猴脉络膜视网膜内皮细胞

遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs）是可导致进行性视网膜退化的遗传缺陷性罕见疾病，常见的IRD相关基因缺陷超过200种。近几年，眼科领域的基因治疗临床试验项目数量激增，包括基因替换、基因编辑和基因沉默多个技术方面。2017年美国FDA首次批准了视网膜Voretigene Neparvovec基因疗法（Luxturna, Spark Therapeutics），用于治疗RPE65.1双等位基因突变引起的罕见眼科疾病，称为Leber先天性黑蒙。这个里程碑意义的决定为眼科疾病基因疗法打开了大门。目前大部分临床研究疗法目标是通过导入正常功能基因，从而恢复缺陷基因编码蛋白质的正常表达。在非临床研究和临床研究中，检测转基因目的蛋白表达是基因疗法开发的一个关键方面。 目前，有多种技术可实现目的蛋白表达定量检测包括配体结合法(Ligand binding assay，LBA)如酶联免疫吸附方法（ELISA）、液相色谱-质谱（LC-MS）、流式细胞术、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和组织染色技术。每种技术都有各自优势和局限，如目的蛋白为分泌性表达，可采用ELISA方法检测细胞培养上清液或体液系统中目标蛋白含量；如目的蛋白不能分泌表达，可采用Western Blot或质谱方法；如需要检测细胞膜蛋白，可采用流式细胞术；如要确定蛋白质在细胞和组织内分布，可采用免疫荧光检测。 在体内和体外模型中研究基因治疗产物与治疗靶点的相关作用机制和效应，选择生物相关性模型来检测目的基因表达和生物学活性非常重要。对于眼部疾病可探索选择临床前研究模型如细胞系模型、人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官疾病模型、啮齿动物和非人灵长类动物等，根据生物学相关性和测定时间可在不同阶段综合选择特异性评估模型。眼部疾病细胞模型案例1：iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）中低丰度大分子量蛋白质表达检测 从三名Stargardt病人皮肤活检样本产生多个iPS细胞系，这些患者都携带一个致病性ABCA4基因变异。采用RNA-Sep和Digital WB分析正常对照和患者细胞衍生的RPE。这个细胞模型与活检组织相比，可用于评估难以检测的非表达变异体，患者来源的细胞可能更密切地反映患者体内发生的剪接和编辑事件，可用于病人药物敏感性研究，指导临床试验。采用全自动Digital WB技术分析pABCA4蛋白质表达，制备了20 μg 总蛋白 dRPE 细胞匀浆，阳性和阴性对照分别是20 μg野生型和 ABCA4 敲除小鼠视网膜匀浆。参考下图，小鼠视网膜（Mouse ret）在野生型(WT)中pABCA4表达丰度很高，敲除（KO）小鼠没有表达。人类对照（NHDF）具有比WT小鼠视网膜更高表观分子量，同时有更高的表达丰度。与对照相比，所有患者细胞系（H、J和S）中均可检测到pABCA4 ，但这些低丰度pABCA4蛋白可能被降解，作为截短蛋白或降解产品形式存在（除S2外）。与mRNA表达谱结果一致，S2细胞系具有相对正常的pABCA4表达水平和修饰后成熟膜蛋白的分子量。本研究利用了Digital WB对低丰度和大分子量蛋白质分析检测能力。案例2：眼角膜内皮细胞信号通路中多重蛋白质表达检测 本研究采用人源和鼠源细胞，分别是敲低了SLC4A11表达水平的原代人角膜内皮细胞（primary human corneal endothelial cells, pHCEnC），即SLC4A11 (SLC4A11 KD pHCEnC)；还有Slc4a11+/+和Slc4a11-/-鼠角膜内皮细胞系（murine corneal endothelial cells, MCEnC），即 Slc4a11-/- MCEnC和Slc4a11+/+ MCEnC。比较转录组学分析揭示了SLC4A11 KD pHCEnC和Slc4a11-/- MCEnC中细胞代谢和离子转运功能抑制以及线粒体功能障碍，导致ATP生产减少。AMPK-p53/ULK1通路激活也表明线粒体功能障碍和线粒体自噬。稳态 ATP 水平降低和随后 AMPK-p53 通路激活提供了代谢功能缺陷和转录组改变之间的联系，以及 ATP 不足以维持 Na+/K+-ATPase角膜内皮泵的证据，这是 SLC4A11 相关角膜内皮营养不良特征性水肿的原因。所以SLC4A11缺陷角膜内皮中分子作用导致内皮功能障碍，是先天性遗传性角膜内皮营养不良 (congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED) 和Fuchs 角膜内皮营养不良的主要特征。 下图结果表明SLC4A11缺陷角膜内皮中AMPK-p53 通路激活，采用Digital WB检测信号通路中各蛋白质表达水平。图B说明与 scRNA pHCEnC 对照相比，SLC4A11 KD pHCEnC 中 p53 Ser15 磷酸化水平增加，表明p53转录翻译后激活。图C在Slc4a11-/- MCEnC晚期传代中观察到相似结果（p53 Ser18磷酸化增加，对应于人p53 Ser15）。图C和D结果表明在Slc4a11-/- MCEnC 早期和晚期传代中总 p53 水平增加，代表p53转录激活。进一步研究磷酸化和p53转录激活的激酶，根据报道AMPK介导 Ser15（小鼠中Ser18）磷酸化和p53转录激活，图B和C实验结果也说明AMPKα的Thr172磷酸化增加，AMPKβ1的Ser182磷酸化没有变化。图E和F，与 scRNA pHCEnC 相比，AMPK 另一种下游底物 Unc-51 样自噬激活激酶 1 (ULK1) 在SLC4A11 KD pHCEnC中磷酸化水平(Ser555)增加。综合这些结果表明，ATP水平下降导致AMPK及其下游底物p53 和 ULK1 激活，分别导致转录组改变和线粒体自噬增加。同样，鉴于 SLC4A11 在预防氧化损伤中的作用，SLC4A11 缺失导致线粒体 ROS 产生增加，随后线粒体功能障碍和线粒体自噬增加。此发病机制支持使用Slc4a11-/-小鼠作为SLC4A11相关角膜内皮营养不良的模型，评估各种治疗方法的转化潜力。 基于Digital WB技术的全自动蛋白质表达分析系统Jess可实现化学发光和荧光两种检测模式，是多重蛋白质表达分析有力工具。2022年，ProteinSimple发布了Stellar全自动双色荧光蛋白质表达检测方案，特别适合同步分析细胞信号通路磷酸化蛋白和总蛋白表达，将细胞信号通路研究工具带到一个新高度。iPSC衍生视网膜类器官模型案例1：Digital WB检测iPSC衍生的视网膜类器官中视紫红质表达含量 美国NIH研究人员利用成纤维细胞重编程获得诱导多能干细胞（iPSC），再分化产生视网膜类器官。通过转录组学分析，确定了视网膜类器官发育过程中调节信号，在体外生成了更成熟视网膜，可促进疾病建模和基因治疗研究。本研究采用Digital WB技术揭示了不同培养条件下类器官培养物种视紫红质（Rhodopsin）表达差异。下图结果表明，DHA处理的类器官在32天时视紫红质表达增加了30%，而亚油酸（LA）处理类器官视紫红质表达降低，这表明DHA处理的类器官中视紫红质表达增加不是脂肪酸添加带来的。案例2：AAV基因治疗的RetGC-GUCY2D视网膜类器官疾病模型 Leber先天性黑蒙可由多种不同突变基因导致包括RPE65、CEP29、GUCY2D和CRX等。其中Leber先天性黑蒙1型由GUCY2D基因突变导致，可导致严重视力损害或失明。GUCY2D基因正常拷贝编码了一种鸟苷酸环化酶（RetGC），其是感光器生理学中关键酶之一，视网膜中光敏杆状细胞和视锥细胞使用该酶将光转换为电化学信号。 英国MeiraGTx公司研究人员利用CRISPR/CAS9 技术生成 RetGC 敲除 (RetGC KO) 视网膜类器官，iPSC衍生视网膜类器官分化后，将RetGC KO 视网膜类器官与同一细胞系的野生型类器官进行对比研究。总共设计了四种 AAV 载体来测试RetGC 蛋白在光感受器中的恢复情况，所有载体采用AAV7递送。CMV 和视紫红质激酶 (RK) 两个启动子，并评估了WoodChuck肝炎病毒翻译后调控元件 (WPRE) 影响。采用Digital WB检测6组类器官中RetGC蛋白表达水平。实验结果揭示，与非转导样本组比，所有载体设计均以不同效率产生RetGC蛋白。加入WPRE似乎显示出效力降低趋势，通过其他量化指标验证了这个趋势。 Digital WB相比传统Western blot，只需要几十分之一样本量就可实现类器官等珍贵样本中蛋白质定量检测，而且重复性更高和速度更快，非常适合眼部疾病类器官模型的转基因目的蛋白及相关通路蛋白表达分析。“全自动Digital WB技术是眼部疾病蛋白质表达定量的重要工具 Jess全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital WB) 是Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。系统利用毛细管电泳免疫学分析技术，可从微量样品中自动吸取、分离、捕获蛋白质，并通过化学发光或荧光检测目的蛋白含量。针对眼部疾病基因治疗应用技术优势Digital WB技术适合眼科基因治疗体外和体内各种模型中转基因目的蛋白表达定量分析，用于视网膜细胞系、iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）和类器官、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质分析。适合于基因治疗研发的不同阶段对转基因目的蛋白及相关信号通路蛋白检测需求。满足类器官和视网膜微量样本蛋白质分析需求，Digital WB技术样本量需求是传统Western Blot几十分之一，只需要3 μL样本量就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合眼部疾病微量珍贵样本蛋白质分析。Digital WB精准定量检测，传统Western Blot只能满足样本半定量需求，重复性比较差。基因治疗某些目的蛋白表达与临床治疗效果相关联，可作为替代生物标志物，建立量效关系。要求目的蛋白分析检测标准需要提高，要求技术需要经过严格验证，Digital WB可满足这些需求。符合基因治疗产业对自动化标准化和效率的需求，面对行业激烈竞争，需要提升研发效率。Digital WB实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时完成一批次蛋白质分析，比传统Western Blot快4倍，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。 Digital WB自动化程度高、重复性好、灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足眼部疾病基因治疗项目不同阶段的目的蛋白定量需求。Digital WB已被国内外知名基因治疗机构采用如Biogen, Sarepta Therapeutics, MeiraGTx，ATGC, Spark Therapeutics，Regenxbio，CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Bluebird bio，杭州嘉因生物、中国食品药品检定研究院等，必将在基因治疗研发阶段、非临床研究和临床研究阶段发挥更大的作用。扫描下方二维码，获取更多关于Digital WB资料参考文献： Gordon, Kathleen Del Medico, Amy Sander, Ian Kumar, Arvind Hamad, Bashar (2019). Gene therapies in ophthalmic disease. Nature Reviews Drug Discovery.MacLaren, R.E. A 2020 vision of ocular gene therapy. Gene Ther 28, 217–219 (2021).基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）Thilo M. Buck and Jan Wijnholds. Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4197.Annemieke Aartsma-Rus, Jennifer Morgan, et at. Report of a TREAT-NMD/World Duchenne Organisation Meeting on Dystrophin Quantification Methodology. Journal of Neuromuscular Diseases. 6 (2019) 147–159Beekman C, Janson AA, Baghat A, van Deutekom JC, Datson NA (2018) Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. PLoS ONE 13(4): e0195850.Matynia A, Wang J, Kim S, Li Y, Dimashkie A, Jiang Z, Hu J, Strom SP, Radu RA, Chen R, Gorin MB. Assessing variant causality and severity using retinal pigment epithelial cells derived from Stargardt disease patients. Transl Vis Sci Technol. 2022 11(3):33Zhang W, Frausto R, Chung DD, et al. Energy shortage in human and mouse models of SLC4A11-Associated corneal endothelial dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020 61(8):39Brooks et al., Improved Retinal Organoid Differentiation by Modulating Signaling Pathways Revealed by Comparative Transcriptome Analyses with Development In Vivo, Stem Cell Reports (2019)Arifa Naeem, etc. RetGC-GUCY2D retinal organoid disease model for AAV gene therapy development. MeiraGTx LTd

眼部疾病基因治疗仍面临很多挑战，评估疗法的安全性风险，验证有效性，更好地支持临床试验研究开展，需要开展系统性地非临床研究。在药理学、药代动力学和毒理学等非临床研究中，选择合适的动物模型来检测目的基因表达和相关的生物学活性非常重要。本文介绍了转基因目的蛋白表达检测技术，详细说明了新技术Digital WB在不同临床前动物模型上应用进展。 近几年，眼科领域的基因治疗临床试验项目数量激增，包括基因替换、基因编辑和基因沉默多个技术方面。眼睛作为免疫豁免器官，视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞是几种遗传性视网膜疾病基因疗法的重要靶细胞。遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs）是可导致进行性视网膜退化的遗传缺陷性罕见疾病，常见的IRD相关基因缺陷超过200种。作为基因治疗的理想候选者，2017年美国FDA首次批准了视网膜Voretigene Neparvovec基因疗法（Luxturna, Spark Therapeutics），用于治疗RPE65.1双等位基因突变引起的罕见眼科疾病，称为Leber先天性黑蒙。这个里程碑意义的决定为眼科疾病基因疗法打开了大门。目前大部分临床研究疗法目标是通过导入正常功能基因，从而恢复缺陷基因编码蛋白质的正常表达。如治疗色盲的CNGA/CNGB，治疗无脉络膜症的CHM/REP1，治疗Leber 先天性黑蒙的RPE65，治疗X连锁视网膜色素变性（x-linked retinitis pigmentosa）的RPGR。 尽管眼睛对其他器官有相对优势，但眼部疾病基因治疗仍然具有挑战性如基因疗法生产、临床试验设计和长期安全性方面。需系统地开展非临床研究来评估安全性风险，验证有效性机制，以支持临床试验研究。在体内和体外模型中研究产品与治疗靶点的相关作用机制和效应，选择生物相关性模型来检测目的基因表达和生物学活性非常重要。对于眼部疾病可探索选择临床前研究模型如细胞系模型、人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官疾病模型、啮齿动物和非人灵长类动物等，根据生物学相关性和测定时间可在不同阶段综合选择特异性评估模型。小鼠动物模型案例1：Digital WB检测小鼠眼角膜内转基因蛋白和相关蛋白表达水平 先天性遗传性角膜内皮营养不良 (congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED)是一种罕见的原发于角膜内皮的常染色体隐性遗传病，临床特征为出生时或生命早期出现双侧弥漫性角膜水肿和混浊。由于膜转运蛋白 SLC4A11功能丧失而导致内皮细胞凋亡。本研究采用124只小鼠，53只Slc4a11+/+作为对照，71只眼前房注射AAV9- Slc4a11和空AAV载体。 为了测定病毒转导效率，即AAV9-HA-Slc4a11 转导至 Slc4a11-/- (KO) 动物的角膜内皮细胞效率，AAV9-Slc4a11具有血凝素（Hemagglutinin，HA）标签，通过Digital WB检测HA标签表达水平来反应转导水平。结果显示年轻和年老动物组都实现了AAV载体转导的蛋白质表达，而且水平相当。 Slc4a11-/- (KO)小鼠眼角膜乳酸流出减少，导致乳酸在基质中累积，随着年龄增长而进展。乳酸转运蛋白MCT1、2和4在角膜内皮细胞中具有活性。采用Digital WB（WES Immunoassay）检测小鼠眼角膜内皮层细胞蛋白质表达，在年轻动物中，观察到MCT1和2蛋白质表达水平轻微上调，而MCT4表达显著增加。在年长动物中，乳酸转运蛋白表达升高，但水平改变不显著。 综合多角度研究，揭示了在年轻动物组，AAV9- Slc4a11将CHED表型如角膜水肿、内皮细胞丢失、线粒体氧化应激、乳酸转运蛋白表达和角膜乳酸浓度逆转恢复到正常野生型动物水平。年长动物没有逆转表型，但是仍能阻止疾病进展。这些都表明了采用基因治疗可能对CHED表型进行功能性挽救，更重要的进行早期干预治疗。 本研究充分证明了，在AAV基因治疗小鼠眼角膜样本中，Digital WB可利用微量眼角膜样本准确定量角膜内皮细胞中蛋白质表达水平变化。案例2：Digital WB用于AMD小鼠模型RPE和视网膜中小分子量蛋白质表达分析 自噬（Autophagy）在年龄相关性黄斑变性（AMD）疾病进展中起着重要作用。靶向自噬在具有早期AMD特征的小鼠模型中可减缓功能障碍。研究表明，针对增强自噬途径具有治疗早期 AMD 潜力。采用野生型小鼠（WT）和缺乏APEO（载脂蛋白E）小鼠进行对比研究，APOE对照小鼠的视网膜功能降低，与早期AMD表型一致，可作为AMD研究模型。实验设计是5个月时，在饮用水中加入二甲双胍（0.4 g/kg/天）或海藻糖（3 g/kg/天）给WT 和 APOE 小鼠，而对照组只接受饮用水。13 个月时，对 (A-B) RPE 和 (C-D) 视网膜样本，采用Digital WB分析LC3B 表达水平，GAPDH作为上样对照。作为溶酶体自噬过程中标志物，LC3-II:LC3-I 比率动态变化可反应自噬过程中生成和降解的动态过程。结果揭示了APOE 小鼠的 LC3-II:LC3-I 比率较高，表明自噬减慢。但用海藻糖或二甲双胍治疗的 APOE 动物中，LC3-II:LC3-I 比例恢复到 WT 水平，增强了自噬作用。参考下图： 免疫组织化学实验结果也显示光感受器和视网膜色素上皮 (RPE) 中 MAP1LC3B/LC3（微管相关蛋白1轻链-3β）和 LAMP1（溶酶体相关膜蛋白 1）标记减少，这与增加的LC3-II:LC3-I 比率和多个自噬途径中蛋白质表达改变相关，表明自噬减慢。用二甲双胍或海藻糖处理 APOE 小鼠可改善视网膜功能丧失，增强眼组织中 LC3 和 LAMP1 表达，并将 LC3-II:LC3-I 比率恢复到 WT 水平。 通过Digital WB检测小鼠RPE和视网膜中LC3-II和LC3-I蛋白表达水平变化。LC3-II和LC3-I是小分子蛋白质，由于带电基团修饰，分子量大的LC3-II在电泳分离时，会留在更小分子量处。由于两个蛋白分子量差异仅有2kD，传统WB分析有技术难点，采用Digital WB可分析微量样本和小分子量蛋白质的优势，满足视网膜样本中小分子量膜蛋白质分析需求。非人灵长类动物模型案例1：美国AGTC公司利用Digital WB检测NHP体内转基因目的蛋白表达水平 干性年龄相关性黄斑变性（Dry age-related macular degeneration, dAMD）约占AMD病例的80%~90%，主要有玻璃体疣和视网膜色素上皮异常改变，疾病进展相对缓慢。dAMD致病机制尚未明确，可能与炎症、细胞退化与萎缩、氧化应激、脂质代谢障碍等多种因素相关，其治疗方案极其有限。目前临床阶段研发药物主要以靶向补体系统、氧化应激和炎症反应相关机制为主。近年研究发现，编码关键补体调节因子CFH（The Complement factor H）和CFI (The Complement factor I）的基因遗传突变与干性AMD的发生和发展密切相关，这些蛋白质天然调节补体系统以维持平衡。CFH编码蛋白质H因子是补体旁路激活途径中起重要作用的负调控因子，可调控降低炎症反应减缓dAMD发展。 美国AGTC公司采用新颖设计，将编码CFH的20个短重复序列缩减为18个，这个新型CFH变异体称为tCFH，已在小鼠模型上完成概念验证，并在体外实验中证明了其具有与野生型CFH相同生物活性。在非人类灵长类动物（NHP）上进一步研究体内活性，采用Digital WB检测NHP模型上RPE和视网膜的CFH和tCFH表达水平，采用AAV载体携带变异体基因可在体内实验中实现缩短补体因子表达，本项目已在准备IND申报中。 美国Spark therapeutics公司发表了AAV载体基因治疗庞贝病（PD）临床前小鼠和非人灵长类动物（NHP）最新研究成果(Nature Communication, 2021），采用Digital WB检测血浆中hGAA转基因蛋白表达。Digital WB技术可用于非人灵长类动物模型中样本检测，评估眼科疾病基因治疗项目中转基因目的蛋白质表达水平，评估疗效。“全自动Digital WB技术是眼部疾病蛋白质表达定量的重要工具 Jess全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital WB) 是Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。系统利用毛细管电泳免疫学分析技术，可从微量样品中自动吸取、分离、捕获蛋白质，并通过化学发光或荧光检测目的蛋白含量。针对眼部疾病基因治疗应用技术优势Digital WB技术适合眼科基因治疗体外和体内各种模型中转基因目的蛋白表达定量分析，用于视网膜细胞系、iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）和类器官、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质分析。适合于基因治疗研发的不同阶段对转基因目的蛋白及相关信号通路蛋白检测需求。满足类器官和视网膜微量样本蛋白质分析需求，Digital WB技术样本量需求是传统Western Blot几十分之一，只需要3 μL样本量就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合眼部疾病微量珍贵样本蛋白质分析。Digital WB精准定量检测，传统Western Blot只能满足样本半定量需求，重复性比较差。基因治疗某些目的蛋白表达与临床治疗效果相关联，可作为替代生物标志物，建立量效关系。要求目的蛋白分析检测标准需要提高，要求技术需要经过严格验证，Digital WB可满足这些需求。符合基因治疗产业对自动化标准化和效率的需求，面对行业激烈竞争，需要提升研发效率。Digital WB实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时完成一批次蛋白质分析，比传统Western Blot快4倍，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。 Digital WB自动化程度高、重复性好、灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足眼部疾病基因治疗项目不同阶段的目的蛋白定量需求。Digital WB已被国内外知名基因治疗机构采用如Biogen, Sarepta Therapeutics, MeiraGTx，ATGC, Spark Therapeutics，Regenxbio，CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Bluebird bio，杭州嘉因生物、中国食品药品检定研究院等，必将在基因治疗研发阶段、非临床研究和临床研究阶段发挥更大的作用。扫描下方二维码，获取更多关于Digital WB资料参考文献： Gordon, Kathleen Del Medico, Amy Sander, Ian Kumar, Arvind Hamad, Bashar (2019). Gene therapies in ophthalmic disease. Nature Reviews Drug Discovery.MacLaren, R.E. A 2020 vision of ocular gene therapy. Gene Ther 28, 217–219 (2021).基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）Thilo M. Buck and Jan Wijnholds. Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4197.Annemieke Aartsma-Rus, Jennifer Morgan, et at. Report of a TREAT-NMD/World Duchenne Organisation Meeting on Dystrophin Quantification Methodology. Journal of Neuromuscular Diseases. 6 (2019) 147–159Beekman C, Janson AA, Baghat A, van Deutekom JC, Datson NA (2018) Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. PLoS ONE 13(4): e0195850.Matynia A, Wang J, Kim S, Li Y, Dimashkie A, Jiang Z, Hu J, Strom SP, Radu RA, Chen R, Gorin MB. Assessing variant causality and severity using retinal pigment epithelial cells derived from Stargardt disease patients. Transl Vis Sci Technol. 2022 11(3):33Zhang W, Frausto R, Chung DD, et al. Energy shortage in human and mouse models of SLC4A11-Associated corneal endothelial dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020 61(8):39Brooks et al., Improved Retinal Organoid Differentiation by Modulating Signaling Pathways Revealed by Comparative Transcriptome Analyses with Development In Vivo, Stem Cell Reports (2019)Arifa Naeem, etc. RetGC-GUCY2D retinal organoid disease model for AAV gene therapy development. MeiraGTx LTd

高分辨率成像质谱应用于大鼠视网膜中氯喹的分布分析 在药物研发过程中，候选化合物的体内药代动力学分析是非常关键的步骤。该分析不仅可以掌握其药效药理，还可以得到和毒性评价有关的信息。通常，使用放射性自显影技术(Autoradiography: ARG)和荧光色素标记细胞的方法进行分析。但是，使用ARG的方法成本高，而且一方面这些方法无法区别原药和代谢物，另一方面标记物质的行为可能与未标记物存在差异。 因此，最近成像质谱分析法，即不进行标记即可对候选化合物进行检测的方法备受瞩目。质谱成像法除了能够在无标记的情况下对各种物质的分布进行分析，还能够使用同一切片同时分析原药及其代谢物，有望在今后的药物研发领域得到应用，取得新的突破。本文为您介绍使用成像质谱显微镜iMScope TRIO对氯喹给药后大鼠视网膜进行检测的示例。 1.大鼠视网膜中氯喹的高空间分辨率成像在本次分析中，对给予抗疟剂药物氯喹的大鼠视网膜进行分析。图1为氯喹的结构式。使用氯喹标准品进行分析，对基质及测定模式进行优化，表1为组织切片的分析条件。图1 氯喹的结构式 表1 分析条件 使用成像质谱显微镜iMScope TRIO进行高空间分辨率成像，发现在约10μm厚的视网膜色素上皮周围有氯喹的分布(图2和图3)。 图2 组织切片上的MS/MS质谱图图3 光学图像和MS/MS质谱图像 在测定氯喹时，如果使用成像质谱分析法常用的MS模式，因受到生物体衍生杂质带来的离子抑制、干扰的影响，无法得到清晰的MS图像(此处数据省略)。在本次分析中，通过iMScope TRIO的MS/MS模式进行测定，提高灵敏度，能够获得10μm的高空间分辨率下的MS/MS图像。 2.大鼠眼球中氯喹的高速成像在药代动力学研究过程中，为了阐明药物分子在细胞及器官水平的特征分布区域，分别需要在高空间分辨率及中等空间分辨率获得药物分子的分布信息。本实验使用MS/MS模式测定在中等分辨率(50μm)下测定大鼠眼球整体的氯喹分布情况，分析条件如表2所示。 表2 分析条件图4 组织切片上氯喹的MS/MS产物离子质谱图，激光直径50μm 虽然使用了更大的激光直径，有可能带来存在噪音高、离子抑制等问题，iMScope TRIO依然能够检测得到具有较高信噪比的氯喹特征碎片，并获得清晰的质谱图像。成像质谱实验的采集速度取决于目标检测区域中所包含的点数。iMScope TRIO能够独立更改激光直径及采集间隔等参数，从而能够轻松控制采集速度及图像尺寸，并且不会影响数据质量。 3.基质涂敷方式的比较在氯喹成像质谱分析中，比较了2种不同的MALDI基质涂敷方式。图5显示了有升华法获得的成像结果(基质升华方式的示意图如图6所示)。基质升华有iMLayer升华仪自动完成，而喷雾方式由手动完成。喷雾方式获得成像结果如图7所示。对比两种方式的检测结果，升华法获得了更加清晰尖锐的氯喹分布图像，而喷雾的结果则看起来会有一些扩散，如图7所示。前处理方式的优化依然取决于组织切片的特性以及所使用的基质类型。如示例中的结果，前处理步骤对最终成像结果的图像质量有显著的影响，不仅仅是切片制备的条件同时基质涂敷的过程也很重要。图5 升华法获得的氯喹分布质谱图像图7 喷雾法获得的氯喹分布质谱图像图6 基质升华方式示意图 4.在相同切片上进行MS和MS/MS成像分析成像质谱分析中，在同样位置只能采集一次数据。但是，使用iMScope TRIO可以调整激光直径及采集间隔，因此可以在采集点之间留下未采集区域，从而实现更多次的成像分析。图8显示了使用激光直径为5μm，采集间隔为10μm时，在同一采集区域内进行4次成像分析的方式。 图8 在同一测定区域进行1次MS分析及3次MS/MS分析的数据采集设置方式示例 文献题目《High spatial Resolution Imaging by iMScope TRIO -Imaging of Chloroquine Distribution in Rat Retina-》使用仪器岛津iMScope TRIO 声明1、本文不提供文献原文。2、所引用文献仅供读者研究和学习参考，不得用于其他营利性活动。