体外羟基化代谢产物

目的使用ACQUITY UPLC／Xevo&trade G2 QTof质谱系统及MetaboLynx&trade XS应用管理软件，鉴定通过人肝微粒体体外孵育而获取的1 &mu M维拉帕米的代谢物。 背景近年来，随着越来越多的一线药品因存在安全性顾虑而退出市场，人们对药品研发过程中的药物代谢和毒性研究给予了更多的关注。如今，在药物发现和研制阶段提早进行药物代谢研究的趋势已比较明显。普遍的做法是对母体药物进行体外代谢物研究，以便在药品开发早期迅速确定其弱点。 在药物发现阶段进行代谢物鉴定的一项挑战是：需要提供快速而通用的方法，并且该方法应足够灵敏，以使体外孵育研究可在低&mu M浓度水平下进行，从而使其更接近于化合物的体内作用情况。 一项典型的体外代谢研究还包括分析母体药物的代谢速率和途径。此类研究的理想分析方案需提供在模拟体内条件的底物浓度下对代谢物进行检测的分析速度和灵敏度。 利用与UPLC/MSE联用的Xevo G2 QTof质谱系统，体外代谢物研究可在低&mu M水平下进行，同时具有较好的速度、灵敏度和选择性。 图1. 人肝微粒体维拉帕米（1 &mu M）的孵育结果显示在MetaboLynx浏览器 中。 解决方案将浓度为1 &mu M的维拉帕米与人肝微粒体在37° C下进行孵育，并分别在 0、15、30、60、120和 240分钟时加入等体积的冷乙腈终止反应。对样品进行离心，并取上清液直接进样。 【 技 术 概 要 】 采用沃特世ACQUITY UPLC系统，ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.7 &mu m、2.1 x 100 mm），进行色谱分离。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，进样量为5.0 &mu L。在ESI正离子模式下，使用Xevo G2 QTof质谱仪采用UPLC/MSE技术进行数据采集，这样一次进样即可同时获取母离子和产物离子的数据。 MetaboLynx XS应用管理软件用于进行数据挖掘，结果显示在MetaboLynx浏览器中（如图1所示）。产物离子信息同时进行处理，并显示在MetaboLynx浏览器中的碎片分析窗口内（图2）。通过对多个孵育时间点的样品进样分析，母体药物的清除曲线和代谢物的形成曲线可在同一次试验中同时获取（如图3所示）。 总结这个应用表明：通过使用配备UPLC/MSE 和MetaboLynx XS工作流程的Xevo G2 QTof质谱系统，体外代谢物研究可在低浓度（&mu M）水平下进行，同时具有较好的速度、灵敏度和选择性。 Xevo G2 QTof系统及其创新型QuanTof&trade 和Engineered Simplicity&trade 技术，与ACQUITY UPLC系统实现了完美结合。它是目前最灵敏的台式oaTOF仪器，拥有1 ppm的准确质量测定能力，数据采集速度高达每秒20张光谱图。 通过采用UPLC/MSE 数据采集策略，再加上具有化学智能的MetaboLynx XS数据处理工作流程，只需进行一次液相色谱进样即可快速完成所有代谢物的鉴定工作。通过在多个时间点进样，可比较容易地获取低浓度（&mu M）孵育水平下目标药物的代谢速率和途径。因此，产能最大化的目标即可轻松实现。

本文由中国药科大学药物代谢与药代动力学重点实验室所作，发表于DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 38:1747–1759, 2010。 中药通常被定义为一种治疗方案，它不是由单一化合物与单一靶点相互作用组成的，而是几种化合物与多个靶点相互作用的协同药理干预。由于天然产物具有多种多样的生物活性和药用潜力，几乎每个文明都积累了使用它们的经验和知识。 最近，西方制药公司开始更喜欢用纯净的天然产品，而不是粗提取物作为药物原料。然而，在识别通过联合用药来有效对抗疾病的天然化合物或受自然启发化合物方面存在巨大的挑战。此外，体内可能存在的大量代谢物、有害药物相互作用的固有风险以及多组分制剂不可预测的药代动力学特性仍需解决。因此，中药代谢研究不仅是中药现代化的关键，而且对新药的开发具有重要意义。 中药代谢研究是一项艰巨的任务，由于中药成分复杂，代谢途径复杂，缺乏标准品，目前尚处于起步阶段。本研究基于液相色谱-离子阱-飞行时间质谱技术，建立了快速鉴定和分类中药成分代谢物的技术平台。 以五味子木脂素提取物为例，完成了体外和体内代谢研究。在体外研究中，对五种典型五味子的代谢产物进行了鉴定和结构表征。主要的代谢途径有去甲基化、羟基化及去甲基-羟基化。在体内研究中，在大鼠尿液中检测到44种代谢物。根据体外代谢规律，对这些代谢产物进行了快速鉴定和分类，并证实羟基化是木脂素在大鼠尿液中的主要代谢途径。 此外，根据在0 - 12、12 - 24和24 - 36小时采集的尿液样本的相对强度，计算雌性和雄性大鼠代谢产物的“相对累积排泄”(RCE)。结果发现，RCE存在很大的性别差异。对于大多数代谢物，雌性大鼠的RCE显著低于雄性大鼠。综上，目前开发的木脂素五味子代谢研究方法和途径将在中药代谢研究中得到广泛应用。 图1 基于液相色谱-质谱联用技术开发的中药代谢平台和工作流程图2 用LC-IT-TOF/MS测定NADPH存在时，五味子木脂素A及其代谢物在雌性(A)和雄性(B)大鼠肝脏S9中的EICs，以及五味子木脂素A可能代谢物的裂解途径(C-F)。虚线方块:潜在的去甲基化位点 虚线圆圈:潜在的羟基化位点。 综上所述，本研究基于LC-IT-TOF/MS单一平台，为解决中药代谢领域的关键问题——包括代谢产物的鉴定和分类，开发了一套系统方法论(图1)。在此基础上，利用LC-IT-TOF/MS平台对五味子木脂素的代谢产物进行了系统鉴别和分类。 首先，利用基于诊断片段离子的扩展策略对五味子木质素提取物中的五味子木脂素进行快速鉴定，并在此过程中对31种五味子木脂素进行了结构特征鉴定。 其次，基于LC-IT-TOF/MS，对5种五味子木脂素成分的标准品在肝脏和肠道S9系统中的代谢命运进行逐一研究，其主要生物转化方式包括去甲基化(－CH3)、羟基化(＋OH)和去甲基化-羟基化(－CH3＋OH)。 文献题目《Development of a Systematic Approach to Identify Metabolites for Herbal Homologs Based on Liquid Chromatography Hybrid Ion Trap Time-of-Flight Mass Spectrometry: Gender-Related Difference in Metabolism of Schisandra Lignans in Rats》 使用仪器岛津LC–IT-TOF/MS 作者Yan Liang, Haiping Hao, Lin Xie, An Kang, Tong Xie, Xiao Zheng, Chen Dai, Kun Hao, Longsheng Sheng, and Guangji Wang Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, China Pharmaceutical University, Nanjing, People’s Republic of China

药物代谢是通过多种药物代谢酶进行生物转化，将药物极性增大通过机体的正常系统再排泄至体外。药物通过代谢器官（主要为肝脏）代谢后，药理活性发生变化可能产生毒副作用，因此药物代谢的研究属于药物的安全性评价的重要一环，并且研究药物在体内的代谢路径，可以为潜在新靶点的发现以及进一步的新药开发提供重要线索。Orbitrap IQ-X专为药物代谢量身定制的数据采集流程和Compound Discoverer软件嵌合的药物代谢高分辨数据处理流程强强联合，让科研小伙伴们从此提高生产力，让代谢产物再无“漏网之鱼”，用最酷的仪器，产生最理想的数据，发最顶jian的paper。诚然，要“一网打尽”药物在机体内转化的代谢产物是很有难度的，首先样品基质很复杂，我们要找的代谢物很可能掩埋在一丛丛响应高大的基质峰里，这个对于仪器的要求核心是超高分辨率，可以将代谢物和基质干扰在分辨率这个维度区分开来，但即便区分开了，我们也希望能高效地采集到所有代谢产物的碎裂谱图；另外基质峰那么多，肉眼怎么可能把数据里的全部代谢产物提出来进一步分析呢？因此对于软件的要求是快速地将代谢产物找到且不漏掉。这两方面的难题分别对应硬件和软件，接下来让我们来瞅瞅高大上的“二强”是如何解决掉这些难题的~Orbitrap IQ-X & Compound DiscovererOrbitrap IQ-X专为药物代谢量身定制的数据采集流程：Orbitrap IQ-X的分辨率高达100万（@200m/z），帮助采集到准确度最da化的质谱图，不仅可以使代谢产物离子和背景干扰离子分离得更开，而且同位素的精细分布信息和二级甚至多级测得的高质量精度的碎片离子质荷比可以给出代谢产物的精zhun元素组成并初步推断代谢产物的碎裂丢失结构单元。比如说对于分子量在500左右的含硫代谢物，分辨率至少设置12万，两个A2同位素峰才能达到分离的效果。另外，实测的12万分辨下的A2同位素的分离图，相比于理论12万分辨率下模拟的同位素分离图来说，由于受到基质的干扰和化合物响应强度不够的影响，A2同位素的分离效果通常要差于理论模拟的同位素分离情况，因此我们在实验中需要对五百左右的含硫代谢物进行准确定性时，需要分辨率设置至少12万，如果分子量超过500，需要的分辨率就更高了。另一个让人难以望其项背的功能是首次推出Real-Time Library Search——实时谱图库搜索的智能MS3触发功能，此功能开发的基础在于代谢产物与母药具有结构相似性，结构相似性体现在质谱谱图上，就是代谢产物和母药的碎裂谱图存在共有碎片；开发的目的在于自动化、高效地获取代谢产物的二级甚至多级信息。实时谱图库搜索的智能MS3触发功能直接嵌合在采集方法模版中，方法设置中一键拖拽即可加载这个采集流程。从示意图中可以看到它是实时地将扫描的二级谱图与母药的标准品谱图库进行相似度匹配，对具有共有碎片的二级谱图中独有的碎片离子触发MS3碎裂谱图的采集，MS3触发可精zhun定位可能的药物代谢物的母离子，简化数据分析的同时，也为代谢产物的结构鉴定提供二级谱图甚至多级谱图信息。（点击查看大图）Compound Discoverer软件嵌合的药物代谢高分辨数据处理流程Compound Discoverer（简称CD）软件在药物代谢产物筛查这块功能非常完善，示意图中分别标注了基于质量亏损过滤（filter by mass defect，MDF）的非目标代谢物的查找模式和目标代谢物查找模式。非目标代谢物查找模式中，基于母药和代谢物结构类似，具有共同特征二级碎片离子的特点，对所有MDF过滤查找出的潜在目标代谢物再进行特征碎片离子搜索，匹配上特征碎片的代谢物就会标记class coverage得分，匹配上的二级碎片越多，该化合物的class coverage分数越高。目标代谢物查找模式是基于给定母药的分子式，根据选择的代谢反应库进行代谢物搜索。CD软件写入了常见的一相和二相代谢反应（见示意图），并支持自定义代谢反应的写入，在目标代谢物查找模式中，可对所有查找到的代谢物以及其二级碎片进行代谢反应解析和结构注释。（点击查看大图）另外CD软件3.2版本（及以上版本）支持中性丢失的搜索，CD软件中引入了常见的特定中性丢失片段，也支持自定义中性单元，可以将丢失特定中性碎片的代谢产物快速搜索出来。（点击查看大图）最常见的代谢物鉴定流程以m/z 482.19391为例，示意图如下，首先进行一级同位素模式匹配（图b），绿色标注的为匹配上的同位素峰；其次与母药二级谱图比对进行碎片离子解析，图c为m/z 482.19391的二级原始谱图与母药二级谱图的镜像对比图，图中质谱峰标注为蓝色对应的碎片离子为母药或其碎片可通过代谢反应产生，标注为绿色对应的二级碎片为与母药相同的碎片离子，标注了颜色的碎片离子均会注释结构和相对应的代谢反应，大大有利于代谢物的结构推测。（点击查看大图）小结Orbitrap IQ-X的高分辨性能、独一无er的采集方式配备CD软件的全面代谢物查找模式中，创新代谢产物采集模式，提高代谢产物查找模式的丰富性，全面覆盖代谢产物查找范围，即便在复杂基质中也能轻松应对未知代谢产物的查找和鉴定。如需合作转载本文，请文末留言。