肌肉组织

无创检测体内肿瘤病灶对于临床医学肿瘤诊疗至关重要。医学成像技术如计算机断层扫描、核磁共振或正电子发射计算机断层扫描等虽然能诊断体内深层病灶，但存在采集时间长、仪器昂贵或辐射剂量大等原因，更常用于术前检查。与之相比，光学检测和成像方法具有实时、高灵敏、非电离辐射、采集方便等优势，结合外源性造影剂可以提供生物体结构、功能和分子的精确信息，是肿瘤诊断的绝佳工具。但是，现有的肿瘤光学检测技术的进一步发展也面临着瓶颈：组织穿透深度较低，无法检测深层病灶。由于生物组织对光子强烈的散射和吸收作用（如图1），光在生物组织中的穿透深度受限一直是这个领域中的巨大挑战。例如，近红外区域肌肉组织的传输平均自由程只有1~2 mm，目前广泛使用的荧光成像技术的组织穿透深度通常只有几毫米。临床结果发现，基于吲哚菁绿的分子影像无法检测到距离胸膜深度超过1.3 cm的肺结节，容易造成假阴性。图1. 生物组织对光子的散射与吸收表面增强拉曼光谱（SERS）对金属纳米颗粒附近的分子的拉曼信号实现极大地增强，具有高特异性和高灵敏度等优点，非常适合用于生物光谱检测。为了获取更高的检测深度，已经报道了光源和探测器间具有一定空间偏移的空间偏移拉曼光谱装置。它利用了生物组织的高散射特性，即来自深层的光子到达表面时会有更大的横向偏移。空间偏移拉曼光谱抑制了表层的背景信号，因此提高了来自深层信号的信噪比。它的一种特殊形式是透射拉曼光谱，它将激光和拉曼探测器放置在样品的两侧。据报道，透射拉曼光谱技术可以实现具有高组织穿透能力的无创检测。尽管如此，透射拉曼光谱技术的最新水平仍未能满足实际生物医学应用的需求。首先，目前文献报道的透射拉曼光谱技术的检测深度或组织厚度仍远低于与人体相关的厚度值。例如，人类的腹背距离超过10 cm。然而，使用透射拉曼光谱技术穿透超过10 cm厚的体外组织或活体动物的可行性迄今尚未得到证实。其次，光子在透射拉曼检测中的传播过程以及测量因素如何决定信号尚不清楚。透射拉曼信号不仅受组织散射系数和吸收系数的影响，还可能与SERS纳米探针的亮度、病灶埋深、组织总厚度等因素有关。评估这些决定性因素之间的关系至关重要。第三，激光的安全性是光学模态临床转化中一个长期关注的问题。临床激光的光安全性通常由最大允许照射量来评估，即对暴露的身体表面造成损伤的风险可忽略不计的最高激光辐射水平。然而，目前大多数体内SERS研究使用的激光剂量远远高于光安全剂量限值，这在很大程度上阻碍了SERS技术的临床转化。图2. 使用透射拉曼装置和超亮SERS探针对小鼠深部肿瘤进行无创成像（示意图)以及透射拉曼光谱信号的理论计算为了解决本领域的上述重要问题，上海交通大学生物医学工程学院叶坚团队首先从透射拉曼光谱测量过程中拉曼光子传播的理论建模和计算入手，研究了实验参数（组织厚度、SERS纳米探针位置、纳米探针亮度、激光功率和光束尺寸）对透射拉曼光谱探测深度的影响（如图2）。理论计算表明，透射拉曼信号与信号源的埋深之间呈不对称的U型关系，说明病变位于组织中部时信号最弱，对透射拉曼信号的检测是最具挑战性的。而提高SERS纳米探针的亮度是增加检测深度/透射组织厚度最直接有效的途径。此外，光束尺寸的增大对深部病灶的透射拉曼检测强度几乎没有影响。因此，可以采用较大的激光束尺寸来降低功率密度。图3. 扩散光束照明的体外透射拉曼光谱检测基于这些发现，该团队设计制备了超亮SERS纳米探针与自制的透射拉曼装置相结合，开发了一个拉曼检测/成像系统。该系统具有以下优点:（1）深度检测能力，使用了低至单颗粒检测水平的超亮SERS纳米探针 （2）临床光安全，样品表面的激光功率密度低于安全光照剂量阈值。利用该系统，团队成功地在安全光照剂量内通过体外14cm厚的组织实现了对包埋在其中的SERS纳米探针的检测（图3），与目前已报道的透射拉曼光谱检测研究相比，穿透深度提高了约97%。进一步地，团队在安全光照剂量内实现了1.5 cm厚未剃毛活鼠体内深层SERS纳米探针的体内无创成像（图4），相比之下，传统的背散射拉曼成像无法获得显著信号。这项工作为透射拉曼光谱技术在体内非侵入性生物医学检查方面的发展提供了新的见解，证明透射拉曼光谱有望成为未来临床癌症诊断的可行工具。图4. 活体小鼠无创光安全透射拉曼光谱检测

近日，华南农业大学动物科学学院家禽遗传育种研究团队首次在饲养的肉鸡肌肉组织中发现微塑料残留，并揭示出微塑料残留会引发转录组和代谢组变化、诱导肌肉肥大、降低鸡肉品质。相关研究在线发表于Science of the Total Environment。该论文第一作者是陈家辉和陈庚华，通讯作者为罗文，张细权和聂庆华为共同作者。微塑料污染是全球性的环境问题，近年来相继在人类肺部和血液发现微塑料残留，引起广泛关注。禽肉是全球消费最多的肉食品之一，禽肉的安全对人类健康至关重要。前期研究发现家禽养殖场普遍存在微塑料污染，但尚未有研究报道微塑料会沉积到禽肉或其他组织器官中。该研究中，研究人员利用LDIR和PyGCMS两项先进的微塑料检测手段，首次在鸡场饲养的商品肉鸡肌肉、小肠和肝脏中发现微塑料残留。其中，残留量最高的是PA-6（尼龙），在肌肉中平均浓度达到约722.5mg/kg。进一步研究发现尼龙主要来自于饲料袋内膜，启示养殖场和饲料生产企业应提高饲料封装工艺，采用更环保安全的袋装技术，避免饲料被微塑料污染。通过系统的体内体外实验研究，研究人员发现微塑料暴露会刺激成肌细胞增殖、诱导细胞凋亡；长期的微塑料暴露则会引发肌肉和肝脏的慢性炎症，诱导肌肉肥大、降低肉质品质；结合转录组和代谢组学方法，发现长期微塑料暴露可显著改变宿主基因表达、影响组织的代谢进程。因此，微塑料残留会引发一系列严重后果，畜禽作为人类肉食品的重要来源，应从源头处预防微塑料的污染。上述研究得到国家重点研发计划项目、国家自然科学基金、广东“特支计划”科技创新青年拔尖人才项目、国家肉鸡产业体系、广东特支计划畜禽种业自主创新团队项目的支持。

大家好，本周为大家分享一篇发表在PNAS上的文章：High sensitivity top–down proteomics captures single muscle cell heterogeneity in large proteoforms [1]，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　单细胞研究表明，即使是具有相同形态和遗传的细胞，其生理功能特性可能也存在较大差异。近年来，基于质谱的单细胞蛋白组学策略逐渐发展成研究细胞异质性的重要技术，但也面临着细胞的蛋白质含量有限和动态范围宽，以及存在proteoforms高度复杂等挑战。得益于肽段易分离、电离和碎裂的特性，目前几乎所有基于质谱的单细胞蛋白组学分析都采用“Bottom-up”的研究思路，但会丢失蛋白质序列变异和翻译后修饰(PTMs)等信息。“Top-down”的蛋白组学通过分析完整蛋白质来避免这些信息的丢失，尽管质谱信噪比会随着分子量的增加而呈指数衰减，其灵敏度也不如“Bottom-up”，但它非常适合用于proteoforms的鉴定，是解析细胞异质性层面的理想方法。因此，作者在此对单个肌细胞进行了高灵敏的Top-down蛋白质组学分析，探究单细胞层面的结构和功能异质性，以期建立细胞类型和proteoforms间的直接关联。　　在本工作中，作者分别以大鼠股外侧肌(VL)、足底肌(PLN)和比目鱼肌(SOL)的单个肌细胞(SMFs)为研究对象，使用优化过的裂解和冻融方法来保证蛋白的高提取率，最大程度减少吸附性蛋白质的损失，最后基于微流多通道纳电喷雾源(MnESI)对完整蛋白进行LC-MS/MS分析。其中，VL和SOL组织分别主要由快缩肌细胞和慢缩肌细胞构成，PLN组织则包含这两类肌细胞，平均最大收缩速度测定结果显示VL和PLN中的SMFs收缩速度存在更大的异质性，如图1B所示。Top-down结果也表明在VL和PLN中主要包含快缩型骨骼肌钙蛋白复合物(fsTnT、fsTnI和fsTnC)、α-原肌球蛋白(α-Tpm)和快缩型骨骼肌球蛋白轻链(MLC-1F、MLC-2F和MLC-3F)，而在SOL中则检测到慢缩型骨骼肌钙蛋白复合物(ssTnT、ssTnI和ssTnC)、β-原肌球蛋白(β-Tpm)和慢缩型骨骼肌球蛋白轻链(MLC-1S、MLC-1V和MLC-2S)，这表明不同类型SMFs独特的功能特征与其proteoform异质性相关(图1C-1D)。值得注意的是，这里能够准确鉴定到分子量30 kDa的proteoforms，比如α-sActin(42 kDa)和MyHC亚型(223 kDa)，说明Top-down方法可以实现对单个肌细胞水平的完整肌节proteoforms的检测。　　图1.(A)大鼠骨骼肌结构示意图 (B)3种肌肉组织(VL、PLN和SOL)中SMFs收缩速度的测量(n = 10) (C)VL、PLN和SOL组织SMFs中的主要肌节proteoforms(n=6) (D)代表性的去卷积质谱图，红色p表示单磷酸化，“△H3PO4”表示pfsTnT3丢失磷酸盐，“-k”表示ssTnT1或pssTnT1赖氨酸残基的丢失。　　肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MyHC)是一种为肌肉收缩和力产生提供能量的分子马达蛋白，具有多种分子量约为223 kDa的蛋白亚型。它们有超过80%的序列同源性，因而很难通过“Bottom-up”的策略去检测和定量。MyHC1、MyHC2、MyHC4和MyHC7是大鼠骨骼肌中主要存在的四种MyHC亚型，其中MyHC7和MyHC4分别是SOL和VL组织中的主要亚型，而PLN组织中主要含有MyHC1、MyHC2和MyHC4，此处检测结果与之相符，如图2所示。与SOL和VL相比，PLN来源的SMFs在最大收缩速度上存在更大差异也印证了一个事实，即多种MyHC亚型在PLN组织中表达，这有助于依据MyHC亚型的表达对SMFs类型进行区分。此外，MyHC亚型在各样本中的质量偏差不超过2 Da，表明该检测方法在单个肌细胞水平上具有高灵敏性。　　图2. MyHC亚型的检测(A-B)VL、PLN和SOL组织中MyHC的电荷肽分布和去卷积谱图 (C-E)VL、PLN和SOL组织中对应的MyHC亚型(n=6)。　　除了蛋白亚型的鉴定，作者也利用Top-down蛋白组学技术实现对蛋白质PTMs的鉴定，例如对fsTnT的检测，如图3所示。快缩型骨骼肌钙蛋白复合物(fsTnT)具有高度序列同源性，它的表达丰度较低，通过传统Bottom-up策略检测是非常具有挑战性的。如图3A所示，在VL和PLN组织中检测到了fsTnT3的几种高丰度proteoforms，包括单磷酸化的fsTnT3(pfsTnT3)、fsTnT3和丢失磷酸盐的pfsTnT3(△H3PO4)。fsTnT3在VL和PLN两组中的表达水平和总磷酸化水平都相似(图3C-图3D)。需要注意的是，进一步放大谱图时可以观察到几种低丰度和肌细胞特异性fsTnT的存在，比如在两组中都检测到的fsTnT4，其总磷酸化在PLN组织中具有更大的表达差异，如图3B所示。此外，Top-down方法也可对两种分子量相差26 Da的Tpm亚型(β-Tpm和β’-Tpm)进行区分。这些结果充分表明Top-down蛋白组学技术适合用于单个肌肉细胞亚型和PTMs的研究。　　图3.磷酸化fsTnT的检测(A)fsTnT3在VL(红色)和PLN(紫色)中的去卷积谱图，红色p表示单磷酸化，“△H3PO4”表示pfsTnT3丢失磷酸盐 (B)A图中29700-30200 Da区域的放大图 (C)fsTnT3和fsTnT4的总磷酸化表达(n=6) (D)fsTnT3的表达(n=3)，p0.05表示两组具有统计学差异，“n.s”表示两组无统计学差异。　　作者也发现一些蛋白亚型在不同类型SMFs中呈现出显著的proteoform异质性。例如，MLC-2亚型，它可以分为MLC-2F(快缩型)和MLC-2S(慢缩型)，两者序列相似，但具有不同的生理功能，可以通过在线LC-MS/MS将其分离(图4D)。其中，MLC-2F和pMLC-2F在VL和PLN中检测到，而MLC-2S和pMLC-2S在SOL中检测到(图4A-4C)，但MLC-2亚型在PLN和SOL组中的总磷酸化水平具有更大的表达差异(图4E)。这些表达差异在对全骨骼肌样品的Top-down组学分析中常被平均化，表明Top-down方法有助于SMFs水平上的肌节proteoforms异质性的研究。　　图4.磷酸化MLC-2亚型的检测(A-C)MLC-2F和MLC-2C在VL、PLN和SOL组中的EIC谱图 (D)MLC-2F在三组中的去卷积谱图 (E)MLC-2F和MLC-2C在三组中的总磷酸化表达(n=6)，p0.05表示两组具有统计学差异，“n.s”表示两组无统计学差异。　　最后，作者以MLC-1亚型序列比对为例，展示了Top-down蛋白组学技术在单细胞proteoform鉴定和表征上的分析能力。SOL组织来源的SMFs有两种MLC-1亚型：MLC-1S和MLC-1V，而PLN和VL来源的SMFs只有MLC-1F这一亚型，LC-MS/MS分析可将这三种具有高度同源性的亚型分离开(图5A-5B)。MLC-1亚型一级谱图具有高质量准确性和清晰的同位素分布，如图5C-5E所示，它们的二级碎裂产生一些特异性的b/y离子，可以很好地表征一些亚型和PTMs(如N末端修饰、乙酰化和二甲基化)。此外，作者也对一些重要的肌节蛋白进行了表征，例如TnT、TnI、Tpm和Z盘蛋白(30 kDa)。尽管它们的二级碎裂率不高(5.8%-25.2%)，但可以产生一些覆盖全长序列的b/y离子，进而实现较大proteoforms的鉴定，表明Top-down蛋白组学方法是表征SMFs蛋白的有利手段。　　图5.MLC-1亚型的表征(A)MLC-1F、MLC-1S和MLC-1V的序列比对，紫色表示亚型间至少共享一个残基，绿色表示亚型间没有共享残基，无颜色表示亚型间序列同源 (B)MLC-1亚型代表性的EIC谱图 (C-E)MLC-1亚型的CAD碎裂，“Ace”表示Nα-乙酰化，“(Me)2”表示Nα-二甲基化。　　总的来说，作者开发了一种Top-down的蛋白质组学策略，其结合了一锅法样品制备和高灵敏的毛细管LC-MS/MS分析，可用于在功能和蛋白质组上具有显著异质性的SMFs的proteoform分离和表征。不同类型SMFs的异质性在肌节proteoforms中得以反映，在其中鉴定到的MyHC亚型(220 kDa)可以用于单细胞水平上的肌细胞分类。更为重要的是，本研究表明Top-down组学方法对于复杂肌节体系PTMs和亚型表征方面的独特优势，强调了其在关联单细胞表型异质性和功能多样性间的应用潜力，希望可以将该方法拓展到其它有高灵敏需求的场景。　　撰稿：陈昌明编辑：李惠琳文章引用：High sensitivity top-down proteomics captures single muscle cell heterogeneity in large proteoforms　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Melby, J. A., Brown, K. A., Gregorich, Z. R., et al. High sensitivity top-down proteomics captures single muscle cell heterogeneity in large proteoforms. PNAS., 2023, 120(19), e2222081120. DOI https://doi.org/10.1073/pnas.2222081120