靶基因序列分析鉴定细菌和真菌的解释标准

2013.8.21，FDA批准美国第一个质谱仪检测系统用于自动识别已知能导致人体严重疾病的细菌和酵母的上市。该质谱仪系统VITEK MS能鉴定出193不同微生物，可在一系列自动化测试过程中进行192种不同的测试，而且每个测试只需要大约一分钟。　　谱仪系统VITEK MS可以鉴别诸如念珠菌、隐球菌和马拉色氏霉菌属组的酵母茵和葡萄球菌科、链球菌科、肠杆菌科、假单胞菌科和类杆属组的细菌，这些酵母茵和细菌跟皮肤感染、肺炎、脑膜炎和血液感染有关。HIV或AIDS、癌症治疗或器官移植后的抗排斥治疗损害或削弱免疫系统的患者特别容易受到这些细菌感染。　　VITEK MS采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术,该技术利用激光打破酵母和细菌标本成小颗粒,形成一个独特的微生物模型。VITEK MS在检测系统数据库自动将这些微生物模型与193种已知的酵母和细菌进行比对，从而鉴别微生物。　　此与其他要求大量微生物繁殖来检测的鉴别方法相比,质谱分析方法只需要少量的酵母或细菌繁殖,所以只要微生物生长到可视程度后就可以马上开始检测，通常在在18到24小时内。传统的方法需要五天才能得出相同的鉴别结果。　　FDA通过新型分类程序审查了VITEK MS,这是对一些新型低中度风险且不完全等同于已知合法市售的医疗设备的调控途径。　　VITEK MS再临床上用于鉴别由人体标本培养得到的微生物，它与联合其它临床和实验室发现相互结合，从而辅助诊断细菌和真菌感染。　　VITEK MS的制造商为北卡罗来纳州达勒姆的生物梅里埃公司。

摘要：微生物是地球上最古老且延续至今的生命形式。它们种类繁多、功能多样、分布极广、数量庞大，扮演着生产者、消费者和分解者的角色，参与近40亿年的地球演化，并且还在持续影响地球的物质元素循环和气候环境变迁等。开展现代环境中微生物多样性和地质记录中微生物化石综合研究，是理解微生物参与地球和生命演化过程和机制的关键所在。尽管微生物的研究已有三百多年的历史，然而目前成功分离培养的微生物仅占0.1%-1.0%，自然界中仍有大量不可培养微生物资源有待挖掘和开发利用。近日，中国科学院地质与地球物理研究所李金华研究员与潘永信院士生物地磁学团队联合法国巴黎第六大学、澳大利亚国立大学等国内外多个单位科研人员，将微生物分子生态学与电子显微学技术相结合，在单细胞水平上，实现了环境样品中脱硫菌门趋磁细菌的特异性鉴定和生物矿化研究。针对环境中大量的未培养趋磁细菌，该项研究还提出了单细胞鉴定和综合研究技术路线图，为地质微生物的种类鉴定及生物地球化学关联研究提供了新思路。本研究提出的环境趋磁细菌单细胞鉴定和综合研究技术路线图：第①步：趋磁细菌分离或收集（A-E）。A.野外采集含趋磁细菌的沉积物或水体样品。B.实验室建立有氧-无氧过渡区(OATZ)微环境，富集培养环境趋磁细菌。C.通过过滤或其他非磁性方法从分层水柱或沉积物中浓缩细菌(包括趋磁细菌)。D.单细胞显微操作分选目标趋磁细菌细胞。E.利用各种磁分离装置收集活的趋磁细菌细胞。第②步：单细胞水平细菌种类和磁小体结构关联鉴定（F-I）。F.利用通用或类群特异性引物扩增趋磁细菌细胞的16S rRNA基因测序。G.基于目标16S rRNA基因序列设计类群/物种特异性寡核苷酸探针。H.利用荧光标记的类群/物种特异性探针对目标趋磁细菌细胞进行荧光原位杂交实验。I.在单细胞水平上对经荧光标记的细胞开展“荧光显微镜—扫描/透射电镜”或“荧光显微镜—聚焦离子束—扫描电镜”关联分析。第③-⑤步：趋磁细菌单细胞水平综合显微学关联研究（J-L）。J.同步辐射扫描透射X-射线显微镜对趋磁细菌细胞开展化学组成和磁学性质分析（纳米尺度）。K.综合透射电镜对趋磁细菌和磁小体进行结构、形貌、磁性和化学成分分析（原子尺度）。L.纳米二次离子质谱对趋磁细菌细胞进行化学元素和同位素分析（纳米尺度）。 　　一、硫酸盐还原趋磁细菌趋磁细菌是经典的地磁微生物和地质微生物功能群，它们广泛分布于各种水体环境中，在细胞内合成膜包被的纳米磁铁矿（Fe3O4）或（Fe3S4）晶体颗粒，也叫磁小体。趋磁细菌可以感知地磁场，并在地质记录中形成磁小体化石，因而是生物矿化、生物地磁学和古地磁学研究的理想模式系统。趋磁细菌种类和形貌极其多样，但对生长条件要求极其苛刻，因而实验室纯培养非常困难。建立不依赖纯培养的综合研究体系，在单细胞水平上实现趋磁细菌的生物学、矿物学和磁学综合研究，是全面且深入认识趋磁细菌多样性和磁小体生物矿化机制的关键所在。在众多类群中，隶属于脱硫菌门的硫酸盐还原趋磁细菌尤为独特。已知的变形菌门、硝化螺菌门和暂定杂食菌门趋磁细菌只能合成磁铁矿成分的磁小体，且都是单细胞原核生物。与它们不同，脱硫菌门趋磁细菌中，除了能合成磁铁矿型磁小体，也能合成胶黄铁矿型磁小体，除了有单细胞型，还有多细胞型。从生态学上讲，脱硫菌门微生物主要以硫酸盐为电子最终受体，进行厌氧呼吸，因此在自然界的硫-碳循环中起关键作用。二、西安未央湖硫酸盐还原趋磁细菌的发现和鉴定自上世纪八十年代以来，国内外多个研究团队陆续在海洋和盐碱湖等环境中发现并鉴定了多种硫酸盐还原趋磁细菌。然而，对淡水环境中的硫酸盐还原细菌鲜有报道和缺乏深入研究。2013年，中国科学院地质与地球物理研究所生物地磁学研究团队在西安未央湖和护城河中，通过16S rRNA基因序列检测和透射电镜观测，首次在淡水环境中发现了多种硫酸盐还原趋磁细菌(Wang et al., 2013 陈海涛等，2013)。随后，研究团队通过建立的“荧光显微镜-扫描电镜”联用技术(Li et al., 2017)，从西安未央湖中鉴定了一株新的淡水硫酸盐还原趋磁杆菌WYHR-1，在细胞内合成“子弹头形”磁铁矿晶体颗粒，沿[001]方向拉长，具有典型的“多阶段晶体生长”模式，在细胞内组装成2-3条紧密排列的磁小体链束结构 (Li et al., 2019, 2020)。然而，由于丰度低，且与其它门类趋磁细菌混合存在，其它种类硫酸盐还原趋磁细菌的鉴定和生物矿化研究并未成功。在本研究中，研究团队设计了特异性上游引物390F，与下游引物1492R配合使用，特异性地检测环境样品中硫酸盐还原趋磁细菌。实验结果表明，利用细菌通用引物对27F/1492R对环境趋磁细菌样品的16S rRNA基因序列进行扩增，只能得到相对丰度高的α-变形菌纲趋磁螺旋菌WYHS-1的基因序列。然而，利用390F/1492R引物对，对同一个环境趋磁细菌样品的16S rRNA基因序列进行扩增，成功地获得了三条新的硫酸盐还原趋磁细菌16S rRNA基因序列，分别命名为菌株WYHR-2，WYHR-3和WYHR-4（图1）。生物信息学分析证实，尽管390F/1492R引物对，对脱硫菌门微生物的覆盖度低于27F/1492R引物对（前者20.6%，后者为32.2%），然而对其它细菌门类的覆盖度仅有0.5%，远远低于27F/1492R的26.0%，因此可以作为类群特异性引物对，从环境样品中特异性地检测脱硫菌门细菌。图1 未央湖淡水硫酸盐还原趋磁细菌WYHR-2、WYHR-3和WYHR-4的系统发育树他们进一步采用三种不同策略，在单细胞水平上分别对这三种新的趋磁细菌开展生物学种类与磁小体结构的关联鉴定和研究。（1）荧光—扫描电镜联用（FISH-SEM）鉴定WYHR-2（图2）。结果显示，菌株WYHR-2为平均长度为2.9±0.6μm，平均宽度为1.5±0.3μm (n=29)的杆状细胞，合成58±16个平均长度为77.9±22.3nm，平均宽度为31.4±5.8nm (n=681 共分析29个细胞)的排列成一条链束状结构的直子弹头形磁铁矿成分的磁小体。（2）荧光—透射电镜联用（FISH-TEM）鉴定WYHR-3（图3）。结果显示，WYHR-3除了合成 33±13个平均长度为71.0±18.7 nm，平均宽度为30.3±4.9nm (n=846 共分析31个细胞)的直子弹头形磁铁矿成分的磁小体外，还合成18±11个平均长度53.7±13.1nm，平均宽度44.0±9.7nm的立方体或棱柱形胶黄铁矿成分的磁小体。（3）荧光—聚焦离子束-扫描电镜（FISH-FIB-SEM）鉴定WYHR-4（图4）。结果显示，WYHR-4也能在细胞内同时合成磁铁矿型和胶黄铁矿型磁小体。图2 趋磁细菌WYHR-2的FISH-SEM关联分析图3 趋磁细菌WYHR-3的FISH-TEM关联分析。使用TEM是因为，WYHR-3细胞相对较大较厚， SEM不能获得相对清晰的磁小体图像图4 趋磁细菌WYHR-4的FISH-FIB-SEM关联分析。使用FIB-SEM是因为，WYHR-4细胞相对较大较厚，单纯的SEM并不能获得相对清晰的磁小体图像，同时由于WYHR-4丰度太低，并不适合FISH-TEM关联分析。因此，在本研究中采用FISH-SEM将目标细菌共定位后，采用聚焦离子束技术（FIB）将目标细菌逐层切开，然后使用SEM对细胞内的磁小体进行形貌和成分分析　　三、硫酸盐还原趋磁细菌磁小体晶型和矿化机制完成了三株新的未培养硫酸盐还原趋磁细菌的种类鉴定后，他们进一步采用先进的透射电镜技术对其磁小体晶型和矿化机制开展研究（图5-图6），并与前人以及他们前期的研究结果进行对比。结果表明：（1）脱硫菌门趋磁细菌合成的磁铁矿型磁小体，通常不弯曲，颗粒多沿[001]拉长，底端可保留一个大且平整的{001}面（如WYHR-1和WYHR-2）。然而，硝化螺菌门趋磁细菌合成的磁铁矿型磁小体，通常为弯曲形状，颗粒底端多保留为一个大且平整的{111}面，最终沿[001]拉长。这表明，磁小体的形状与趋磁细菌门类相关，地质记录中直的和弯曲形子弹头形磁小体化石可以用来指示上述两类趋磁细菌及其古环境。（2）与磁铁矿磁小体的结晶度高且通常至少保留一个可明显识别的晶面相比，胶黄铁矿磁小体的结晶度相对较差，形状多变，颗粒外围晶面欠发育且难识别。与棱柱形磁铁矿磁小体（变形菌门趋磁细菌合成）多沿磁铁矿晶体的[111]晶面拉长不同，棱柱形胶黄铁矿磁小体沿胶黄铁矿的晶体[001]方向拉长，其生长机制和磁学性质值得进一步深入研究。图5 趋磁细菌WYHR-2及其磁小体的形貌、尺寸和链束结构特征图6 趋磁细菌WYHR-3的磁铁矿（A-C）和胶黄铁矿（D-F）磁小体的形貌和晶型研究成果发表于国际学术期刊Environmental Microbiology（李金华*, 刘沛余, Menguy Nicolas，Benzerara Karim，白金伶，赵翔，Leroy Eric，张朝群，张衡，刘嘉玮，张荣荣，朱珂磊，Roberts Andrew，潘永信. Identification of sulfate-reducing magnetotactic bacteria via a group-specific 16S rDNA primer and correlative fluorescence and electron microscopy: Strategy for culture-independent study[J]. Environmental Microbiology, 2022. DOI: 10.1111/1462-2920.16109）。研究受中国国家自然科学基金重点国际（地区）合作研究项(41920104009)、国家自然科学基金重大项目课题（41890843）和国家自然科学基金创新研究群体项目（41621004）资助。

p style="text-indent: 2em text-align: justify "细菌已经进化出生活在地球上的适应性。但与可以保存为化石的植物和动物不同，细菌几乎没有遗传进化的物理证据，这使得科学家很难准确确定不同细菌群体的进化时间。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "麻省理工学院的科学家们已经设计出一种可靠的方法来确定某些细菌群何时出现在进化历史中。该技术可用于识别细菌进化过程中何时发生重大变化，并揭示导致这些变化的原始环境的细节。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "1月28日在BMC进化生物学杂志上的一篇论文提到，研究人员报告使用该技术确定了，在古生代时期，大约3.5亿至4.5亿年前，几种主要的土壤细菌群从真菌中获得了一种特定的基因。这使得它们能够分解几丁质，并利用其产品生长。几丁质是一种在真菌的细胞壁和节肢动物的外骨骼中发现的纤维物质。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "这种细菌的进化适应可能是由环境的重大转变所驱动的。大约在同一时间，早期蜘蛛，昆虫和蜈蚣等节肢动物正从海洋移动到陆地上。随着这些陆生节肢动物的传播和多样化，它们留下几丁质，创造了更加丰富的土壤环境，并为细菌提供了新的机会，特别是那些获得几丁质酶基因的细菌。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "麻省理工学院地球，大气和行星科学系的Cecil和IdaGreen地球生物学助理教授GregoryFournier说：“在此之前，地球上应该有土壤，但它可能看起来像南极洲的干燥山谷。动物生活在土壤中之后，为微生物提供了利用优势和多样化的新机会。”/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "Fournier说，通过追踪细菌中的几丁质酶等某些基因，科学家们可以对动物的早期历史及其生活环境有所了解。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“微生物在他们的基因组中包含动物生命的未知历史，我们可以用它来填补我们不仅对微生物，乃至对动物早期历史认知的空白，”Fournier说。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "该论文的作者包括主要作者DanielleGruen博士，现在是美国国立卫生研究院的博士后，以及前博士后JoannaWolfe，现在是哈佛大学的研究科学家。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "缺少化石/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "在没有化石记录的情况下，科学家们利用其他技术来研究细菌的“生命之树”，遗传关系图，显示出许多分支和分裂，因为细菌随着时间的推移已经演变成数十万种。科学家通过分析和比较现有细菌的基因序列建立了这个遗传关系图。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "使用“分子钟”方法，他们可以估计某些基因突变可能发生的速率，并计算两个物种可能发生分化的时间。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“但这只能告诉你相对时间，因为这些估计值存在很大的不确定性，”Fournier说。“我们必须以某种方式将这棵树锚定在地质记录上，是绝对时间。”/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "该团队发现他们可以使用来自完全不同的生物体的化石来锚定某些细菌群进化的时间。虽然在绝大多数情况下，基因通过世代传承，从父母到后代。但每隔一段时间，一个基因就可以通过病毒或通过环境从一个生物体跳到另一个生物体，这个过程称为水平基因转移。因此，相同的基因序列可以出现在两种生物中，否则它们将具有完全不同的遗传历史。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "Fournier和他的同事推断，如果他们能够识别细菌和完全不同的生物之间的共同基因，比如一个具有明确化石记录的生物，他们可能能够将细菌的进化固定到这个基因从化石的有机体转移到细菌的时间。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "分裂的树木/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "他们查看了数千种生物的基因组序列，并鉴定了一种基因，几丁质酶，它出现在几个主要细菌群体以及大多数真菌种类中，这些真菌具有完善的化石记录。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "紧接着，他们利用几丁质酶基因产生所有不同物种的遗传关系图，推算出显示基于该基因组突变的物种之间的关系。接下来，他们采用分子钟方法确定每种含有几丁质酶的细菌从其各自祖先分支的相对时间。他们对真菌重复了同样的过程。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "研究人员将真菌中的几丁质酶追踪到它最初出现在细菌中时与该基因最相似的点，并推断当真菌将基因转移到细菌时就会如此。然后，他们使用真菌的化石记录来确定转移可能发生的时间。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "他们发现，真菌将该基因转移到几组细菌中，含有几丁质酶基因的三大类土壤细菌在34.5亿至4.5亿年前就已经多样化了。微生物多样性的快速爆发可能是对陆地动物的类似多样化的反应，特别是产生几丁质的节肢动物。这种情况发生的时期，也正如化石记录显示的那样。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“这个结果支持上面提出的想法，一旦进入新的环境微生物群体就会尽快获得能在该环境下的基因，”Fournier指出。“原则上，这种方法可以用于更多的微生物群体，转移其他物种使用其他资源的基因。”/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "Fournier现在正在开发一种自动化管道，用于从大量基因数据中检测细菌和其他生物之间有用的基因转移。例如，他正在研究负责分解胶原蛋白的微生物基因，胶原蛋白是一种仅在动物身上产生的化合物，存在于柔软的身体组织中。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“如果我们找到微生物中摄取软体组织的群体，那么我们就可以重建软体组织早期的未知历史，这在化石记录中所缺失的一部分，”Fournier说。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "这项研究部分得到了美国国家科学基金会和西蒙斯基金会的支持。/ppbr style="text-indent: 2em text-align: left "//p