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大家好,新手科研小白,想求助大家SEC分离外泌体需要采购的仪器有哪些,暂定是用血清外泌体
[align=center][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]新型[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]外泌体分离方法[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]肿瘤细胞来源的外泌体在分子水平上促进肿瘤的进展、侵袭和转移。因此,在探索细胞间信号传导,分析功能分子成分(蛋白质、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]mRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]microRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])前需要有效的检测和分离肿瘤源性外泌体的能力,这可能为癌症诊断和预后提供关键信息。[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]基于尺寸排阻的外泌体分离技术[/color][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]外泌体是直径在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]30-200 nm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的囊泡,其尺寸小于绝大部分的细胞外囊泡,因此,基于这一特性,可利用具有限制相对分子量或大小的过滤器来分离外泌体。目前,最常用的基于尺寸的外泌体分离技术就是超滤离心法。该方法是一种基于悬浮颗粒或聚合物大小的外泌体分离技术,小于膜孔径的物质会通过过滤膜,大于膜孔径的物质被截留在膜上。超滤法比[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]速度更快,且不需要特殊的设备,已有研究表明该方法可以成功从[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.5 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]尿液中分离外泌体。[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]目前已经开发了一种适合无细胞样品的商用外泌体分离试剂盒,兼具外泌体分离和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]RNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]提取的功能。如图所示,该试剂盒利用注射过滤器双层膜结构,当样品通过两层膜时,较大的细胞外囊泡(如凋亡小体和微囊泡)被保留在上层膜上,而外泌体捕获在下层膜上。与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和外泌体沉淀法相比,超滤法从尿液中获得的外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]RNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]产量最高。该方法的主要缺点在于分离的外泌体容易堵塞过滤膜,导致分离效率下降。此外,该方法可能会导致囊泡的变形和破裂,影响下游分析的结果。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]另一种基于尺寸的外泌体分离方法是尺寸排除色谱法[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]SEC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。该方法利用多孔固定相将悬浮颗粒和聚合物按照大小进行分类[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]流体动力半径小的物质能够通过孔隙,而流体动力半径较大的物质会被截留在孔隙上。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]此外,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]该方法结合其他方法使用可取得更好的效果[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]例如,与单纯的超滤法或[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相比,该方法分离的外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]结合[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]后续超速离心可以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]提高[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]尿外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的捕获效率[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],从而有利于寻找肾脏疾病生物标志物。该方法分离外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]主要[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]缺点在于干扰物多[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔隙极易堵塞,导致色谱柱重复率低,分离效率较低。[/size][/font][align=left][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108012209419773_3887_5111497_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图[/font][font='times new roman']1-3[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']连续过滤原理图[/font][font='times new roman'][size=13px][68][/size][/font][/align][align=center][font='times new roman']Figure [/font][font='times new roman']1-[/font][font='times new roman']3[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']Schematic illustration of sequential filtration[/font][font='times new roman'][size=13px][68][/size][/font][/align][align=center][/align][font='times new roman'][color=#000000]2[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]基于聚合物沉淀的分离技术[/color][/font][font='times new roman'][size=16px]聚合物沉淀[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]技术是通过添加水性聚合物使外泌体溶解度或分散性改变,减少外泌体的水合作用,使外泌体沉淀以达到分离的技术。通常使用分子量为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8000 Da[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的聚乙二醇([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PEG[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])与样品共孵育,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃过夜后,用低速离心或过滤法分离含有外泌体的沉淀物。目前,已开发了一系列聚合物沉淀试剂盒可用于体液和培养基中外泌体的分离。聚合物沉淀分离外泌体的方法易于使用、回收率高,且不需要专门的设备。该方法的主要缺点在于容易引入蛋白质和聚合物材料等其他污染物,使得提取的外泌体纯度较低。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]基于免疫亲和的分离技术[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外泌体磷脂双层膜中含有丰富的蛋白质和受体,如[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD81[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD63[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]TSG101[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、上皮细胞粘附分子等,利用这些受体与配体之间的相互作用,使外泌体与特殊设计的磁性颗粒之间建立免疫亲和作用,可用于外泌体的分离富集。例如,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Zarovni[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等报道了一种基于微孔板的酶联免疫吸附试验([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]ELISA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])用于捕获和定量检测外泌体。尽管与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]产量相当,但是该方法具有快速、易于使用和与常规设备兼容的优势。该报道继续开发了一种基于磁免疫捕获的外泌体分离试剂盒用于从细胞培养基和生物液中分离外泌体,其质量和纯度均优于其他技术。此外,这种方法对样品的初始体积没有要求,可以很容易地缩小或增大样品容量。而该技术主要缺点在于缺乏最佳的外泌体标志物。此外,随着肿瘤的进展,肿瘤抗原表达和调节的异质性可能导致低估和假阴性,并且有些抗原表位可能被阻断或掩蔽。[/size][/font]
[align=center][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]外[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]泌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]体蛋白质的提取[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RIPA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]裂解液的配置:正常购买的裂解液中分别加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.1%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SDS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],配置系列[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RIPA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]裂解液。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])将提取的外[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]泌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]体溶液加入等体积的蛋白裂解液在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]冰浴[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]进行裂解。为了使其充分裂解,每[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]振荡一次,共裂解[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]50 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。随后加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]蛋白变性缓冲液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]℃煮沸[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],将变性的蛋白样品放入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-20[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]℃[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]冰箱中保存备用。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]蛋白浓度的测定[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]首先,将上述外[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]泌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]体裂解后的蛋白原液于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]℃以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]rp[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]m[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]15[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],弃去沉淀。取[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]15[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上清液与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]45[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]缓冲液混合([/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]稀释[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]倍[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px])配置蛋白稀释液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。然后用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PBS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]缓冲液稀释[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]BSA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]标准蛋白溶液,配制终浓度为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.025[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.05[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] /mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0.5mg[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] /mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的蛋白[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]溶液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]A[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]液:[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]B[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]=50[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]:[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的浓度配制工作液。最后,将上述[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]配制好的标准蛋白和蛋白稀释液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中,每孔加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]200[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]工作液,设置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个复孔,吹打混匀,避免出现气泡。将锡箔纸覆盖的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板放入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]37[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]℃恒温箱孵育[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。酶标仪的检测[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]波长设置为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]562[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]nm[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],检测各孔的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]OD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]值。根据酶标仪算出的标准蛋白拟合曲线计算蛋白原液的浓度。[/color][/size][/font][align=left][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]Western blotting[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]分离胶的配置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]将玻璃板清洗干净后组装起来,加入适当的三蒸水,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后,观察液面是否下降,来检查装置是否紧密。待玻璃板干燥后按比例配置分离胶:[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]去离子水;[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3.3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]丙烯酰胺;[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2.5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mL [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]p[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H=8.8 Tris-HC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]l[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SDS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] 10%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]APS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] TEMED[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。将分离胶混匀后加入玻璃板中,在该过程中应避免产生气泡,随后在玻璃板中加入适量的酒精压平界面,待[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30-40 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后,分离胶凝固,倒掉上层酒精。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])基层胶的配置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]待玻璃板干燥后加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]已[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]配置好的基层胶([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2.7 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]去离子水;[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]670[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] 30% PAGE[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]500 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]p[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H=6.8 Tris-HC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]l[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]40 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] 10%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SDS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]40 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] 10% APS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000];[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] TEMED[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]),立刻插入梳子,避免产生气泡,等待基层胶凝固。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]电泳[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]清洗并组装电泳装置,固定[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SDS-PAGE[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凝胶,倒入配置好的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×电泳缓冲液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]14.4 g [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]甘氨酸,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3 g Tris[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1 g SDS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],加入去离子水,搅拌溶解,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]定容至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1000 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])。拔出梳子,用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url][/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]吹打每个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]加样孔以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]去除杂质,用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]40 V[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]电压电泳[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]疏通每个泳道,关闭仪器。然后按照试验要求加入变性后的目的蛋白和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]蛋白[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Marker[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],样品的两边可以加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上样缓冲[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]液进[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]行补齐。打开仪器开关,将电压调至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]60 V[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]进行电泳,当溴酚蓝到达基层胶和分离胶的连接处,将电压调整到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]90 V[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]继续电泳,直至溴酚蓝跑到接近底部。电泳结束后,拆除装置,取出凝胶,切除多余的部分备用。如需考马斯亮蓝染色,将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中,摇床振荡[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后,用蒸馏水洗涤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]次后放入洗脱液中进行洗脱。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]配置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜缓冲[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]液([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]14.4 g [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]甘氨酸,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3 g Tris[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]150 mL [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]甲醇,加入去离子水,搅拌溶解,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]定容至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1000 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])。将适当大小的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PVDF[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]膜放入甲醇中激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],随后放入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]中。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜夹[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]白色面朝下放入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]中,然后放入泡沫层、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]层滤纸、激活后的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PVDF[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]膜、切好的胶、三层滤纸和最后一个泡沫层。在上述过程中应保证每层均无气泡存在。将装置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]放入转膜槽中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]中可以加入小冰袋,防止[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]中温度过高。将装置放入冰盒,恒流[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]200 mA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]进行转膜,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜时间[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]由目的蛋白的分子量所决定。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]封闭和免疫反应[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转膜结束[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后,将膜和含[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5% BSA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TBST[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]溶液放进封闭盒中,室温[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]摇床慢摇[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TBST[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]洗[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]次,每次[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。配置适合比例的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]一[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抗溶液,将膜放入其中,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]℃摇床孵育过夜。第二天,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TBST[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]洗[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]次,每次[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],在室温下摇床[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孵育二抗[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TBST[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]洗[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]次,每次[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]([/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000])[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]显影[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]避光配置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ECL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]发光液。将发光液滴加到膜上,避光孵育[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000],放入预冷后的发光板上,调整膜的位置,用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]BIO-RAD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凝胶成像仪显影并拍照。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体的成功捕获进一步通过[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Western blotting[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]进行验证。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]HSP70[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD63[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]TSG101[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD81[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]是四种典型的普遍存在的外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体标记蛋白。通常这些蛋白在整个细胞上清裂解液中的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]表达水[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]平极低。然而,通过所开发的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Tim4@ILI-01[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]免疫亲和材料富集后,这四种蛋白质均可以被显著识别(图[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3-7[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])。以上结果进一步表明所开发的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Tim4@ILI-01[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]免疫亲和材料可用于成功捕获外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体。[/size][/font][table][tr][td][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108012201079391_8222_5111497_3.jpeg[/img][/align][/td][/tr][/table][align=center][font='times new roman']图[/font][font='times new roman']1[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']培养基中外[/font][font='times new roman']泌[/font][font='times new roman']体特异性蛋白质[/font][font='times new roman']HSP70[/font][font='times new roman']、[/font][font='times new roman']CD63[/font][font='times new roman']、[/font][font='times new roman']TSG101[/font][font='times new roman']和[/font][font='times new roman']CD81[/font][font='times new roman']的[/font][font='times new roman']Western blotting[/font][font='times new roman']结果[/font][/align]