裂解色质分析

1、裂解产物的定量分析 在Py-GC发展早期，由于使用各种各样实验室自制的裂解器，所以，同一样品在不同实验室的分析数据常常有很大的偏差。这使得很多人认为Py-GC的定量分析是不可靠的。经过几十年的发展，现在Py-GC的分析重现性己今非昔比，定量分析的重现性可以达到小于3%（相对标准偏差）。裂解产物的定量分析是Py-GC研究的基本要求，也是解析谱图的原始数据。具体的定量方法与常规GC是相同的，即基于峰高或峰面积的归一化法、内标法和外标法。但这些 方法用于Py-GC时应注意如下几个问题：(1）裂解产物的良好分离是准确定量的前提。这意味着要尽可能完全地分离裂解产物，而且色谱峰形要对称。故在裂解产物的定量测定之前必须更仔细地优化色谱分离条件。(2）在定量分析时还必须对实验重复性进行评价。如果误差太大，说明仪器系统的存在条件未能严格重复。若色谱峰分离良好，那么造成重复性差的原因可能有：①样品量太大；②样品在裂解器中的位置不重复；③裂解器加热特性变化；④仪器系统被污染；⑤残留溶剂的影响。这时应逐项检查，找到问题加以解决。直到获得满意的重复性，方可进行可靠的定量分析。(3）通过裂解谱图上某一碎片峰的定量来估算样品中某一组分的含量（如测定共聚物的组成）。这时所选的特征碎片峰应该是完全分离的和峰形对称的，而且这一碎片还应是通过单分子反应得到的初级反应产物，这样才能保证所测的峰高或峰面积与样品的组成呈线性关系。在这种情况下，更要严格控制裂解条件，抑制二次反应的发生。减少样品量有利于防止二次反应。(4）正如在常规GC中那样，内标法定量的精度是最高的。在裂解样品中定量加入另一种物质，只要其裂解产物不干扰样品的裂解和色谱分离，就可用该裂解产物作为内标物，从而大大提高定量结果的可靠性。2、数据处理基本方法 数据处理是Py-GC系的最后一步，也是分析成功的关键性一步。比如作样品鉴定时，在裂解产物较少的情况下，谱图比较简单，仅凭直观就能判断两张谱图是否相同，但在大多数情况下，裂解谱图相当复杂，色谱峰多达几十甚至上百，这时仅靠直观就不能解决问题了，而必须用定量的方法来描述两张谱图的相似程度。但Py-GC还需要一些特殊的数据处理方法，特别是化学计量学的应用，如模式识别、因子分析、多元曲线和相似指数等方法可以揭示谱图间的微小差异。（1）．保留时间标准化 在Py-GC中，由于色谱柱效和操作参数会逐渐有所变化，故同一裂解产物的保留时间不可能在每次分析中都严格重复。这样在计算机进行谱图自动比较时，为保证准确识别相应的色谱峰，就必须设定一个保留时间范围而不是一个特定值。解决这一问题的方法就是保留时间的标准化。 所谓保留时间标准化就是选择一些参照色谱峰对裂解产物的保留时间进行校正，这与GC中的保留指数有相似之处。所不同的是保留指数采用正构烷烃作参照峰，而Py-GC所保留值标准化则是选择谱图上的色谱峰作参照。具体方法如图所示。其中裂解产物A和C是选定的参照峰，t[sub]r[/sub]和t[sub]s[/sub]分别为组分的原始保留时间和标准化的保留时间。 [img=,426,226]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712151555_10_2384346_3.png!w426x226.jpg[/img] 在理想情况下，所选择的参照峰应存在与所有被比较的谱图上，且是完全分离的、峰高值较大的，容易识别的。此外，在所比较的谱图上这些参照峰的相对大小还应大致相同。如果这些条件不能满足，还可以在裂解样品中加入内标物，如脂肪酸甲酷或烃类化合物。就参照峰的个数而言，最少需要两个。（2）．响应值归一化 样品量的不同会引起裂解产物色谱峰响应值的明显变化，因此，每一张裂解色谱图都应作归一化处理，以消除样品量的影响。归一化方法一般有两种，一是将谱图上每个峰的峰高或峰面积（用I[sub]i[/sub]表示）表示为总峰高或总峰面积（∑I[sub]i[/sub]）的分数，即为该色谱峰的归一化值（I[sub]i[/sub][sup]n[/sup]）:[img=,145,53]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712151555_2187_2384346_3.png!w145x53.jpg[/img]二是将每个峰的峰高或峰而积（用I[sub]i[/sub]表示）表示为谱图上最高或峰而积最大的峰（I[sub]B[/sub]）百分数：[img=,154,79]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712151555_7492_2384346_3.png!w154x79.jpg[/img] 两种归一化值的关系为：[img=,168,46]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712151556_1047_2384346_3.png!w168x46.jpg[/img] 对于谱图比较来说，第一种方法给出的结果更为可靠，因为前者可以消除峰高或峰面积波动的影响，而后者仅是相对于一个瞬时测定值的归一化。对于非常相似的样品，有人还提出一种更适合的归一化方法，即假定标准谱图上7个指定参照峰的总峰面积（∑I[sub]s[/sub]）与未知样品相应的色谱峰总峰面积（∑I[sub]i[/sub][sup]n[/sup]）是相当的，故可用下式计算未知样品的色谱峰响应值（峰高或峰面积）的归一化值：[img=,183,71]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712151557_4284_2384346_3.png!w183x71.jpg[/img]（3）．特征峰的选择 经过归一化的裂解谱图通常包括一组选定的色谱峰，即所谓特征峰。谱图的比较就是比较特征峰，而不是比较所有的峰。在Py-GC中，特征峰是指那些同样品的化学组成和结构有着确定对应关系的碎片峰。在进行谱图比较时，应选择那些响应值大的、完全分离的、且能重现的色谱峰。对于共聚物的鉴定，只比较三个特征峰就可以了，而在鉴定微生物时则要比较多达13个峰。 经过上述数据处理后，便可对裂解谱图进行比较。比较的方法有多种，从简单的峰计数到复杂的模式识别技术，其目的就是要描述谱图间的相似程度，从而对未知样品进行分类鉴定。常用的参数有相似系数、相似值、匹配因子、T测试、多变量预计方法等。