化学交联

近日，大连化学物理研究所生物技术研究部生物分子高效分离与表征研究组(1810组)赵群研究员和张丽华研究员等人与中国科学院精密测量科学技术创新研究院龚洲副研究员合作，提出了利用原位化学交联—质谱技术(in vivo XL-MS)，解码细胞中蛋白质动态结构的策略。该策略将AlphaFold2的结构作为先验信息，结合in vivo XL-MS数据与多种结构计算方法评估结构与交联信息的匹配度，重构了细胞内多种蛋白质，尤其是多结构域蛋白质和固有无序蛋白质(intrinsically disordered protein，IDP)的原位动态结构。为深入研究蛋白质在细胞微环境中发挥功能的分子机制提供技术支撑。活细胞内蛋白质的原位动态结构对于揭示其生物学功能至关重要。随着深度学习算法助力蛋白质结构预测的发展迭代，AlphaFold2实现了对蛋白质结构的全面预测，然而该方法对柔性区域的结构预测仍面临挑战。近年来，in vivo XL-MS以高通量、高灵敏，且对蛋白质纯度要求低等优势，在解析活细胞内蛋白质的原位动态结构方面展示出重要潜力。张丽华团队一直致力于in vivo XL-MS新技术研究，实现了蛋白质原位构象和相互作用的规模化解析(Anal. Chem.，2020；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2023；Angew. Chem. Int. Ed.，2023；Nat. Commun.，2023)。 　　本工作中，针对多结构域蛋白质，研究团队提出了将结构域作为整体，利用结构域间的XL-MS数据对细胞内蛋白质动态结构建模，实现了三种多结构域蛋白质——钙调蛋白、hnRNP A1和hnRNP D0在细胞内的动态结构表征。此外，针对IDP，研究团队提出了两种互补的结构表征策略：一是将XL-MS信息直接转换为距离约束用于IDP的结构计算，二是首先使用全原子分子动力学模拟进行无偏采样，然后基于XL-MS数据对采样结构进行评估和筛选。利用这两种策略，研究团队解码了高迁移率组蛋白HMG-I/Y和HMG-17在细胞内的动态系综构象。 　　上述成果以“Decoding Protein Dynamics in Cells Using Chemical Cross-Linking and Hierarchical Analysis”为题，于近日发表在《德国应用化学》(Angewandte Chemie International Edition)。该工作的第一作者是1810组博士研究生张蓓蓉。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院青促会等项目的资助。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章，Accurate and Automated High-Coverage Identification of Chemically Cross-Linked Peptides with MaxLynx，该文章的通讯作者是德国马普所的 Jürgen Cox 教授。交联质谱 (XL-MS) 能够提供有关蛋白质三维 (3D) 结构及蛋白质间相互作用 (PPIs) 的丰富信息。本文介绍了 MaxLynx ，一种集成到 MaxQuant 环境中的，用于 XL-MS 的计算蛋白质组学工作流程，它同时适用于质谱不可断裂和质谱可断裂的交联剂。此前，已经推广了 Andromeda 肽段数据库搜索引擎[1]，以有效地进行蛋白质组学鉴定。在此基础上，对于不可断裂的交联肽，本文应用了一种新的双肽 Andromeda 评分，这是计算效率高的 N 平方搜索引擎的基础；对于质谱可断裂的交联剂，MaxLynx将标志峰得分与碎裂产物上的传统 Andromeda 得分相结合。此外，文章通过优化 MaxQuant 3D 峰值检测，以更加准确地鉴定交联产物。在合成肽的基准数据集上，MaxLynx在以上两种类型的交联剂上的数据和黑腹果蝇细胞断裂物的交联蛋白质组数据集上均优于所有其他测试软件。该工作流程还支持离子淌度增强的质谱数据。MaxLynx可在https://www.maxquant.org/.上免费获得。XL-MS 肽段鉴定算法可以根据其支持的交联剂的类型进行细分，如质谱可断裂 (MS-cleavable) 交联剂和质谱不可断裂 (noncleavable) 交联剂的检索算法。质谱不可断裂的交联剂在质谱分析期间保持了它的完整性，而质谱可断裂的交联剂由于其不稳定键而容易发生断裂。由于 N 平方问题[2,3]，质谱不可断裂的交联剂通常应用于较小的蛋白质或蛋白质复合物，而质谱可断裂的交联剂可以实现在整个蛋白质组范围内 XL-MS 的应用。本文使用了由质谱不可断裂的交联剂和质谱可断裂的交联剂获得的交联合成肽数据集评估了MaxLynx，并将其性能与市面上的其他几个软件进行了比较。结果显示，在 1% 的错误发现率 (FDR) 下，MaxLynx 在质谱不可断裂的交联剂和质谱可断裂的交联剂数据集上的表现都优于其他软件。此外，文章还进行了一项复杂的全蛋白质组研究，并将其与 MeroX 已发表的结果进行了比较。结果显示，MaxLynx再次报告了更多的 CSM 以及更多独特的交联肽段。MaxLynx 工作流程MaxLynx 的算法在保留了大部分 MaxQuant 工作流程的基础上，加入了针对交联肽段的检索功能（图 1a）。此外，新颖的峰值优化功能（图 1b）可以改善由于噪声而导致的交联肽段的错误识别。根据所应用的交联剂是否为质谱可断裂或质谱不可断裂，使用两个专门的搜索引擎中的一个来进行检索（图 1c）。图1 MaxLynx的工作流程(a)MaxLynx主要算法步骤的简化框图。灰色的步骤与常规肽检索MaxQuant的工作流程保持不变，而蓝色的步骤是为交联搜索而新开发的。(b)新添加的峰值优化功能，目的是“修复”由于噪音而没有很好地鉴定的峰。(c)质谱可断裂或质谱不可断裂交联剂的检索模式。质谱不可断裂的交联肽段检索MaxLynx 为质谱不可断裂的交联肽段生成一个完整的搜索空间，并在其中执行详尽的搜索。第一步是根据 Andromeda 搜索设置生成初始肽，然后通过组合所有推定的肽来构建搜索空间。交联空间构建后的第二个主要步骤是 MS/MS 交联搜索，即将实验 MS/MS 谱图的前体质量与索引质量进行比较，当索引质量等于一定容差内的实验前体质量时，将生成理论交联肽谱。质谱可断裂的交联肽段检索在质谱分析过程中，可断裂的交联剂经过碎片化，将产生两个带有部分交联剂的肽段（图 1c）。两个肽中较长的用希腊字母 α 表示，较短的用 β 表示。因此，可断裂的交联剂通常会在质谱中生成具有特定质量差异（Δm）的特征双峰信号，也称为特征峰。在 MaxLynx 中，连续应用了三种方法来检测特征峰，即 ①严格质量差法、 ②最高强度法，和 ③放宽标准的质量差法。对于 MS/MS 谱图中的两对特征峰，严格质量差方法取决于观察同一条肽上断裂的交联剂剩余部分的长和短版本之间的质量差异（Δm）。最高强度方法检查 MS/MS 谱图中最高强度的峰是否可以解释为特征峰之一，而无需存在其他特征峰。在具有宽松标准的质量差方法中，只需要一对特征峰。在严格的质量差方法中，目标是找到所有四个特征峰，为此，该算法循环遍历 MS/MS 谱图中大于用户可定义的最小质量的所有峰，并假设它是具有较短交联剂残基的β -肽 (βs) 。然后，检查是否存在剩余相应的三个特征峰，它们分别是具有较长交联剂残基的 β -肽 (βl) 和两种形式的较长肽 ( αs 和 αl )，其质量由下式给出：其中 mp 为交联肽段的前体离子质量。严格的质量差异法的一个缺点是必须观察到四个特征峰。然而，并非所有这些都存在于谱中。此外，还可能存在同源二聚体肽，这意味谱图中仅存在有两个特征峰。为了克服这个问题，该算法实施了第二步，即根据最高强度峰选定特征峰。只要严格的质量差异法找不到解决方案，就会执行此操作。这里的假设是，特征峰属于最强峰。对于每个最强峰，假设它携带较长或较短的交联剂残基。如果上述两种方法都没有找到 MS/MS 谱图的候选肽解释，则算法将使用放宽标准的质量差异法进行第三轮，即只要找到具有特征质量差异的一对峰即可。合成交联肽库的基准测试本文重新分析了几个公开可用的数据集。对于质谱不可断裂的交联剂数据集，与其他算法相比，MaxLynx 在 FDR = 1% 时报告的 CSM 数量最多，平均有 852 个正确和 12 个错误 CSM（图 2）。同时，MaxLynx 报告的独特交联肽段的数量也多于其他软件（平均 230 个）。在质谱可断裂的交联剂数据集上，与其他搜索引擎（MeroX、XlinkX）相比， MaxLynx 报告在 FDR = 1% 时正确交联的数量最多，其中有 185 个正确的和 3 个不正确的独特交联肽段（图 3）。图2 MaxLynx与其他交联搜索引擎在质谱不可断裂的交联剂数据集上的比较(a)显示CSM的数量(b)显示FDR=1%的独特交联肽段的数量。图3 MaxLynx与其他交联搜索引擎在质谱可断裂的交联剂数据集上的比较(a)和(b)分别显示了FDR = 1 % 时的DSBU和DSSO数据集的独特交联肽段的数量。蛋白质组范围内的MS-可断裂交联剂数据的基准测试接下来，本文评估了 MaxLynx 分析大规模蛋白质组范围的交联数据集的能力。为此，文章重新分析了与 DBSU 交联的黑腹果蝇胚胎提取物的 PRIDE 数据集 PXD012546，并与已发表的结果进行了比较。在 FDR = 1% 时， MaxLynx 报告了总共 48,019 个 CSM 和 9035 个独特交联肽段，超过了 MeroX 最初报告的数量，在使用相同设置的情况下。虽然鉴定结果的三次生物学重复之间的重现性是 20%（图 4a），但正如 Götze 等所指出的，这种观察的原因可归因于实验和生物学条件[4]。接下来，文章考察了 MaxLynx 和 MeroX 软件之间重叠的独特交联肽段的数量，并观察到大约 42% 的独特交联肽段在这两者之间同时存在（图 4b）。图4 在大规模蛋白质组全交联搜索中，三次生物学重复的独特交联肽段的重叠(a)大规模交联试验分三次重复进行，并显示了绝对值和百分比。(b)比较了MaxLynx和MeroX的独特交联肽段的总数。离子淌度增强数据文章还考察了 CCS 值如何作为不同类型的交联产物的分子质量的函数（图 5）。结果所示，与线性肽相比，交联肽往往具有更高的 CCS 值以及更高的电荷状态和更高的质量。图5 timsTOF数据集的CCS值，CCS值与分子质量相对应针对DSBU的结果(a)。针对DSSO的结果(b)。重新处理中等大小的蛋白质复合物数据集最后，文章重新分析了一个中等大小的复杂数据集(PXD013947)，结果表明，MaxLynx在此数据集上的表现依然很好。MaxLynx和pLink2的CMS数分别为2542和2335，独特交联肽段总数分别为315和287。从这些独特的交联中，MaxLynx报告了120个蛋白间的交联，而pLink报告了94个。独特交联肽段之间的重叠程度为60%。综上所述，MaxLynx 是一种新的 XL-MS 计算工作流程，已集成到 MaxQuant 软件中。本文展示了 MaxLynx 在 FDR = 1% 时优于检索质谱不可断裂的交联剂和质谱可断裂的交联剂数据集的其他软件。同时，它也适用于具有离子迁移淌度增强的数据集。除此之外，MaxLynx的成功还归于新添加的峰值优化功能。虽然，三次生物学重复之间的交联重叠百分比尚不理想，但这可以通过更好的采集策略和进一步的实验优化来克服，例如引入交联肽的匹配运行，以及对此类样本应用数据独立采集的方法。参考文献(1)Cox, J. Neuhauser, N. Michalski, A. Scheltema, R. A. Olsen, J. V. Mann, M. J. Proteome Res. 2011, 10, 1794−1805.(2)Liu, F. Heck, A. J. Curr. Opin. Struct. Biol. 2015, 35, 100−108.(3)Maes, E. Dyer, J. M. McKerchar, H. J. Deb-Choudhury, S. Clerens, S. Expert Rev. Proteomics 2017, 14, 917−929.(4)Götze, M. Iacobucci, C. Ihling, C. H. Sinz, A. Anal. Chem. 2019, 91, 10236−10244.

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部生物分子高效分离与表征研究组研究员张丽华团队，研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。 　　作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能，其中，细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。化学交联技术(Chemical cross-linking mass spectrometry，CXMS)，尤其是原位化学交联质谱技术(in-vivo CXMS)具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。然而，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。 　　本工作基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯(TDS)。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。在此基础上，低能量的糖苷键-高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，降低了交联肽段谱图分析的复杂性，提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。该团队从Hela细胞中鉴定到对应于3500对以上交联肽段的1453个蛋白质的构象以及843对蛋白质间的相互作用信息，实现了活细胞中蛋白质复合物的原位交联与规模化分析，为活细胞中蛋白质功能的调控提供了重要的技术支撑和关键的互作位点信息。 　　近年来，张丽华团队致力于原位化学交联质谱新技术研究，通过开发一系列新型多功能型化学交联剂，并系统建立深度覆盖的化学交联分析方法等，不断提升原位化学交联技术对于蛋白质复合物原位动态构象的深度捕获和精准分析能力。目前，该团队研制了多种类型的具有不同富集基团、正交反应活性基团的可透膜交联剂，并发展了相应的原位快速交联方法，低丰度交联位点的高效酶解和富集方法，以及基于化学交联距离约束的蛋白质原位构象和相互作用解析方法等，为蛋白质复合物功能状态下原位构象的规模化精准解析提供了关键技术支撑。 　　相关研究成果以A Glycosidic-Bond-Based Mass-Spectrometry-Cleavable Cross-linker Enables In vivo Cross-linking for Protein Complex Analysis为题，发表在《德国应用化学》上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和中国科学院青年创新促进会等的支持。