变换质谱 　 安捷伦科技　　安捷伦6540 Ultra-High-Definition (UHD) Q-TOF台式质谱系统Agilent 6540 超高分辨率的精确质量四级杆－飞行时间质谱仪（Q-TOF）　　安捷伦6540 Ultra-High-Definition (UHD) Q-TOF是一款性能优异的台式Q-TOF质谱系统，它可以提供高质量的数据和卓越的分析能力，使研究人员在鉴定低分子量化合物和生物分子方面充满了信心。创新的Ion Beam Compression (IBC)和Enhanced Mirror Technology (EMT)技术提高了该质谱的精确度和分辨率，并保持台式布局。　　“对于Q-TOF观念认为‘越大越好’，Agilent的工程设计极大地提高了仪器的性能并保持了台式布局”，安捷伦全球资深LC/MS营销总监Ken Miller说，“我们的仪器已经达到了更高的准确度和分辨率，在灵敏度和动态范围方面保持着行业领先的地位。该系统可快速运行为UHPLC获取准确的MS和MS/MS数据而并不会引起分辨率的损失，而这个问题一直困扰着orbitraps。该质谱系统在蛋白质组学、代谢组学、食品和环境安全等定性分析领域具备很高的水平。”　　安捷伦7700 系列ICP-MS Agilent 7700系列ICP-MS痕量元素分析仪　　安捷伦在此次ASMS 2009上还介绍了新一代的7700系列ICP-MS痕量分析系统，7700系列在保证完整数据性方面性能优异，仪器操作简单，占地面积小。　　“ICP-MS已变成了实验室的常规设备，向测量更多元素、测更低含量物质以及处理更复杂样品方面发展 伴随着高通量、易操作等特点，对于数据的质量也提出了新的要求。” 安捷伦副总裁兼质谱部总经理Chris Toney说，“我们的目标就是满足这些要求，我们已有的用户反馈对于测试结果非常满意。”　　新型7700系列ICP-MS最明显的特点就是占地面积小，只相当73 厘米工作台空间。安捷伦的八级杆反应池技术(ORS)、特有的氦碰撞模式可以可靠有效地消除光谱干扰，在处理未知样品和复杂样品方面表现优异。7700系列配有新的第三代反应池(ORS3)，进一步提高了氦碰撞效率。　　安捷伦6430三重串联四级杆液质联用系统Agilent 6430型三重串联四级杆液相色谱质谱 　　安捷伦新型6430三重串联液质联用系统是6410的升级版本，具有很高的灵敏度，快速地监测反应离子，快速地进行极性转换。6430三重串联液质联用系统非常适合于食品检测、水质分析、蛋白质生物标记等，而且价格方面很有竞争优势。　　6430三重串联液质联用质谱系统拥有6460三重串联四级杆质谱的许多高性能特征，包括为提高离子传输效率和获得更好的灵敏度而附加的涡轮泵，这对于6410是可选择的配置，而对于6430是标准配置。新的质谱系统极性转换非常快，从正离子模式转换到负离子模式仅需30ms。在分析复杂体系方面具有极大的灵活性，可以获得更多的被分析物的离子，使分析灵敏度得到极大的提高。 　　沃特世科技　　 　　SYNAPT™ G2(QTOF)　　Waters在ASMS 2009上推出了SYNAPT™ G2质谱系统。该系统具有突出的定性定量性能、超过40,000的分辨率、达20 spectra/s采集速率、精确质量到1ppm(RMS)、动态范围达5个数量级。与Waters ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)联用可以最大限度地发挥其分析能力和速度 主要用在生物制药、代谢物鉴定、代谢组学、蛋白质组学、生物标志物的鉴定、食品和环境研究领域，SYNAPT™ G2操作直观，灵活性高。整体达到了一个全新的性能水平，Waters预计该系统将于2009年四季度上市。　　“SYNAPT G2的发布是一个重要的事件，不仅是在质谱技术上的飞跃，同时对于世界范围的研究者试图从分子层面解决一些根本问题提供了新的机遇”，Waters公司质谱业务部副总裁Brian Smith说，“我们相信SYNAPT G2将会替代通用的QTOF和静电离子阱系统，成为高端质谱分析仪器的选择。” 　 岛津公司　　岛津公司在ASMS 2009上推出了AXIMA Resonance™ MALDI质谱系统，主要用于结构分析和生物大分子测序。AXIMA Resonance在整个MS和MSn分析过程中提供高质量分辨率和准确度。该仪器具有卓越的MSn功能，独特的MALDI和QIT相结合可以使用数种不同的基质产生离子，数秒内切换正负离子化模式，在MSn实验中简单高分辨地选择前驱离子，并很好的控制碎片离子 具有极好的前驱离子选择性：从复杂混合物得到的离子或者相邻同位素可以很好的分离，分辨率大于1000(FWHM) 同时具有高灵敏度和高分辨率，样品消耗量低，灵活性高，与其他的仪器设备进行无缝对接。　　 　　AXIMA Resonance™ 　　岛津同期展示的其他产品有：　　Full Series of MALDI Mass Spectrometers (Assurance, Confidence, Performance, Resonance)　　LCMS-IT-TOF Mass Spectrometer　　LCMS-2020 Single-quad Mass Spectrometer　　CHIP-1000 Chemical Printer　　Prominence HPLC Front Ends (2D HPLC, nano LC, UFLC) for Mass Spectrometry　　GCMS-QP2010 Plus　　GPC-MALDI　　 　　从此次发布的质谱产品可以看出，QTOF 、TOF/TOF以及离子阱技术仍然是各公司开发的重点 在应用方面，高通量、高灵敏度、高分辨率以及以简化仪器操作都是各仪器公司所看重的。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics1，文章的通讯作者是密歇根大学的Brandon副教授。　　双特异性抗体(bispecific antibodies, bsAbs)是一类重要的新兴疗法，能够同时靶向两种不同的抗原，已被开发作为对某些单克隆抗体疗效有限疾病的治疗手段。尽管bsAbs具有独特的优势，但它的结构较为复杂，需要特殊的制备工艺，“knobs-into-holes”(KiH)是其中一种可以用于制备bsAbs的技术，这种技术通过将knob链CH3结构域表面的特定氨基酸突变为较大氨基酸，将hole链上的突变为较小氨基酸，从而实现“knobs-into-holes”的配对形式，提高不同轻重链在配对时的正确配对率，产生正确的bsAbs。然而，由于抗体治疗药物分子量较大，通常比传统的小分子药物表现出更大的结构复杂性和异质性，对KiH bsAb 高级结构的完整表征对定义bsAb的结构功能关系，以及确保最终治疗的稳定性、有效性和安全性都至关重要。目前已开发的分析方法有很多，但是普遍存在样品消耗量大、数据采集和解析时间较长等缺点。近年来，非变性离子迁移质谱(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)和碰撞诱导去折叠(collision-induced unfolding，CIU)逐渐被证实是用于分析单克隆抗体高级结构的有效方法，能够从存在结构异质性和杂质的几微克样品中表征单抗治疗药物的高级结构。IM可以根据气相蛋白离子的电荷和旋转平均碰撞截面(collision cross sections，CCSs)在毫秒时间尺度上对蛋白进行分离。当与质谱耦合时，可以很容易地将质荷比相同但CCS不同的离子区分开来，而CIU可以使IM-MS同步提供蛋白质结构和构象稳定性信息。CIU根据二硫键、糖基化水平、结构域交换特性等信息来区分差异。　　在这篇文章中，作者描述了定量CIU在bsAbs中的首次应用，扩展了非变性IM-MS和CIU的能力，用于稳定表征KiH bsAb及其亲本knob和hole同型二聚体单抗的高级结构。　　图1 Native、未修饰的knob(蓝色)和hole(橙色)同型二聚体，以及KiH bsAb异型二聚体(绿色)的CIU实验。(A)24+电荷态(左)及其相应重复RMSD基线(右)的平均CIU指纹图谱(n=3)。所有的指纹图谱都显示了白色虚线框所示的三个主要特征。在(B) 5 V、(C) 65 V、(D) 110 V时的标准化TWCCSN2分布。在较低的激活电位下，所有抗体均具有相似的CCS，在较高的加速电位下则存在显著差异。(E)两两的RMSD分析显示，与重复的RMSD基线(虚线)相比，抗体之间的整体高级结构差异。(F)CIU50分析说明了KiH bsAb模型的稳定性如何保持在knob和hole的同型二聚体之间。　　如图1所示，bsAb的稳定性似乎与本文研究的KiH模型的两个亲本同型二聚体单克隆抗体相关。在电压为65V时，KiH bsAb的TWCCSN2分布与亲本knob同型二聚体单抗的分布相似 而在110V时，则与亲本hole同型二聚体单抗的分布相似。并且KiH bsAb的稳定性介于两种亲本同型二聚体单抗的稳定性之间。与指纹图谱中记录的第一次CIU转换相对应的是CIU50-1值，第二次的则是CIU50-2值，从3组样本的数据分析推测，CIU50-1和CIU50-2很可能代表了KiH bsAb和mAb结构中不同结构域的局部稳定性。　　图2 knob和hole的半体CIU数据。(A)16+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，半体之间的高级结构存在显著差异。(C)CIU50分析显示，蛋白质稳定性存在显著差异。　　为了更好地展示KiH bsAb不同结构域的CIU特征，作者记录了同型二聚体单抗IM-MS光谱中16+电荷态的knob和hole半体的CIU数据。从图2A的指纹图谱可以看出，每种结构都包含4种主要的CIU特征，但是图2B的RMSD分析显示两种半体的高级结构之间存在显著差异。CIU50分析进一步表明，在观察到的两次展开过渡中，knob半体明显比hole半体更稳定。作者推测造成这种CIU主要差距的原因可能是Fab结构域的差异。　　图3 Fab和Fc片段的CIU数据。(A)13+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，knob和hole的Fab片段之间存在显著差异。(C)CIU50分析显示，不同片段之间稳定性存在显著差异。　　为了进一步将CIU特征联系到KiH bsAb的结构域当中，作者对木瓜蛋白酶消化后产生的Fab和Fc片段进行了CIU分析。从图3A可以看出，knob和hole的Fab片段都具有3种CIU特征，但是嵌合的Fc片段则具有4种CIU特征。尽管knob和hole的Fab片段具有相似的CIU指纹图谱，但是RMSD分析显示它们之间的高级结构仍然存在较大差异，并且knob的Fab片段稳定性明显高于hole的。至于Fc片段的稳定性则远高于两种Fab片段，可能的原因是重链CH3结构域的强非共价作用以及knobs-into-holes配对的影响。　　图4 去糖基化后的knob、hole同型二聚体和KiH bsAb异型二聚体24+离子(n=3)。(A)比较对照组和去糖基化抗体的RMSD分析显示，高级结构有显著差异。CIU50-1(B)和CIU50-2(C)分析显示抗体去糖基化后表现出显著的不稳定性。(D)对照组和去糖基化抗体之间的CIU50值差异图。　　先前的研究已经证明，CIU对不同水平的单抗糖基化很敏感，其中去糖基化会导致单抗高级结构的不稳定。作者利用高分辨率非变性轨道阱质谱分辨添加PNGaseF前后同型二聚体mAb和KiH bsAb糖型的变化。实验结果显示，KiH bsAb表现出高度糖异质性，包含至少12种不同的糖型。这很可能归因于组装的KiH bsAb中每个独立的knob和hole重链上存在独特的糖基化，进一步增加了其复杂性。　　总而言之，这篇文章展示了IM-MS结合CIU用于建立KiH bsAb及其亲本同型二聚体之间高级结构联系的能力。单独的CCS不足以解决此研究中抗体之间细微的高级结构差异。相比之下，CIU指纹图谱则可以分辨和区分每一个等截面的抗体。这一解释bsAb CIU细节的能力，加上对KiH bsAb稳定性的更深入理解，有可能提供支持KiH bsAb发现和发展的关键信息。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Villafuerte-Vega, R. C., Li, H. W., Slaney, T. R., Chennamsetty, N., Chen, G., Tao, L., & Ruotolo, B. T. (2023). Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics. Analytical Chemistry.