质谱测得结果理论分子量

导读随着生物医药技术的发展，越来越多的生物药陆续上市，如治疗慢性疾病的寡核苷酸药物Leqvio，“一年只需注射两针”就可以长效持久的降低血液中胆固醇含量，以及用于治疗II型糖尿病的多肽类药物Mounjaro。在寡核苷酸和多肽药物的质量控制中，分子量测定是定性表征中不可缺少的一部分，而单四极杆液质联用仪（LCMS）是测定分子量的利器。但与小分子药物相比，多肽和寡核苷酸药物极性和分子量均较大，在LCMS中带多电荷，所以分子量测定时可能会存在分子量测定范围窄、灵敏度低等问题。小身材大智慧 LCMS-2050岛津最新款单四极杆质谱仪LCMS-2050兼顾小型化和高性能，其离子源为加热型ESI/APCI（DUIS）源，使得寡核苷酸和多肽药物等分子量较大的极性化合物更容易电离，所以LCMS-2050具有分析灵敏度高，分子量测定范围广的特点。此外，岛津LabSolutions软件自带分子量解卷积功能，可以快速对多电荷质谱图进行解卷积，获得分子量相关信息。分子量测定案例分享寡核苷酸药物本方案中寡核苷酸药物为小干扰核苷酸（siRNA），是一类双链RNA分子（正义链和反义链），长度为20-25个碱基对。通过流动相的调整和质谱参数的优化，LCMS-2050（负模式）检测得到了siRNA多电荷质谱图，质荷比为600~1700。此时质谱图中无其他加和离子干扰，且高质荷比也有明显响应。通过岛津LabSolutions软件自带的多电荷解卷积功能，计算得到siRNA正义链电荷数量为4~11，分子量为6631.64 Da，反义链电荷数量为4~10，分子量为6637.66 Da，与理论值的偏差均小于0.4 Da。siRNA色谱图正义链质谱图正义链分子量解卷积结果反义链质谱图反义链分子量解卷积结果多肽药物此多肽药物为一种生长抑素，其理论分子量为1637. 72 Da。LCMS-2050（正模式）检测得到质荷比为546.76~1638.47，通过LabSolutions解卷积功能计算得到分子量为1637.45 Da，与理论值偏差为0.27 Da。多肽药物色谱图多肽药物质谱图多肽药物分子量解卷积结果结语岛津最新款单四极杆质谱仪LCMS-2050兼顾小型化与高性能，适用于多肽、寡核苷酸等化合物分子量测定，具有灵敏度高、分子量测定范围广的优势。了解更多详情，敬请下载《LCMS测定小干扰核苷酸siRNA分子量》《LCMS-2050在多肽分子量定性分析检测中的应用》本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

质谱仪器作为一种质量检测仪器，被应用到各个学科领域中，尤其是在化学化工、环境能源、医药、生命及材料科学等领域发挥着重要作用。在常规质谱分析中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场或磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来。而在这种原理下，质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。利用质谱仪器对样品的分析过程中，样品的雾化过程十分关键。目前，常用的电喷雾技术原理是由John Fenn提出的电喷雾电离（ESI）技术，这一理论也获得了2002年的诺贝尔化学奖。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...)，人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以使用软件进行解卷积得到m分布。这种分析手段对于分析分子量较小（分子量在5万以下）、简单纯净的蛋白样品还是很有效的。然而，在实际应用中对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化，很宽的质量分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。如图1所示，这种缺少电荷状态以及同位素峰的“死亡驼峰”，我们很难通过解卷积的形式进行分析。并且，对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用解卷积软件来获得分子量的分布信息。因此，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。在这种情况下，电荷检测质谱（CDMS）技术便成为了我们的“救命稻草”。电荷检测质谱（CDMS）通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而计算获得离子质量m。因此，相较于其他类型质谱，CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前，电荷检测质谱技术还没有现成的商品化仪器，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。而在今年的ASMS会议上，赛默飞公司重磅推出了直接分析质谱技术（DMT），并将其结合在了Orbitrap上，这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。直接分析质谱技术其原理是：在Orbitrap中检测来自离子沿中心电极的中心轴旋转的轴向频率，进而确定离子的m/z信息；与此同时，来自外电极上的感应电荷振幅也会被检测，从而确定离子的电荷z的信息。直接分析质谱技术模式为 Orbitrap 质量分析仪增加了电荷检测功能，能够同时测量数百个单个离子的质荷比 (m/z) 和电荷数 (z)。这使得 Orbitrap 质量分析仪可以直接计算分析物的质量，而不需要根据 m/z 去卷积。根据 m/z 去卷积的方法依赖于测量结果中已分辨的电荷状态和/或同位素分辨的信号。直接分析质谱技术模式提高了分辨率，并且扩展了动态范围，提高了可获得的质量测量结果的上限，同时由于单个离子测量的灵敏度较高，可以从浓度明显较低的样品中采集到更有价值的数据。

当我们从上游厂家买回一批聚合物样品时，测得的分子量却与厂家提供的不同，那这是怎么回事呢？在弄清楚原因之前，不妨先来一起学习下凝胶渗透色谱/体积排阻色谱（ GPC/SEC ）的基本原理和应用。GPC 色谱柱为多孔填料，当样品与填料无吸附、排斥等相互作用时，分子体积越大的组分能够穿过的孔越少，行走的路程越短，也就越早从色谱柱中洗脱出来。图为 Agilent Infinity II 多检测器 GPC 系统图为 Agilent 高温 GPC系统 PL220根据 GPC 应用的方向，通常可以归纳为以下三种：样品前处理（去除大分子基质）组分分离定量聚合物分子量/结构检测表1. GPC 三种应用方向对比使用 GPC 来测量聚合物分子量和分子量分布，除了将不同聚合度的组分分离之外，我们还需要另外两点信息：不同保留时间流出组分的浓度和分子量。浓度的信息可以通过浓度型检测器得到，如示差折光检测器和紫外检测器。各保留时间流出组分的分子量信息的得到却不是特别容易，常规 GPC 是选用一组不同分子量的窄分子量分布标准品，来对色谱柱进行标注，得到保留时间 - 分子量的曲线，再由校正曲线来计算样品的分子量。常用的标准品种类很少，如果标准品和样品的化学结构、拓扑结构不同，得到的样品分子量就不是样品的绝对分子量，而是相对于标准品的相对分子量。图为常规 GPC 分子量计算原理示意图由此看来，标准品的选择是造成计算结果差异的可能原因之一。为了解决这部分带来的差异，确认与上游产家使用相同的标准品类型。当然如果上游厂家与我们都能得到样品的准确分子量，也可以减小数据的差异，普适校正是一种方式。普适校正就是通过 Mark-Houwink 方程和 Flory 特性粘度理论，建立起分子量与分子体积的数学关系，从而建立保留时间 - 分子体积的曲线。说起来有些复杂，操作很简单，只需要在 GPC 软件输入样品和标样的两个参数 K，α 就可以了。但这种方法不适用于所有样品，比如不同支化程度的样品是无法查到其在不同溶剂/温度下的K，α。图为不同支化程度样品的合成（控制 AB2 单体加入量）还有一个更加直接得到绝对分子量的方式，就是使用静态激光光散射检测器，根据瑞利散射原理直接得到样品的绝对分子量；如果再搭配特性粘度检测器，可同时得到样品的特性粘度信息，建立 Mark-Houwink 曲线，用于判断样品的支化情况。图为不同支化程度样品通过 Agilent 激光光散射-示差-粘度三检测器联用 GPC 得到的 Mark-Houwink 曲线（蓝色、红色、绿色曲线对应样品的支化度依次增高） 除了标准品的选择以外，色谱柱的选择、校正曲线的拟合次数以及积分起终点的判断等都可能引起结果的差异。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。