pBM40 Toposmart Cloning Kit（TOPO克隆载体 真核表达）

pBM40 Toposmart Cloning Kit（TOPO克隆载体 真核表达）

商品属性：

 产品介绍：

保存条件：-20℃保存
产品介绍：
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM40哺乳动物表达载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。引物CMVforward和SV40PolyArev可用于菌落PCR和测序鉴定。

产品特点：

（1）连接反应仅需 5 分钟。
（2）只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
（3）载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选。
（4）具有 CMV 启动子，适用于外源基因在哺乳动物细胞中的表达，带新霉素抗性基因，便于稳转细胞株的筛选。C 端带 FLAG 标签序列便于表达的目的蛋白质的检测。
（5）相对于 pcDNA3.1 等其它哺乳动物表达载体，pBM40载体具有更小的质粒骨架，转染效率高。
（6）载体具有卡那霉素和新霉素抗性。

注意事项：

（1）引物要求：PCR 引物 5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四个碱基（CACC 为真核表达所必需的 Kozak 序列）。如果目的蛋白需要在 C 端带 FLAG 标签，下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子（3 个碱基），目的蛋白的翻译终止由 FLAG 标签的终止密码子 TAA（位于 Xho I 酶切位点前）来实现。
（2）DNA 聚合酶：选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。
（3）连接时间：5-15 分钟，通常用 15 分钟。
（4）连接温度：室温 (22℃-30℃)，可使用 PCR 仪控温。最佳反应温度为 25℃。若片段存在高 GC 等复杂结构，可在 37℃反应。

pcr相关试剂实验结果分析：

PCR实验结果的分析涉及多个方面，‌包括实验操作、‌试剂质量、‌实验条件等，‌这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。‌以下是对PCR实验结果分析的一些关键点：‌

循环次数过多：‌增加模板量减少循环次数，‌缩短退火时间及延伸时间，‌或改用两种温度的PCR循环，‌可以有效避免循环次数过多导致的问题。‌

退火温度过低：‌退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要，‌过低的退火温度可能导致非特异性扩增，‌影响结果的准确性1。‌

电泳体系问题：‌包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、‌凝胶没有凝固好、‌琼脂糖质量差等问题，‌这些都会影响DNA片段的分离效果。‌

试剂盒问题：‌运输储存不当可能引起试剂盒失效，‌试剂盒本身质量问题如引物选择、‌循环参数设置不当也可能导致实验失败1。‌

降解的陈旧模板：‌使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布，‌影响结果的解读1。‌

PCR假阴性结果：‌可能由引物长度不够、‌试剂浓度不标准、‌靶序列突变或缺失、‌循环参数设置错误、‌标本中有Taq酶抑制剂、‌PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。‌

为了获得准确的PCR实验结果，‌需要注意以下几点：‌

确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。‌

在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测，‌以便及时对反应条件进行调整。‌

防止样本的污染和交叉感染，‌以免影响PCR反应的准确性和可靠性。‌

通过上述分析，‌可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素，‌从而提高实验结果的准确性和可靠性。‌

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