pBM30 Toposmart Cloning Kit（TOPO克隆载体 原核表达）

pBM30 Toposmart Cloning Kit（TOPO克隆载体 原核表达）

商品属性：

 产品介绍：

保存条件：-20℃保存
产品介绍：
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM30原核表达载体中。适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。引物T7和T7t可用于菌落PCR和测序鉴定。

产品特点：

（1） 连接反应仅需 5 分钟
（2） 只适合平末端PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
（3） 载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选。
（4） 具有T7 启动子，类似于 pET30 载体，具备原核表达所需的所有调控元件。适用于外源基因在大肠杆菌中的高水平表达。
（5） 带 His.tag 和 S.tag 两种纯化标签。
（6） 具有凝血酶和肠激酶两种蛋白酶酶切识别序列。
（7） 载体具有卡那霉素抗性。

注意事项：

（1） 引物要求：PCR 引物 5’端不能进行磷酸化修饰，普通商业化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四个碱基。如果表达蛋白需 C 端带 6His 标签，下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子（3 个碱基）。目的蛋白的翻译终止由 6His 标签的终止密码子TGA 来实现。
（2） DNA 聚合酶：选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。
（3） 连接时间：5-15 分钟，一般为 15 分钟。

pcr相关试剂实验结果分析：

PCR实验结果的分析涉及多个方面，‌包括实验操作、‌试剂质量、‌实验条件等，‌这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。‌以下是对PCR实验结果分析的一些关键点：‌

循环次数过多：‌增加模板量减少循环次数，‌缩短退火时间及延伸时间，‌或改用两种温度的PCR循环，‌可以有效避免循环次数过多导致的问题。‌

退火温度过低：‌退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要，‌过低的退火温度可能导致非特异性扩增，‌影响结果的准确性1。‌

电泳体系问题：‌包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、‌凝胶没有凝固好、‌琼脂糖质量差等问题，‌这些都会影响DNA片段的分离效果。‌

试剂盒问题：‌运输储存不当可能引起试剂盒失效，‌试剂盒本身质量问题如引物选择、‌循环参数设置不当也可能导致实验失败1。‌

降解的陈旧模板：‌使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布，‌影响结果的解读1。‌

PCR假阴性结果：‌可能由引物长度不够、‌试剂浓度不标准、‌靶序列突变或缺失、‌循环参数设置错误、‌标本中有Taq酶抑制剂、‌PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。‌

为了获得准确的PCR实验结果，‌需要注意以下几点：‌

确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。‌

在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测，‌以便及时对反应条件进行调整。‌

防止样本的污染和交叉感染，‌以免影响PCR反应的准确性和可靠性。‌

通过上述分析，‌可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素，‌从而提高实验结果的准确性和可靠性。‌

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