NADP苹果酸酶(NADP-ME)活性检测试剂盒 微量法

NADP-苹果酸酶（NADP-ME）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：用时加入 10 mL 提取液充分溶解备用；

2、 试剂三：用时加入用时每支加 1 mL 双蒸水充分溶解备用；

3、 试剂四：用时每支加 500 μL 双蒸水充分溶解备用；

4、 工作液：在 7.5 mL 试剂二中加入 1 mL 试剂三和 0.5 mL 试剂四，可以根据比例现用现配。

产品说明：

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO₂，以及伴随NAD(P)⁺的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

NADP-ME催化NADP+还原成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌、细胞或组织样本的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、 血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中保温15min左右。

3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中混匀，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种），340nm波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

三、NADP-ME 活性计算

注意事项：

1、 若A2-A1大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2、 实验时，试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。

3、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用96孔板做时尽量保持反应温度在37℃或25℃。

4、 最 好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。用96孔板做时尽量做到样本反应时间一致。

5、 如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长5分钟或10分钟。

实验实例：

1、 取 0.1g 肝加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.8753-0.6389=0.2364，按样本质量计算酶活得：

NADP-ME（U/g 质量）=4823×ΔA÷W=4823×0.2364÷0.1=11401.572 U/g 质量。

2、 取 0.1g 蒜加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.1305-0.1081=0.0224，按样本质量计算酶活得：

NADP-ME（U/g 质量）=4823×ΔA÷W=4823×0.0224÷0.1=1080.352 U/g 质量。

3、 取 10μL 马血清直接按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.0763-0.0738=0.0025，按血清/血浆体积计算酶活得：

NADP-ME（U/mL）=4823×ΔA=4823×0.0025=12.0575 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！