结构族组成

大家好，本周为大家分享一篇发表在Accounts of Chemical Research上的综述，Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics [1]，文章的通讯作者是美国西北大学的Neil L. Kelleher教授。生命活动由一系列生物大分子相互作用驱动，这些相互作用距今已进化了数十亿年。正如乙酰化和磷酸化等共价修饰可以改变蛋白质的功能一样，与金属、小分子和其他蛋白质的非共价相互作用也可以改变蛋白质的功能。然而，传统的蛋白质组学方法会分离非共价相互作用并使蛋白质变性，导致许多蛋白质水平的生物学信息尚未被发现或仅靠推断获取。就在过去的几年中，质谱(MS)技术不断发展，目前已具备维持内源性蛋白复合物完整组成并表征其特征的能力。采用非变性质谱(Native Top-Down MS, nTDMS)激活蛋白复合体，可以释放部分或全部亚基，通过与中性气体或固体表面碰撞，在进一步表征之前分离。亚单位质量、母离子质量和活化亚单位的碎片离子可以拼凑出复合物的精确分子组成，包括蛋白质修饰在内的相互作用也能被阐明，并与人类疾病状态下的功能障碍联系起来。在本综述中，作者详述了nTDMS技术目前的发展和未来在表征更大的生物复合体方面所面临的挑战。目前，nTDMS可以靶向内源性核小体复合物，而病毒颗粒、外泌体和高密度脂蛋白颗粒表征或将在未来几年内得到深度解析。为充分解决这类大小为兆到千兆道尔顿级别的复合物的表征，未来的工作将主要集中于非变性分离、单离子质谱(Single ion mass spectrometry)和新的数据类型。为了实现这一目标，Kelleher教授课题组近年来发展了一系列策略，概括为以下几个方面（1）靶向非变性质谱表征整个核小体（图1）；（2）非靶向蛋白质组学深度解析内源性蛋白质复合物；（3）单分子质谱(Single molecule MS)。其中提到，阻止对非变性蛋白质进行整体表征最大的障碍之一可能是分子量分布于100 kDa到1 MDa的复合物的分辨率较差。而电荷检测MS通过直接测量离子电荷提供大型复合物的分子分布。此外有研究表明，通过对单分辨离子进行centroiding和rebinning，Orbitrap仪器的有效分辨率可以在电荷检测工作流程之上大大提高。在这种被称为“单离子质谱法(Individual Ion Mass Spectrometry, I2MS)”的技术中，可以同时检测数千个单离子，并允许在复杂混合物中分配约500种proteoforms的质量（前提是它们先前已被表征并且在数据库中可查找）。I2MS可用于分析病毒样颗粒和AAVs（图2）。图1. 核小体表征图2. 病毒颗粒检测未来随着技术的发展和创新，nTDMS都将扩展到研究极其稀缺和高度异质的生物复合物，了解蛋白质间的相互作用以及它们是如何出错的（例如错误折叠，在功能失调的化学计量和组成中形成复合物）。这些将不仅为疾病治疗的发展提供信息，还将深化我们在分子水平上对生命的理解。撰稿：张颖编辑：李惠琳原文：Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics

标准中对于盐雾试验箱的各个重要组成结构都有其明确规定，以下阐述盐雾试验箱标准组成结构及其要求： 1、盐雾试验箱应由耐盐水溶液腐蚀的材料制成或用它衬里，而且应带有可防止冷凝水滴落到试板上的罩盖。为保证喷雾均匀分布，该箱的容积应不小于0.4m3。箱体的大小形状应能使喷雾收集器收集到的溶液的量在最小周期为24H测得的盐雾溶液的平均收集速率应为1mL/h～2.5mL/h。 2、温度应由元件控制，使得盐雾试验箱内各部件保持在规定温度范围内（35±2）℃，该元件箱壁应至少100mm。温度计应整体置于箱内，其距四壁、箱顶和箱端均应在100mm以上，并能够在箱外读数。 3、喷雾装置应由一个压缩空气供给器、一个喷雾溶液的储蓄和一个或多个由耐盐水腐蚀的材料制成的喷嘴组成。供给喷雾的压缩空气应通过滤清器以除去油分和固体颗粒，压力保持在（70～170）kPa。 4、喷雾收集装置，由化学惰性材料制成。盐雾试验箱内放置试验样板的地方，至少有一个靠近喷雾嘴，一个远离喷雾嘴。其位置要求只能收集喷雾也而不是试板或箱 子部件或支架上滴下的液体。 5、试板支架，能以与垂直面成15°～25°的角度支撑试板，通用的支架由惰性非金属材料制成。

榛子是世界四大干果之一。榛子油是一种营养丰富、保健作用广泛、具有独特坚果风味的高级食用油。榛子油中的脂肪酸主要为油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸，不饱和脂肪酸的含量高达90%。其他生物活性成分和抗氧化活性物质也赋予了它抗氧化，抗衰老，提高免疫力，预防动脉粥样硬化，及促进胆固醇降解和代谢的作用。 脂质在生命活动中承担着关键的作用，具有多种重要的生理功能。脂质可分为八大类：脂肪酰（FAs）、甘油脂（GLs）、甘油磷脂（GPs）、鞘脂（SPs）、固醇脂（STs）、孕烯醇酮脂（PRs）、糖脂（SLs）和聚酮（PKs）。脂质组学（lipidomics）作为代谢组学的一个分支，利用现代质谱技术分析脂质的内在化学性质。高分辨率脂质组学平台的出现，包括鸟枪法脂质组学、液相色谱质谱联用（LC-MS）、基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）和成像脂质组学等都成为了分析脂质的工具。脂质组学的研究涉及脂质的定性定量分析、结构和功能特性分析以及在生理和病理阶段的动态变化分析等等。其在食品科学领域的研究主要围绕在食品营养和食品安全控制方面。高分辨率质谱已广泛用于研究食品成分、产地溯源、质量鉴定和真伪鉴别。 为探究加工方式对榛子油脂质组成的影响，鉴定不同榛子油样品的特征脂质。在本实验中，沈阳农业大学的孙嘉阳、吕春茂教授等将脂质组学应用于榛子油的研究。使用冷压法、超声波辅助有机溶剂浸提法和水酶法提取分别得到不同的榛子油样品（CPO、UHO和EAO）。利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）和多元统计分析方法对榛子油中的脂质进行全面表征与分析。探讨了不同加工方法对榛子油脂质组成和油脂品质的影响。这些数据为榛子油的加工利用提供了新的见解，并将有助于榛子产品的开发与应用。榛子油脂质的定性利用UPLC-QTOF-MS在正负离子模式下对3种不同的榛子油样品进行扫描，利用二级质谱数据库进行光谱匹配，实现脂质的定性。在榛子油中共鉴定出98种脂质，包括负离子模式下的63种脂质和正离子模式下的35种脂质（图1A）。这些脂质分为3个大类（GL、GP和SP）和10个亚类。GLs包含2个亚类（二酰甘油（DG）和三酰甘油（TG）），GPs包含7个亚类（甘油磷脂酸（PA）、甘油磷脂酰胆碱（PC）、甘油磷脂酰乙醇胺（PE）、甘油磷脂酰甘油（PG）、甘油磷脂酰肌醇（PI），和其他GPs（PEtOH、PMeOH）），SP包含的1个亚类（神经酰胺（Cer））（图1B）。（A）正负离子模式下鉴定的脂质数量；（B）脂质亚类数量的百分比。图1 榛子油中脂质的定性分析榛子油脂质的定量CPO、UHO和EAO中的总脂质含量分别为1248646.6325、1056993.7416和1027794.9027 nmol/g。图2A～C显示了各亚类脂质含量所占百分比情况。CPO、UHO和EAO中TGs所占比例最大，分别为98.49848%、98.32412%和98.42983%，其次是DGs、PAs和PEs。图2D进一步比较了3种不同榛子油中同一亚类脂质含量的差异。CPO组中GLs（TGs和DGs）含量最高，这可能是由于机械挤压导致的较高脂质浓度所致。UHO组中GPs含量最高，PCs、PIs和PEs含量显著高于其他两组，UHO组中PAs的含量是EAO的117倍。GPs是生物膜的主要成分，在加工时榛子被浸泡在有机溶剂中，溶剂会破坏细胞膜，从而增加GPs的释放，产生这一结果。而EAO组中Cer含量更高，主要是Cer-NS。图2 （A）CPO中脂质亚类的百分比；（B）UHO中脂质亚类的百分比；（C）EAO中脂质亚类的百分比；（D）CPO、UHO和EAO中同一亚类脂质含量的比较在榛子油样品中共鉴定了15种脂肪酸（表1）。除C12:0月桂酸、C14:0肉豆蔻酸、C17:0十七烷酸和C18:3亚麻酸外，CPO组的其他脂肪酸含量均显著高于其他两组。在计算每种脂肪酸的百分比后，发现CPO、UHO和EAO中不饱和脂肪酸的百分比分别为93.39%、93.30%和93.55%。表1 CPO、UHO和EAO中的脂肪酸组成（%）多元统计分析首先对不同加工方式的榛子油样品进行主成分（PCA）分析，可以初步了解不同处理组之间的自然聚类趋势。在图3A的PCA得分图中可以观察到3种榛子油样品分离明显。图3B的PCA的载荷图显示出TG类脂质是区分榛子油的最重要变量。利用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）筛选显著差异脂质。图3C得分图显示，PLS-DA模型可以有效区分三种不同的榛子油样品。为了进一步验证模型，我们进行了200次交叉验证，以评估其稳定性和预测能力。R2和Q2值分别为0.8687和0.7769（图3D）。这表明建立的PLS-DA模型具有较高的可靠性和预测能力，且不存在过拟合现象。（A）PCA得分图；（B）PCA载荷图；（C）PLS-DA得分图；（D）PLS-DA交叉验证图。图3 无监督和有监督模式的多元统计分析EAO、CPO和UHO间的显著差异脂质基于构建的PLS-DA模型，将VIP 1且P 0.05作为筛选条件。图4A显示了鉴定出的12种显著差异脂质情况，包括6个TAGs，3个DAGs、1个PC、1个PA和1个PE。这12种脂质在不同加工方式榛子油中具有显著差异。与UHO组相比，CPO组中9种脂质显示上调，3种下调，其中PC（PC 36:2|PC 18:1_18:1）变化最大（图4B）。与EAO组相比，CPO组有11种脂质显示上调，1种下调，PE（PE 36:3|PE 18:1_18:2）变化最大（图4C）。与EAO组相比，UHO组中有10种显著差异脂质显示上调，2种下调，其中PC（PC 36:2|PC 18:1_18:1）变化最大（图4D）。我们发现在不同加工方式榛子油中GP类脂质差异最大。这些脂质含量的变化可能直接影响油脂的质量和功能。因此，未来对特定亚类脂质进行靶向研究十分重要。这12种显著差异脂质也可以作为潜在的生物标志物对这三个不同加工方式的油脂进行质量控制。图4 （A）PLS-DA VIP得分图，右侧热图表示相应脂质的含量；（B）CPO和UHO之间的差异倍数图；（C）CPO和EAO之间的差异倍数图；（D）UHO和EAO之间的差异倍数图在本研究中，使用UPLC-QTOF-MS对榛子油进行了非靶向脂质组学分析。对CPO、UHO和EAO的脂质组成进行了定性和定量分析，鉴定出10个亚类的98种脂质。通过有监督和无监督的多元统计分析，确定了12种显著差异脂质。这些脂质可以作为潜在的生物标志物来区分三种加工方式的榛子油以及其他掺假检测和质量鉴别。本研究明确了榛子油的脂质成分，并证实了不同加工方式对植物油脂质的影响。这项研究的结果有助于我们理解油脂加工的机理，为今后特定脂质的研究提供有用的信息，并促进榛子油的开发和应用。作者孙嘉阳，女，中共党员，沈阳农业大学硕士研究生（在读），2019年辽宁省优秀毕业生，2020年沈阳农业大学优秀团干部。主要研究方向为榛子油加工及贮藏氧化机制。参与国家自然基金及辽宁省重点研发项目的相关研究工作 。以第一作者在Food Science and Human Wellness发表一篇SCI论文1篇，申请国家发明专利2项。吕春茂，男，博士，沈阳农业大学食品学院三级副教授，硕士生导师，沈阳市高层次“拔尖人才”，沈阳农业大学服务乡村振兴团队首席专家。主要从事果蔬精深加工、食品生物技术和食品质量与安全方面的教学与科研工作。近年来一直针对北方特色果蔬农产品的高值化利用和加工关键技术开展科学研究，包括东北特色经济林作物榛子的食品加工、加工过程中主要营养成分的变化与关联机制、深加工产品及其功能性评价、加工副产品的综合利用；寒富苹果精深加工产品研制及功能性评价、果渣等加工废弃物的综合利用；越橘精深加工产品研制与功能性评价等。共发表论文50多篇，SCI收录5篇，完成专著2部，参与编著教材2部。申请发明专利5项。目前主持辽宁省重点研发计划项目“东北榛子深加工综合利用关键技术研究与示范”等科研课题5项，参加国家重点研发计划“特色经济林采后果实与副产物增值加工关键技术”和国家自然科学基金项目“富含油脂的食品热加工过程中晚期糖基化终产物（AGEs）形成机理研究”的部分研究工作。获得省部级二等奖3项，三等奖2项。学术兼职：中国经济林协会榛子专业委员会理事；中国食品科学技术学会休闲食品加工技术分会理事；中国经济林协会加工利用分会理事；中国经济林协会板栗分会常务理事；辽宁省食品质量与安全学会理事；辽宁省农科院专业学位评审专家等。