食品中草甘膦草铵磷氨甲基磷酸残留检测

【生活中的仪器分析】样 品：蔬菜、水果、茶叶、茶粉等食品检测项目：草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸参考标准：SN/T 1923-2007检测仪器：a.WATERS液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源（可用其他品牌作用等效的高效液相色谱质谱仪替代）b.Biotagevacmaster固相萃取仪c.IPRE Qclean PMG草甘膦专用固相萃取柱d.BiotageTurbovap LV 快速浓缩仪e.IKA MS3 涡旋混匀器g.TOMY-MX307离心机g.昆山超声波清洗器实验过程：1.提取及预处理称取2－5g（精确到0.001g）试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入100μL内标液，加入20.0 mL水超声提取30min，于10000 r/min离心5min，取1.0 mL上清液于2mL子弹头离心管中，加入100μL酸度调节剂（注A），涡旋混匀，15000r/min离心5 min，待净化。注A：酸度调节剂配制方法：纯水+色谱纯甲醇+盐酸=160＋40＋13.4（V/V/V）2.固相萃取净化І将PMG－І柱（蓝柱）用2mL甲醇和2 mL 0.5%甲酸淋洗活化并自然滴干，将加入酸度调节剂处理的提取液（2）转移到小柱上，用5mL刻度试管收集流出液（1-2滴/秒），用1.0mL 0.5%甲酸洗柱并真空抽干，合并流出液，用移液枪吸取50%NaOH调pH7-9（用1－14pH试纸，根据样品不同约20－50μL），加水定容到3 mL刻度，混匀，待衍生。3.衍生步骤准确吸取600 μL净化液（3）于2mL子弹头离心管中，加入200 μL 5%硼砂溶液，边涡旋，边加入200 μL 25g/L FMOC-Cl乙腈溶液（注B），放置10min，加入50 μL甲酸，涡旋混匀，15000 r/min离心5min，吸取上清液准备过PMG－ІІ柱。注B：25 g/L FMOC-Cl乙腈溶液配制方法：称取0.25 gFMOC-Cl，溶解于10 mL色谱纯乙腈中。4.固相萃取净化ІІ 将PMG－ІІ柱（红柱）用2 mL甲醇和2 mL 0.5%甲酸淋洗并自然滴干，将上清液过PMG－ІІ柱，用3 mL水淋洗小柱，真空抽干5－10 min，再加入2 mL正己烷淋洗小柱，滴干后真空抽干5 min，最后用5 mL 5%氨水/甲醇洗脱小柱（1-2 mL/min）并用5 mL刻度试管收集流出液，45℃，氮气吹至近干，用20%乙腈定容1.0 mL，涡旋混匀，过0.2 μm PTFE膜后上机测试。5.测定5.1色谱条件a.色谱柱：Waters BEH-C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；b.流动相：5mmol/L乙酸铵:乙腈梯度洗脱，梯度表见表1； 表1 流动相及梯度 时间（min）流速（mL/min）5mmol/L乙酸铵（%）乙腈（%）00.3901020.362384.40.362384.50.35956.50.35956.60.390109.00.39010c.检测器：串联四极杆质谱仪；d.柱温：35℃；e.进样量：10 μL。5.2质谱分析条件a）电离源：电喷雾正离子模式；b）毛细管电压：3.50KV；c）源温度：120℃；d）脱溶剂气温度：400℃；e）脱溶剂气流量：700L/h；f）碰撞室压力：2.7í10-3mbar；g）特征离子及参数见表2。 表 2 草甘膦和氨甲基膦酸的主要特征离子 化合物保留时间（min）母离子+（m/z）锥孔电压（V）子离子（m/z）碰撞能量（eV）草甘膦1.32392.215*88.02515214.01

关于”新版GB 2763 食品安全国家标准 规定茶叶中限量农残草甘膦和草铵膦项目“的检测研究 一、研究意义及现状 随着新版GB 2763 食品安全国家标准的不断更新及发布实施，草甘膦和草铵膦已被明确列为茶叶中农药残留强检(必检)项目，草甘膦在茶叶中的限量为1mg/kg，草铵膦在茶叶中的限量为0.5mg/kg。同时，草甘膦和草铵膦也成为中国茶叶出口国外的检测项目(来源于中华人民共和国商务部)，且已成为越来越严的限量指标。 文献(2013年农药行业预测和草甘膦市场机遇分析，杨益军，农药市场信息，2013.03)报道，除草剂草甘膦因其高效、广谱、低毒等特性使其被广泛应用，未来需求量也将大幅增加。但草甘膦的使用容易使植物产生抗性(IARC国际研究机构发布报告称草甘膦很可能对人类致癌)，而草铵膦可克服该缺陷，现已有学者(草铵膦、百草枯、草甘膦对非耕地杂草的防效比较，凌进，农药，2014年第53卷第8期，613-615)对草铵膦和草甘膦的除草性能进行了研究，确证了草铵膦代替草甘膦的可行性。 因草甘膦和草铵膦为广谱除草剂，被广泛应用于农业、林业及园艺的栽培。我国作为农业大国，其茶叶产量世界第一、出口量世界第二，草甘膦和草铵膦的生产和使用量都位居世界前列(草甘膦 草铵膦及其代谢产物的检测方法，李小娟、周信康、孟品佳，公共安全中的化学问题研究进展)。同时，我单位对西南茶叶原料主产区进行了初步调研，进一步确认茶农使用草甘膦和草铵膦农药的现状。 随着草甘膦和草铵膦除草剂使用量的日益增大，使其常被发现存在于环境水样、土壤及植物中，这样长期积累会引起环境污染，从而对人类健康造成严重威胁。草甘膦和草铵膦结构类似，且均含有膦酸基、羟基、氨基，是极强的两性化合物，易溶于水，难挥发。鉴于草甘膦和草铵膦特殊的物化性质和茶叶基质自身的复杂性，无论国内外，茶叶中草甘膦和草铵膦同时检测的标准还未见发布。 目前，可用于检测草甘膦和草铵膦农药残留量的主要方法有液相色谱法，柱前衍生后气相色谱法、气相色谱-质谱法及液相色谱-质谱/质谱法。 快速发展起来的超高效液相色谱-质谱联用技术，具有检测灵敏度高、适用范围广、分析速度快和能有效排除复杂基质产生的干扰等优点，当今已成为检测型实验室检测农残的首选。然而，若采用液质质直接测定草甘膦和草铵膦，则仪器响应较低，无法满足茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量检测的要求。 近两年来，已有研究文献陆续发表，用柱前衍生-液相色谱串联质谱法检测。笔者结合其文献研究结果，对茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量的检测方法系统地进行研究，采用9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)作为常用衍生剂，在硼酸盐缓冲盐溶液的条件下，能与草甘膦和草铵膦的提取液发生衍生反应，形成衍生产物，衍生产物注入UPLC进行色谱洗脱分离，采用串联质谱探测响应信号，外标法直接快速定量茶叶中的草甘膦和草铵膦的含量。二、液质质检测分析原理 质谱原理是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。液质联用是将色谱的分离能力与质谱强大的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，简化样品的前处理流程，使样品分析更简便。主要针对不挥发性、极性、热不稳定、大分子量等化合物的分析测定。液质联用检测技术灵敏度高，且串联质谱(三重四级杆)定性准确，可有效杜绝微量甚至痕量物质分析时的假阳性现象，常用于目标物质的痕量分析。 采用柱前衍生-液相色谱串联质谱法检测茶叶中的草甘膦和草铵膦有以下优势： 1)、灵敏度高、线性好、检出限低（可达ng/mL级及其以下）； 2)、定量结果准确、稳定、重复性好； 3)、实验操作简单、步骤少、耗时短、分析速度快、检测效率高； 4)、实验试剂无污染、无毒、安全； 5)、有效减弱基质对目标物检测的影响。三、茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量检测的前处理试验 茶叶经GB/T8303磨碎、过筛制得待测茶样(发酵茶应先低温去除水分，使样品易于磨碎)； 准确称取已磨碎处理过的茶样1g(精确至0.001g)置于80mL具盖离心管中，加入10mL水，涡旋混匀静置，加入2mL二氯甲烷，混匀，超声提取或回旋振荡10min，低速离心机4500r/min离心5min，取上清液，制得提取上清液； 注意：若茶样为新采摘的鲜叶，则称取约5g鲜叶于研钵中，加入30mL水，研磨约10min，将其转入离心管中，用10mL水洗涤研钵后转移至离心管，重复洗涤一次，再次加入10mL二氯甲烷于离心管，均质至混匀，4500r/min离心10min，取上清液，制得提取上清液； 将提取上清液用净化柱CAX、C18，以及活性炭小柱等进行比对试验，确定以C18小柱净化提取液，制得提取净化液； 通过缓冲液浓度、衍生液浓度、衍生液用量、缓冲液用量、净化液用量，衍生时间等条件试验，得出最优衍生试验参数为缓冲液浓度为50g/L，衍生液浓度20g/L，衍生液用量:缓冲液用量:净化液用量的体积比为1:1:1，衍生时间为约3h，衍生液过0.22μm的有机滤膜后进样。四、茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量检测的衍生机理 茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量的衍生机理为：在硼酸钠缓冲盐溶液条件下，草甘膦（分子结构如图1所示）和草铵膦（分子结构如图2所示）中R-NH-R’的-H被FMOC-Cl（分子结构如图3所示）中的FMOC-取代，生成 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2015070414494663_01_0_3.png，得到衍生目标产物草甘膦衍生物和草铵膦衍生物。 其中，草甘膦分子结构图，见图1；草铵膦分子结构图，见图2；9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)分子结构图，见图3；草甘膦和草铵膦与9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)的衍生机理图，见图4。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2015070414424276_01_0_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2015070414430242_01_0_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2015070414432007_01_2275853_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507061123_553629_2275853_3.png五、茶叶中草甘膦、草铵膦农残衍生物在质谱中的裂解机理1、茶叶中草甘膦农残衍生物在质谱中的裂解机理 通过对草甘膦衍生物在串联质谱中的裂解机理进行系统的分析研究，可探索出草甘膦衍生物的裂解机理为：首先草甘膦衍生物裂解为离