色谱峰理论塔板数表示法

来源：药品质量研究对于色谱的分离，相信绝大多数的色谱工作者都能信手拈来各种分离的方式。但是对于色谱的基础理论，相信很多小伙伴都跟小编一样，在毕业的那一刻就还给老师了。那么今天，请大家跟着小编一起，重新梳理回忆一下当年校园的那些“你侬我侬”外的学习基础。 塔板理论作为色谱学中的一个重要理论，至今延用不衰，为广大色谱工作者所承认。塔板理论是1941年马丁（Martin）和辛格（Synge）建立的，它是一个半经验理论，并初步揭示了色谱分离过程。塔板理论将色谱分离过程比作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；假想色谱柱由许多块塔板组成，在每个理论塔板内的空间由流动相和固定相两部分占据。[align=center][img=,232,323]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111354557128_5738_1610895_3.jpg!w232x323.jpg[/img][/align]为简化起见，塔板理论有如下假设：(a)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(b)流动相进入色谱柱是脉动（间歇）过程，每次进入柱中的体积为一个塔板体积；(c)所有组分开始都集中在第零号塔板上，且组分沿色谱柱方向的纵向扩散可忽略；(d)分配系数在所有塔板上都为常数，与组分在塔板中浓度无关。[align=center][img=,84,281]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111355387985_2923_1610895_3.jpg!w84x281.jpg[/img][/align]根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1μg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即n[sub]s[/sub]=n[sub]m[/sub]故n[sub]m[/sub]=n[sub]s[/sub]=0.5。当一个板体积（lΔV）的流动相以脉动形式进入0号板时，就将流动相中含有n[sub]m[/sub]部分组分的流动相顶到1号板上，此时0号板固定相中n[sub]s[/sub]部分组分及1号板[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]中的n[sub]m[/sub]部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中液固两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5。液固相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积流动相以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(详细的分配过程见下表)。[align=center][img=,500,345]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111355564313_9465_1610895_3.jpg!w690x477.jpg[/img][/align]按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积流动相的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（液固两相中的总质量）见下表：[align=center][img=,690,464]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111356266653_4218_1610895_3.jpg!w690x464.jpg[/img][/align][align=center][img=,464,680]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111356437610_3828_1610895_3.jpg!w464x680.jpg[/img][/align]由塔板理论可建流出曲线方程：[align=center][img=,690,147]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111357002942_7014_1610895_3.jpg!w690x147.jpg[/img][/align]m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。 当V=Vr 时，C值最大，即：[align=center][img=,412,156]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111357126069_3254_1610895_3.jpg!w412x156.jpg[/img][/align]由流出曲线方程可推出：[align=center][img=,276,78]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111357243282_3260_1610895_3.jpg!w276x78.jpg[/img][/align]而理论塔板高度（H）即：[align=center][img=,260,156]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111357374972_2248_1610895_3.jpg!w260x156.jpg[/img][/align]从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。由于死时t0包括在t[sub]r[/sub]中，而实际的t[sub]0[/sub]不参与柱内分配，所计算的n值较大，H很小,但与实际柱效能相差甚远。所以，提出把t0扣除，采用有效理论塔板数n[sub]eff[/sub]和有效塔板高H[sub]eff[/sub]评价柱效能。[align=center][img=,432,214]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/02/201802111357524259_7355_1610895_3.jpg!w432x214.jpg[/img][/align]塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。 [b]塔板理论的特点和不足：[/b](a)当色谱柱长度一定时，塔板数 [i]n [/i]越大(塔板高度 [i]H [/i]越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(b)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(c)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数[i]K[/i]相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(d)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。

液相色谱分析重要指标之一——理论塔板数 理论塔板数是色谱分析中的一个重要参数，它来源于塔板理论。塔板理论是色谱学的基础理论，它是将色谱柱（色谱的核心部件）看作成一个分馏塔，将分离组分（被分离的样品）在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成某种平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，同时形成新的平衡，直至完全被洗脱（移动）出去。 理论塔板数是反应色谱柱性能的主要参数，是表示色谱柱对样品的分离能力或是分离效率（简称柱效），常用“N”表示。通常N值越大，柱效越高，分离能力越强，分离效果就越好。 N取决于色谱柱固定相（填料）的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、柱内径、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果色谱峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： 理论塔板数=5.54（保留时间/半高峰宽）2，也就是N=5.54（t/w1/2）2。柱效率用理论塔板数定量的表示：N=16（t/w）2。其中，t是样品保留时间（样品从进样到峰形最高点的时间），单位秒（s），w为峰宽（该样品峰在基线处的宽度），单位厘米（cm）。 不同的色谱柱在同一色谱条件下，理论塔板数大的色谱柱柱效高。N的大小和色谱柱的柱长关系密切，色谱柱越长（塔板数越多），N值越大。 N的大小主要和色谱峰中的两个因数有关，一是保留时间，二是色谱峰宽，保留时间越长N越大，色谱峰宽越窄N越大。要想提高色谱峰的分离效果，增加N值，我们只要从这两个方面做起就足够。一是尽量延长保留时间，二是尽量减小色谱峰宽。延长保留时间方法很多，比如选择更长的色谱柱，降低色谱柱温度，减小流速（这个最好不要变，因为流速减小，色谱峰宽也会变宽，检测灵敏度也会降低，这样可能会得不偿失），适当降低流动相中有机相的含量（主要针对反相色谱）等等。减小色谱峰宽的方法也有很多，比如减小进样量，减小进样器到检测池之间管路的死体积，尤其是缩短连接管路，采用超高效液相色谱，当然采用缩短（和延长保留时间的方法正好相反）保留时间的方法也能减小色谱峰宽，但这样可能对增加N并无帮助。有些方法在改变这两个因数时相互矛盾，我们在具体操作时，可以取利避弊，争取达到最佳效果。 通常我们增加N最常采用的办法就是一是选择更长的色谱柱，二是减小进样量，实际中这两种方法是非常常见的也是非常实用的。 下面我们就用几个具体的实列，简单的说明下。 这是150mm长色谱柱色谱图效果：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/07/201407272352_508091_2369266_3.jpg 这是250mm长色谱柱色谱图效果：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/07/201407272352_508092_2369266_3.jpg 这是20ul进样量色谱图效果：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/07/201407272352_508094_2369266_3.jpg 这是10ul进样量色谱图效果：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/07/201407272352_508093_2369266_3.jpg 增加色谱柱长度和减小进样量对于增加理论塔板数效果还是不错的。对于调节其它色谱条件来改变理论塔板数过程比较复杂，结果可能存在很多不确定性，做起来难度较大，在这我暂不做比较。 另外如果色谱柱的柱效下降了，N值降低到了很低时，我们一般会选择换一根柱效高一些的能满足实验要求的色谱柱。这也是最简单，最实用的方法。但为了减少实验成本，我们不妨试试对色谱柱采用一些再生的方法，如果还不行，那也没遗憾了。 反相色谱柱分别用甲醇:水=10:90,纯甲醇（色谱纯）,异丙醇（色谱纯）,二氯甲烷（色谱纯）等溶剂作为流动相,依次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于30倍色谱柱体积。然后再以相反的次序以不少于30倍色谱柱体积冲洗。 正相色谱柱分别用正己烷（色谱纯）,异丙醇（色谱纯）,二氯甲烷（色谱纯）,甲醇（色谱