生物制造产业呼唤更多中国“菌”团！工业菌种是生物制造产业看不见的“芯片”，是完成生物制造过程的核心。拥有一个菌种，就拥有一个产品，拥有一个先进菌种，就占领一个市场。——陈必强 北京化工大学生命学院博士生导师、教授百欧博伟生物：当前，我国正在加速由发酵工业大国向发酵工业强国转变，以合成生物学及高通量自动化筛选进化为核心的现代生物技术正越来越显示出其在菌种改良上的魅力，越来越多领域突破合成生物制造的技术难关，进入产业化开发阶段。近日，在科技部生物中心组织开展的“绿色生物制造”重点专项2020年度申报项目答辩评审中，6大任务之一的“生物制造工业菌种构建”，受到业内普遍关注。“工业菌种是生物制造产业看不见的‘芯片’，是完成生物制造过程的核心。拥有一个菌种，就拥有一个产品，拥有一个先进菌种，就占领一个市场。” 北京化工大学生命学院博士生导师、教授陈必强7月24日接受科技日报记者采访时表示，我国要努力在生物制造新一轮发展中抓住科技创新机遇，掌握新一代工业菌种的主动权，提升我国生物制造领域的产业竞争力，跑出“加速度”。生物制造产业发展离不开工业菌种一般来说，用于发酵或在催化转化过程中作为活细胞催化剂的微生物都被称为菌种，应用于工业用途的菌种则被称为工业菌种。比如谷氨酸棒杆菌就是重要的工业发酵菌种，它被用于我们熟悉的调味料味精（谷氨酸钠）的生产。我国在20世纪五六十年代就有比较成熟的工业菌种育种技术和生物发酵产业。近十几年来，我国工业菌种支撑的现代生物制造产业发展势头非常迅猛。”陈必强说，如今我国的柠檬酸、味精、山梨醇、酵母等产品的生产技术工艺已经达到国际先进水平。“我国生物基材料单体与聚合物产业发展速度较快，形成以可再生资源为原料的生物材料单体的制备、生物基树脂合成、生物基树脂改性与复合、生物基材料应用为主的生物基材料产业链。”陈必强介绍，我国已建成世界最大的年产2万吨生物基丁二酸的产业化生产线，以及年产1万吨的高光学纯度D-乳酸生产线，聚羟基脂肪酸酯（PHA）年总产能超过2万吨，产品类型和产量国际领先。而生物基材料的产业化离不开高效的工业菌研发。“越来越多的精细化学品与医药化学品突破合成生物制造的技术难关，进入产业化开发阶段。”陈必强举例说，比如浙江震元制药有限公司与中国科学院天津工业生物技术研究所合作，通过途径构建与优化改造获得遗传稳定的高效大肠杆菌细胞工厂，以葡萄糖原料发酵获得左旋多巴，其生产成本与化学法相比降低50％以上。此外，工业生物技术的开发与应用，快速将细胞变成“新工厂”，使我国在抗生素、维生素、生长素、氨基酸、人造肉等高端发酵产品开发上取得重大突破，成为未来产业化加速发展的关键。新技术助力菌种改造更高效、更精准我国现代生物制造产业的突飞猛进，得益于近十几年来我国工业菌种应用的“加速度”，而这与我国在工业菌种领域技术创新能力的提高是分不开的。我国已经可以研发出更优秀的工业菌种，同时开发出与之配套的生产工艺，这些都促进了工业菌种在工业生产中的应用。比如工业菌种传统的（经典的）诱变—筛选技术，20世纪70年代多使用紫外线照射这种物理方法以及诱变剂这种化学方法来使菌种产生基因突变。“使用这两种方法进行诱变，菌种的基因突变完全不可控，很多诱变后的菌种不仅性能没有变好，甚至走向了相反的方向。”陈必强告诉记者，在这种情况下，为了筛选出性能优良的菌种就只能通过“海选”——增加诱变细胞的基数。而当时筛选完全靠人工，每个人一天只能筛选评价十几个细胞。这种筛选速度、数量无法满足工业生产的需要。近些年，我国工业菌种育种技术取得了很多创新和突破。“对比传统的诱变—筛选技术，创新技术的筛选效率比原来有了成千上万倍的提升。”陈必强说，这就像导演挑选演员，有的角色需要擅长唱歌的人，有的需要擅长跳舞的人，得保证一定量的基数，才能挑选出满足各种各样需求的演员。但原来由于筛选技术落后，导致这种“海选”的效率低、效果差。现在有了高通量自动化筛选设备，比如使用流式细胞仪，上亿个细胞一个多小时就可以筛选完。“在菌种的进化过程中，我们也可以进行‘定向培养’。”陈必强介绍，在实验室里，给菌种设置特殊的条件，通过设计好的巧妙模型引导菌种的进化过程，用高科技的生物技术方式，使进化速度加快，并且朝着我们设计好的方向进化。随着基因技术的飞速发展，菌种改造技术还可以根据需求，设计出各种不同性能的工业菌种，解决诱变—筛选技术中诱变环节的不精准性问题。增强核心竞争力让菌种资源自主可控“微生物战略资源短缺严重制约我国微生物产业发展。我国益生菌产业产值超500亿元，占全球产值的17%，而核心菌种自主率不足10%。”中国工程院院士、广东省科学院微生物研究所名誉所长吴清平不久前表示。陈必强对此也表示了同样的担忧：“我国生物发酵产业全球规模第一、影响广泛，但数千亿规模产业的核心关键——工业菌种大部分被国外企业掌控。”“工业菌种和工业酶是生物制造的核心，加强核心工业菌种的创制是保障生物产业创新发展和具备市场核心竞争力的关键。”陈必强认为，我国工业菌种和工业酶的知识产权受制于人，对国内生物制造产业发展和国内企业参与国际市场竞争来说，犹如有鲠在喉，对我国生物产业安全发展也造成了极大威胁。“在以合成生物学为代表的生物技术迅猛发展的今天，生物制造产业被发达国家一致列为新经济增长点，如何提升我国生物制造领域的产业竞争力成为摆在我们面前的重要任务。”陈必强认为，下一步我国应该在解决工业菌种设计的关键理论和技术难题、工业菌种应用核心支撑能力等方面下功夫，这其中包括建立生物合成代谢网络的调控机制，建成各类生物标准元件库、工业菌种库等。“此外，目前我国对基因工程菌种制造的新产品准入的审批标准透明度较低，审批速度慢，一些新产品的审批过程长期搁置，延缓了升级产品为消费者所用的时间，也影响了产业创新的进程。”陈必强举例，比如通过生物法合成人参苷、冬虫夏草成分、虾青素等珍稀天然动植物营养物质，深受消费者亲睐，具有较高的市场价值，技术虽早有突破，但审批进程缓慢。因此完善和加速新菌种、新产品的准入机制和流程也是目前需要解决的问题之一。

              ATCC 17802副溶血弧菌冻干管打管说明书！一、菌种简介平台编号：bio-59974提供形式：冻干物拉丁属名：Vibrio parahaemolyticus中文名称：副溶血弧菌属名：Vibrio种名加词：parahaemolyticus其它中心编号：=CGMCC 1.1997=ATCC 17802来源历史：←中国检验检疫科学研究院(12309) ←CGMCC收藏时间：2008.1.5资源归类编码：15131129101模式菌株：模式菌株主要用途：研究；分析检测具体用途：研究、质量控制特征特性：G-杆菌，有动力，氧化酶阳性；赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶均阳性，精氨酸双水解酶阴性，吲哚阳性，尿素酶、伏-普实验均阴性；无盐胨水、1%盐胨水不生长，6%、8%盐胨水生长；发酵葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖产酸不产气；不发酵乳糖、水杨素。兼性厌氧，最适pH7.4~7.6。生物危害程度：三类致病对象：无致病名称：肠炎传播途径：经口、消化道培养基：牛肉浸液（1：3）1.0L，蛋白胨 10.0g，NaCl 35.0g，琼脂 20.0g，pH7.2～7.4。培养温度：30℃资源保藏类型：培养物保存方法：-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法实物状态：有实物共享方式：公益性共享；资源纯交易性共享；合作研究共享；资源交换性共享用途：研究、质量控制，《GB 4789.7-2013副溶血性弧菌检验》阳性对照菌株，《GB 4789.28 培养基和试剂的质量要求》标准菌株。注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。二、储存条件冻干菌种和试管斜面请置于 2-8℃冷藏。西林瓶菌种请置于-20℃冷冻。三、培养条件1、培养基编号：CM01112、培养基成分：牛肉浸液（1：3）1.0L(或用 3g 牛肉浸粉溶于 1L 蒸馏水中替代)，蛋白胨 10.0g，NaCl 35.0g，琼脂 20.0g，pH7.2～7.4。3、需氧类型：好氧4、培养温度：30℃四、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、试管斜面菌种请尽快转接，不建议长期存放。3、初次使用时请按照本说明书推荐条件进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系或更换新的菌种。五、冻干管打管说明书1、安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉檫试冻干管表面进行消毒，将管顶端于酒精灯外焰上均匀加热；立即滴 2-3 滴无菌水于加热部位，使管壁破裂；再用镊子或其他适宜工具敲下破裂处。2、菌株恢复培养：用无菌吸管吸取 0.5ml 左右液体培养基(固体培养基去掉琼脂即可)于冻干管中将冻干菌粉全部溶解。将溶解后的菌悬液转移至盛有 4~5mL 液体培养基的试管中混匀，可将残留在吸管中 1-2 滴菌悬液转接至固体培养基上。将液体试管和斜面试管于推荐条件下静置培养。以液体培养结果为准。3、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在 2-8℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，需要转接至 2-3 代恢复活力。4、复苏后的菌种在传 1-2 代后使用。5、暂不启开的安瓿管应于 4℃中保藏（特殊除外）。6、冻干管打开后需一次用完，不能留存。7、打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。8、打管操作应在烧杯或托盘上方进行，用完冻干管应灭菌处理后丢弃。9、如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理。

                     小鼠骨髓间充质干细胞的应用！一、背景小鼠骨髓间充质干细胞来源于实验小鼠的正常骨髓血组织，CD44免疫荧光染色为阳性，CD45免疫荧光染色为阴性。细胞生长方式：长梭形细胞，不规则细胞，贴壁培养，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织。在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。贴壁细胞传代：若细胞生长密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留5ml左右继续培养，直至细胞密度达80%左右再进行传代操作，瓶盖可稍微拧松。二、细胞传代的操作步骤：1、挑选细胞：镜检细胞，挑选生长状态良好，细胞界限清晰，具有立体感，形态好无污染、无异常及可疑病变细胞。2、配制细胞培养液：按以下配比配制MEM-0.2%LH培养液100ml内，加入灭活小牛血清10m1，庆大霉素溶液0.3m1，7.5%碳酸氢钠溶液3ml。（仅供一般参考）。3、消化细胞：先用PBS洗液冲洗细胞表面1-2次，每次10m1，弃去洗液，向细胞瓶内加入0.25％胰蛋白酶溶液，每瓶1m1，细胞瓶平放，使消化液完全覆盖细胞表面。4、至细胞完全脱落到胰酶中：每瓶加入10m1细胞培养液吹打分散细胞，按所需的传代比例分装于小方瓶(100m1)中，再加入10m1细胞培养液重复吹打一次后分装，然后补加至所需培养量。5、加塞，置于37±1℃孵箱培养。约2～4天成片(由细胞接种浓度决定)。三、应用用于SDF-1/CXCR4轴以及MCP-1/CCR2轴对小鼠骨髓间充质干细胞迁移及归巢的影响研究：成功培养了ICR小鼠的骨髓间充质干细胞,建立ICR小鼠心肌梗死模型,分选骨髓间充质干细胞中CXCR4和CCR2表达阳性的细胞,研究其归巢和迁移能力的差异,对小鼠梗死心肌修复的影响,并对PI3K/Akt通路在该归巢效应中的潜在作用进行了初步探讨。方法：1、无菌条件下取5-8周龄ICR小鼠的胫腓骨,体外全骨髓贴壁法培养,80%铺满后进行传代,流式鉴定细胞表面分子表达以及细胞周期,G0/G1期细胞量较多,CD44、CD90、CD105阳性率较高的细胞符合骨髓间充质干细胞特征。2、气管插管辅助3、4肋间开胸结扎冠状动脉下支的方法建立小鼠心梗模型,检测LVEF、FS、LVEDD等指标,鉴定小鼠模型是否构建成功。3、小鼠骨髓间充质干细胞体外培养扩增联合免疫磁珠分选（MACS）纯化CXCR4/CCR2阳性骨髓间充质干细胞,并作克隆培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞分选前后的细胞表面标志物的表达情况。4、采用Transwell模型检测CXCR4/CCR2对骨髓间充质干细胞迁移的影响及其可能机制。下室种植心肌细胞,上室为纯化的骨髓间充质干细胞。实验共分为四组,对照组,CXCR4+/CCR2+组,CXCR4+/CCR2-组,CXCR4-/CCR2+组,24h后5个高倍视野计数迁移的细胞。免疫荧光检测下室穿过细胞。5、左冠脉前降支（LAD）结扎建立小鼠心梗模型后,在梗死区周边选取5个位点注射分选后的细胞,观察移植骨髓间充质干细胞对体内归巢及对心梗修复的影响。欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                   微生物实验室废弃物的处理方法！百欧博伟生物：食品微生物实验室的实验对象是致病微生物，所以操作过程中产生的废液、废气和废物中不可避免的带有致病微生物。因此为了保证实验室的生物安全，必须及时的对实验过程中产生的废液、废气和废物进行处理。防止其感染实验人员和污染实验室及周围的环境。实验室废弃物的处理和处置的管理应符合国家或地方法规和标准的要求，应征询相关主管部门的意见和建议。在设计和执行关于生物危害性废弃物处理、运输和废弃的规划之前，必须参考最新版的相关文件。实验室废弃物的管理目的是将操作、收集、运输、处理及处置废弃物的危险减至为零，将其对环境的危害降为零。实验室废弃物处理只可使用被承认的技术和方法，废弃物的排放应符合国家或地方规定和标准的要求。一般情况下，高压灭菌过的废弃物可以在指定垃圾场掩埋处理，或在其他地方焚烧后处理。焚烧炉内的灰烬可以作为普通家庭废弃物处理并由地方有关部门运走。实验室应有措施和能力安全处理和处置实验室危险废物；应有对危险废物处理和处置的政策和程序，包括对排放标准及监测的规定；应评估和避免危险废物处理和处置方法本身的风险；应根据危险废物的性质和危险性按相关标准分类处理和处置废物；危险废物应弃置于专门设计的、专用的和有标识的用于处置危险废物的容器内，装量不能超过建议的装载容器；锐器(包括针头、小刀、金属和玻璃等)应直接弃置于耐扎的容器内；应由经过培训的人员处理危险废物，并应穿戴适当的个体防护装备；不应积存垃圾和实验室废物；在消毒灭菌被或最终处置之前，应存放在指定的安全地方；不应从实验室取走或排放不符合相关运输或排放要求的实验室废物；应在实验室内消毒灭菌含活性高致病生物因子的废物；如果法规许可，只要包装和运输方式符合危险废物的运输要求，可以运送未处理的危险废物到指定机构处理。下面结合食品微生物实验室介绍实验室废弃物的处理。一、废液的处理食品微生物实验室废水来自有致病菌的培养物、洗涤水以及其他诊断检测样品等。对于实验室产生的废水，应尽快消毒灭菌，严防污染扩散，要加强污染源管理。废液处理方法有化学药剂法和热力消毒灭菌法。根据不同的处理对象和处理要求采用不同的方法对废液进行处理。1、化学药剂法化学消毒药剂按其杀菌由强到弱可分为灭菌剂、消毒剂、抑菌剂。废水化学法消毒最好采用相关发生器、虹吸投药法或高位槽投药法，也可以在废水入口处直接投加。投放液氯用加氯机，投放二氧化氯用二氧化氯发生器，投放次氯酸钠用发生器或液体药剂，投放臭氧用臭氧发生器，投放过氧化氢用过氧化氢发生器。2、物理热力法生物安全实验室物理热力法废液处理系统是通过加热方式连续对废液进行消毒灭菌处理的，目的是使废液在尽可能短的时间内得到处理，避免引起污染扩散。连续式废液消毒灭菌是一种对生物性废液进行灭菌的新技术，主要运用于生物安全实验室废液的处理。实验室产生的废液通过双层排水管道从废液入口进入缓冲储液罐，产生的废气经过高效过滤器除菌后从透气管排出。当液面达到一定的高度时，废液出口阀门自动打开，同时启动流速控制泵。将废液以设定流速压入预加热/冷却柜进行预加热处理，之后进入电加热灭菌器，在灭菌器内废液通过电加热灭菌盘管进行高温灭菌。已灭菌的废液再进入预加热/冷却柜经缓冲管后进行冷却，冷却后的废液通过排污口排出。如需如此处理，则通过回流管回流至储液罐，或直接进行再次连续处理。预加热/冷却柜通过热交换器，使已灭菌的高温废液对进入的待处理废液进行预加热，同时自己得到冷却，以节约能源。与传统的储罐式灭菌技术相比，连续废液消毒在效率、有效性、安全性和节约成本等方面都有了很大提高。3、混合处理法对于生物安全实验室来说，其实验的对象种类较多，需要对废液进行不同的处理，适用于采用化学药剂和物理热力混合法处理系统。该系统将热力法连续废液灭菌系统与化学药剂处理装置结合，对废液进行热力灭菌处理和化学药剂处理，还可对灭菌系统内管道进行化学消毒。4、第二级废水处理系统第二级废水处理系统可以处理经生物安全实验室内第一级废液处理系统处理后排出的废水,还可以处理来自食堂、洗澡池、卫生间、洗手盆的一般生活污水及普通实验过程中排放的无致病性微生物，但含有其他化学污染物的废水。第二级废水处理系统具备有效去除酸碱、重金属、有机溶剂及杀灭一般微生物的功能，使处理后的水质达到排放或中水回用的标准。第二级废水处理系统的原理及工艺流程如下：来自生物安全实验室的废水经隔油器除油，同生活污水经由孔径为10mm的格栅除去较大的固体漂浮物后，汇集到调节池进行混合处理，再经直径2mm～5mm的格栅处理，除去直径大于5mm的固体漂浮物，进入初沉池。沉淀后上清液流入生化处理池进行生化处理，再经二次沉淀池沉淀后进入接触池进行最后处理，符合GB国家标准后排放。二、废气的处理食品微生物实验室的排风、仪器设备(生物安全柜、通风柜等)的排气会带有致病微生物，这种废气如果直接排放到实验室外，将会感染人群及动物，引起流行病暴发，严重威胁人类生命健康。因此，实验室产生的废气，经过严格消毒处理后方可排放。食品微生物实验室的污染废气主要来自实验室空调通风系统、生物安全柜、负压通风柜、干/湿热消毒灭菌器、离心机排风罩等易产生带菌、带毒气溶胶的设备的排风，以及焚烧炉排放的烟尘等。对安装的送排风系统的实验室总体要求是控制实验室的气流方向和压力梯度，使通过初效、中效、高效三级过滤器后的气体由清洁区流向污染区；室内采用上送下排，使污染区和半污染区的气流死角和涡流降至最小程度；特别要指出的是，要确保实验室空气只能通过高效过滤器经专用排风管道排出。第一级高效过滤器应安装在实验室排风管道的前端(其他通风设备同理)。若需加装第二级排风高效过滤器，应将其串接在离第一道高效过滤器后500mm以远至排风机之前的地方(选择易维护、易操作和易更换的地方，如排风机技术夹层)。高效空气过滤器的安装与更换应牢固、符合气密性要求，并应由有资质的技术人员来进行。通常高效过滤器在更换前应经过消毒灭菌，或采用可在气密袋中进行过滤器更换的位置。坐应急处理时维修人员应身着防护服，更换下来的高效过滤器应立即进行消毒或焚烧。每个高效过滤器在安装、更换、维护后都应进行检测，运行期间要进行日常监视，并根据实际情况定期进行检测，以确保其性能。应能控制实验室排风系统与其他排风设备(生物安全柜、负压通风柜、动物负压隔离器、离心机排风罩等）排风的压力平衡和响应速度匹配。应安装自动联锁装置，确保实验室内不出现正压和确保其他排风设备气流不倒流。实验室的排风应经高效过滤后由排风机向空中排放。外部排风口应远离送风口，并设置在主导风的下风向，应至少高于所在建筑屋面2m以上，应有防雨、防鼠、防虫设计，但不影响气体直接向上空排放。在送风和排风总管处应安装气密性密封阀，必要时可完全关闭以进行室内或风管化学熏蒸或循环消毒灭菌。三、固体废弃物的处理固体废弃物是指人类在生产、建设、日常生活和其他活动中产生的，且对所有者在一定时间和地点已不再具有使用价值而被废弃的固态或半固态物质。《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》(中华人民共和国主席令第三十一号，2004年12月29日)中规定了工业固体废物和生活垃圾污染环境的防治，并对危险废物污染环境的防治做出了特别规定。食品微生物实验室的固体废弃物来源于实验器材废物、含有传染性生物因子的废弃样本和培养物、废弃的感染动物、实验室废弃的空气净化材料等。食品微生物实验室产生的废弃物属危险废物，不能回收利用，必须经灭菌处理后丢弃或焚烧处置后填埋。固体废物由于不适当地处理、储存、运输、处置或管理上的疏忽，会对人体健康或环境造成显著的威胁。应按照《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》的规定进行污染废物的收集、运输、储存。所有弃置的样本、培养物和其他生物性材料应弃置于专门设计的、专用的并有标记的用于处置危险废弃物的容器内，并集中存放在指定地点。在从实验室取走之前，应通过高压灭菌、化学消毒或其他被认可的技术进行处理，然后置于密封的容器中，分类做上标记，由专人安全运出实验室。生物废弃物容器的充满量，不能超过其设计容量。利器(包括针头、小刀、金属和玻璃等)应直接弃置于耐扎容器内。培养物必须经121℃30min高压灭菌。载玻片上的活菌标本应装于密闭容器中进行高压灭菌，或经3%来苏尔溶液或5%石炭酸溶液浸泡24 h后方可丢弃。染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24 h (消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121℃30 min高压灭菌。涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，致病菌的冲洗液须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后才能洗涤。打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡30 min后再擦拭干净。污染的工作服或进行致病菌检测所穿的工作服、非一次性的实验帽和口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。实验室应确保由经过适当培训的人员，使用适当的个人防护装备和设备处理危险废弃物。不允许积存垃圾和积存实验室废弃物，已装满的容器应及时封存，在去污染或最终处置之前，应存放在指定的通常在实验室区内的安全地方。

               短小芽孢杆菌的形态特征及应用与防治！短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是菌体细杆状的芽孢杆菌属的一种细菌，一般为0.6~0.7μm×2.0~3.0μm，革兰氏阳性。一、菌种简介平台编号：bio-59975提供形式：冻干物拉丁属名：Bacillus pumilus中文名称：短小芽孢杆菌属名：Bacillus种名加词：pumilus类型：革兰氏阳性菌属：芽孢杆菌属形状：细杆状其它中心编号：=ATCC 27142来源历史：←中国检验检疫科学研究院(22703) ←军事医学科学院收藏时间：2008.1.5资源归类编码：15131311101模式菌株：非模式菌株主要用途：研究；分析检测具体用途：《消毒技术规范》规定的消毒药械对微生物杀灭效果的检定评价标准菌种。特征特性：G+杆菌，运动，精氨酸双水解酶阴性，吲哚阴性，伏-普实验、硝酸盐还原实验阳性，卵黄反应阴性，发酵糖类产酸不产气，不发酵阿拉伯糖。耐辐射。严格好氧，最适pH7.4~7.6。    生物危害程度：四类致病对象：无培养基：蛋白胨 5.0g，牛肉浸取物 3.0g，NaCl 5.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0。[注] 培养芽孢杆菌时加入5mg MnSO4·H2O，则有利于产生芽孢。培养温度：30℃资源保藏类型：培养物保存方法：真空冷冻干燥法实物状态：有实物共享方式：公益性共享；资源纯交易性共享；合作研究共享；资源交换性共享用途：研究；分析检测；《消毒技术规范》规定的消毒药械对微生物杀灭效果的检定评价标准菌种。注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。二、形态特征B. pumilus存在半透明型和不透明型两种不同的菌落形态，对两种菌落分别进行传代，半透明菌落能产生半透明和不透明型菌落，且基本各占一半。而不透明菌落在传代过程中只产生少许的半透明菌落，且传至第4代时半透明型菌落消失。  三、培养条件1、培养基编号：CM00022、培养基成分：蛋白胨 5.0g，牛肉浸取物 3.0g，NaCl 5.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0。[注] 培养芽孢杆菌时加入 5mg MnSO4·H2O，则有利于产生芽孢。3、需氧类型：好氧4、培养温度：30℃四、应用作物小麦、草莓。五、防治对象小麦根腐病、草莓灰霉病。六、储存条件冻干菌种和试管斜面请置于 2-8℃冷藏。西林瓶菌种请置于-20℃冷冻。七、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、试管斜面菌种请尽快转接，不建议长期存放。3、初次使用时请按照本说明书推荐条件进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。

               SMMC-7721(人肝癌细胞)的培养方法！一、细胞简介平台编号：bio-105868规格：1ml/T75拉丁属名：SMMC-7721(人肝癌细胞)别称：SMMC 7721; SMMC7721; H7721; H-7721细胞名称：人肝癌细胞细胞用途：仅供科研使用。注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。二、背景描述 SMMC-7721细胞取自人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。SMMC-7721细胞AFP阳性；用Northern Blot方法，未能检测到SMMC-7721细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。(STR检测位点同HELA)三、细胞特性来源：人形态：上皮细胞样含量：>1x106 个/mL污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性规格：T75瓶或者1mL冻存管包装四、细胞的运输和保存使用含有优质胎牛血清的2ml冻存管发送存活细胞。收到细胞后，可在1000RPM，常温条件下，离心5min后，于洁净操作台弃去上清，加入推荐使用的培养基后转移至10cm培养皿或者T75培养瓶中培养，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。五、细胞培养步骤（一）培养基及培养冻存条件准备：1、培养液：DMEM(高糖）+10%FBS2、培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。3、冻存液：90%FBS+10%DMSO，现用现配。液氮储存。（二）细胞处理：1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml FBS后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2）加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。3）按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。4）将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。六、注意事项1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。2、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

                     白地霉的形态与生长及注意事项！白地霉，英文学名：Geotrichum candidum，是半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，地霉属，真菌一种。白地霉的形态特征介于酵母菌和霉菌之间，繁殖方式以裂殖为主，少数菌株间有芽生孢子。生长温度范围在 5 ℃-38 ℃, 最适生长温度为25 ℃。生长pH范围在3-11，最适pH为5-7，具有广泛的生态适应性。单株白地霉具有一定程度的表型可变性，同种内不同菌株呈现遗传多态性，菌落颜色从白色到奶油色，少数菌株为浅褐色或深褐色，质地从油脂到皮膜状。一、菌种简介平台编号：bio-51967规格：冻干物拉丁属名：Geotrichum candidum Link菌株名称：白地霉其他编号：AS2.498培养基编号：13培养温度：25-28℃用途：研究注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、培养基*麦芽汁琼脂培养基*YM 培养基（酵母粉 3.0 g ； 麦芽提取物 3.0 g ；葡萄糖 10.0 g ；蛋白胨5.0 g； 琼脂 20.0 g；蒸馏水 1000 ml ；pH 6.2 +/- 0.2 ）三、形态特征菌丝为有横隔的真菌丝，有的为二叉分枝。菌丝宽3～7μm。菌丝成熟后断裂成单个或成链、长筒形、末端钝圆的节孢子。节孢子大小为（4.9～7.6μm）×(5.4～16.6μm)。菌落呈平面扩散，生长快，扁平，乳白色，短绒状或近于粉状，有同心圈可放射线，有的呈中心突起。在液体培养时生白醭，毛绒状或粉状。在葡萄糖、甘露糖、果糖上能微弱发酵；有氧时能同化甘油、乙醇、山梨醇和甘露醇。能分解果胶和油脂。能同化多种有机氮源和尿素。四、生长习性白地霉在28～30℃的麦芽汁中培养24h，会产生白色的、呈毛绒状或粉状的膜。具有真菌丝，有的分枝，横隔或多或少。繁殖方式为裂殖，形成的节孢子单个或连接成链，孢子呈长筒形、方形，也有椭圆或圆形，末端钝圆。节孢子绝大多数为（4.9～7.6）μm×（5.4～16.6）μm。白地霉能水解蛋白，其中多数能液化明胶、胨化牛奶，少数只能胨化牛奶，不能液化明胶。此菌生长温度范围在5℃~38℃，最适温度为25℃。生长pH范围在3-11，最适pH为5-7。白地霉的菌体蛋白营养价值高，可供食用及饲料用，也可用于提取核酸。白地霉还能合成脂肪，能利用糖厂、酒厂及其他食品厂的有机废水生产饲料蛋白。五、保藏条件斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。西林瓶菌种请置于-20℃冷冻。请勿长期置于室温。 六、注意事项1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，参照“开管说明”，用无菌吸管吸取 0.3ml-0.5的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支平板或者斜面）； 经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间；若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。6）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；7）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。8）西林瓶开封：用 75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜内使用尖嘴钳去除塑料盖及铝盖，注意不要同时打开胶塞。缓慢开启胶塞，用 75%酒精棉消毒瓶口部分，使用无菌吸管注入0.5ml 适宜的液体培养基复溶冻干粉末。9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

              海源菌的培养条件与注意事项及保藏方法！海源菌是Idiomarina属的微生物，原产地为中国。MCCC 1B00416与模式菌株Idiomarina seosinensis CL-SP19(AY635468)相似性为99.175%；接触酶阳性，氧化酶阳性，不分解淀粉，半乳糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖不产酸。主要用途为研究，具体用途为近海细菌。一、形态特征MCCC 1B00416与模式菌株Idiomarina seosinensis CL-SP19(AY635468)相似性为99.175%； 接触酶阳性，氧化酶阳性，不分解淀粉，半乳糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖不产酸。 二、菌株特点 1、该菌为需氧芽孢杆菌，细菌繁殖体G兰氏染色阴性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。其细菌繁殖体对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。2、适生长繁殖湿度为56－65℃，培养24h即可形成菌落，37℃下24h看不到菌落。3、本生物指示剂载体为高级滤纸片，染菌量为5×105－5×106cfu/片或1×106cfu/片，封装在小纸袋内，热死亡时间为121℃，3.9 min阳性，19 min阴性；D10值1.3－1.9 min，符合美国药典第十一版规定标准。4、该菌无毒，热抗稳定，在冰箱内4℃下保存一年抗力无明显下降，在常温（20℃左右）可保存1个月。三、培养条件1、营养肉汁琼脂：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。[注]培养芽孢杆菌时加入5mg MnSO4·H2O，则有利于产生芽孢。pH7.0。121℃，15min。2、需氧类型：好氧3、培养温度：55℃四、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌7-10天。2、试管斜面种请尽快转接，不建议长期存放。3、初次使用时请按照本说明书推荐条件进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，BNCC不负责任。4、使用者应保证菌种的安全储存和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。五、保藏方法1、传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。2、液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。3、载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。4、寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。5、冷冻保藏法可分低温冰箱（-20-30℃，-50-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。6、冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

              人胚肺成纤维细胞的处理方法与培养步骤！一、基本信息平台编号：bio-114905规格：1*10 6拉丁属名：IMR-90人胚肺成纤维细胞细胞名称：人胚肺成纤维细胞注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、细胞介绍人胚肺细胞，该细胞株的分裂潜能、病毒易感性等特性已得到深入研究，可作为WI-38和其他标准人肺细胞株的替代品。据报道，这些细胞能够在衰老开始前达到58代的传代水平。三、细胞特性1）来源：人，肺 2）形态：成纤维状 贴壁生长3）含量：>1x106  细胞数4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装5) 用途：仅供科研使用。四、细胞的运输和保存干冰运输及复苏好存活细胞（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。五、细胞接收后的处理方法1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。六、细胞培养步骤1、培养基及培养冻存条件准备：1）准备MEM 基础培养基；优质胎牛血清，20%； 双抗，1%。2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。2、细胞处理：1）冻存细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。3）细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。 3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。下面T25瓶为例；1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

              费氏丙酸杆菌费氏亚种冻干管打管说明书！费氏丙酸杆菌费氏亚种是Propionibacterium属的微生物，原产地为中国。一、菌种简介平台编号：bio-02714提供形式：冻干物拉丁属名：Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii中文译名：费氏丙酸杆菌费氏亚种拉丁学名：Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii原始编号：DSM 20271菌株来源：←DSMZ保藏人：周宇光直接来源国家：德国保藏时间：7/14/1998其他保藏编号：=ATCC 6207 =NCIMB 5959 =NCTC 10470生物危害：四类模式菌株：模式菌株菌株用途：模式菌株培养温度：30℃培养基：0286    其他培养条件：厌氧分离源：瑞士奶酪用途：模式菌株注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。保藏条件：斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。二、培养基ISP-2 培养基Casein peptone (tryptic digest) 10.0 g Yeast extract 5.0 g Na-lactate 10.0 g Agar 15.0 gDistilled water 1.0 L H 7.0-7.2三、形态特征多形态杆菌，常为圆端或尖端的棒状；有的细胞为类球状、分叉或分枝，但不成丝状。细胞单个、成对或短链，呈V或Y字形出现，或方形排列。革兰氏阳性，不运动，不生孢。兼性厌氧，有不同程度的耐氧性；大多数菌株可在稍缺氧的空气中生长。 四、主要价值主要用途为研究，具体用途为产生丙酸、乙酸，少量异丁醇、琥珀酸和CO2。五、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。六、冻干管打管说明书1、安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂（应避免过多水蒸气影响菌种的复苏），用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。2、用无菌吸管吸取 0.3ml（建议勿超过 0.5ml）适宜的液体培养基(不添加琼脂)，滴入管内，轻轻振荡，待安瓿管内的菌体溶解呈悬浮状，在用无菌吸管吸取全部菌悬液接在 1-2 支建议的培养基试管中（不超过 2 支，单位所提供的培养基配方中有琼脂，请务必做成试管斜面，配方中没有琼脂，试管中液体培养基不超过 5ml），并在建议的条件下静止培养。3、冻干管打开后需一次用完，不能留存。另外，安瓿管内大部分是用牛奶做保护剂，里面菌体为少数，复苏时要全部菌悬液接在新鲜培养基上，否则可能造成复苏不成功。4、打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。5、打管操作应在烧杯或托盘上方进行，用完冻干管应灭菌处理后丢弃。菌种复苏时，请务必记录好菌种的编号和制备批号，否则不予售后如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理。

                  芽孢杆菌属的下属分类与主要价值！芽孢杆菌属是革兰氏染色阳性菌。产生芽孢，需氧或兼性厌氧，大多数有动力，无荚膜，多数溶血，通常过氧化氢酶阳性。DNA中的G+C克分子含量为32～62%。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。本菌发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。包括对人和动物致病的炭疽芽孢杆菌，可引起食物中毒的蜡状芽孢杆菌，非致病性的枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等。 一、形态特征细胞呈直杆状，0.5-2.5μm×1.2-10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所抑制。 代表种为枯草芽孢杆菌，周生鞭毛，为格兰染色阳性，芽孢呈椭圆形，在有机物的转化和分解过程中占据重要地位。 芽孢杆菌属根据其形态,可大致分为如下三大群：第1群―芽孢为圆形或圆柱状,位于菌体中央或菌端。芽孢壁薄,菌体基本不鼓起。也叫枯草菌群。炭疽杆菌属于本群。 第2群―芽孢为卵圆形,位于菌体中央或菌端。芽孢壁厚,菌体鼓起。腐蛆病菌属于本群。 第3群―芽孢为球状,位于菌端。菌体鼓起。 二、生理特性好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。通常接触酶阳性。 三、分布范围芽孢杆菌属可广泛见于各种自然环境，如土壤和水中。 四、下属分类芽孢杆菌属可分为以下亚群：多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌。 本属包括对人和动物致病的炭疽芽孢杆菌，可引起食物中毒的蜡状芽孢杆菌，非致病性的枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等近50种。 1、炭疽芽孢杆菌炭疽芽孢杆菌有荚膜，无鞭毛，在人工培养物内细菌呈长链状排列，形成圆卵形芽孢；芽孢位于菌体中央 ，但不大于菌体宽度；专性需氧；芽孢的抵抗力很强，在干燥状态下可生存数十年；本菌主要使食草动物发病，病程急剧，死亡率高；人的易感性仅次于食草动物，病菌经由破损的皮肤、消化道或呼吸道侵入体内，死亡率高；可用抗生素和磺胺治疗。 2、蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌是革兰氏阳性需氧芽孢杆菌，属于兼性好氧菌，能在厌氧的条件下生长，是引起细菌性食物中毒的一种较常见的细菌。该菌生长繁殖的最适宜温度为28-37℃，10℃以下不繁殖。其繁殖体较耐热，需100℃经20min才被杀死，而芽孢可耐受100℃ 30min，或干热120℃经60min才能被杀死。在pH值为6-11的范围内，本菌均能生长；pH值为5以下，其生长发育则显著受到抑制。蜡状芽孢杆菌常见于植物和许多生、熟食品中。已经从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。因此，由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒所涉及的食品种类繁多。 3、枯草芽孢杆菌菌落形态变化很大。细胞0.7-0.8μm×2-3μm。单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。芽孢大小0.6-0.9μm×1.0-1.5μm，椭圆到柱状，中生到近中生。茅胞囊不明显增大。菌落粗糙，不透明，不闪光扩张，污白灰或微带黄色：该菌除生产液化型淀粉酶外，还可用于制取蛋白酶，5'-核苷酸酶，菜些氨基酸，核苷等。  4、凝结芽孢杆菌凝结芽孢杆菌最初由Hammer从酸败的罐头牛奶中分离出，并描述为新种。以后又从酸败的保存食品中分离到这些细菌，它们产生高浓度的L-乳酸，引起含碳水化合物的罐头食品的酸败，从而引起人们的注意。对于分离到的一些菌株在许多研究中也观察到它们的细胞、芽孢和胞囊的形态在菌株间的差异。这些高度有差异的多形态菌株导致许多的同物异名。后来通过一些生理试验而观察到这些菌株可分为不同的簇群。Blμmenstock从表型和遗传型的特征将凝结芽孢杆菌分为两群。Nakamura和Blμmenstock分析了表型相似以前鉴定为凝结芽孢杆菌的菌株。他们用紫外分光光度计测定解链的DNA重新组合的复性率，获得各菌株间的DNA相似值。结果发现其中有30个菌株明显分为DNA相关联的两个群。1群以凝结芽孢杆菌为代表，另一群菌株与芽孢杆菌的有关种的DNA相似值都低，在表型特征与凝结芽孢杆菌也有所区别，因此定为一新种，命名为斯密氏芽孢杆菌（Bacillus smithii）。 5、斯密氏芽孢杆菌如上述这个种是原鉴定为凝结芽孢杆菌的菌株经重新分类而建立的。该种的菌株分离自炼乳、罐头食品、乳酪、榨取的糖甜菜汁等。 6、嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌细胞杆状，一般为0.6-1.0μm×2.0-3.5μm。芽孢椭圆，次端生或端生，大小可变。革兰氏染色反应可变，运动。在葡萄糖培养基中大多数菌株能在无氧条件下活跃地生长，直到ph降低至5.3-4.8才不活跃。少数菌株在厌氧条件下不生长。厌氧发酵产物主要是L(+)乳酸，尚有少量甲酸、乙酸和乙醇，比例为2：1：1。在某些菌株中硝酸盐可促进厌氧生长，并产气。有些菌株则无此作用或仅还原至亚硝酸盐。最低的营养需求菌株间差异很大。 芽孢的抗热性及对其他不利环境的抗性比芽孢杆菌属的其他中温的任何种都强。营养细胞对不利条件就明显敏感，如冷至室温其生活力可能立即丧失。（最低生长温度30-45℃）。因此鉴定时必须注意此特征。 可在下列生境场所发现这种菌：土壤、沙漠沙土、热温泉、海洋沉积物、堆肥和食物等。其营养细胞在许多食物中，如ph>5.0和合适的温度下能很快地萌发和生长，可造成罐头食品的“平酸”。 7、左旋乳酸芽孢杆菌左旋乳酸芽孢杆菌（Bacillus laevolacticus），细胞宽0.4-0.7μm，芽孢椭圆形0.6-0.8μm × 0.8-1.2μm胞囊略膨大，运动。 生长要求葡萄糖和其他碳水化合物，从葡萄糖产酸不产气，主要产D(-)乳酸。 肽聚糖侧链直接与二氨基更二酸相连。甲基醌主要是MK-7。细胞脂肪酸为反异C15:0和C17：0脂肪酸。分离自植物根际。 8、消旋乳酸芽孢杆菌消旋乳酸芽孢杆菌（Bacillus racemilacticus），葡萄糖同型发酵产生DL-乳酸。 左旋乳酸芽孢杆菌和消旋乳酸芽孢杆菌两个种是Nakayama和Yanoshi（1967）报道的，在伯杰氏细菌学手册内列入芽孢杆菌属后面的位置未定种。 9、气球芽孢杆菌气球芽孢杆菌（Bacillus vesicuiferous），Trinkμmuite等（1987）报道了一个形成气胞的生芽孢的产乳酸的新种。这个种的菌株分离自龙虾的肠道。 五、主要价值芽孢杆菌在制剂中以内生孢子的形式存在，孢子进入肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌活性很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，拮抗肠道内的氧气，造成厌氧环境，有利于维持肠道生态平衡。该类菌无毒性，能分泌出活性强的蛋白酶等多种酶类，在其生命过程中又能以孢子体形式存在，具有耐高温、耐盐碱、耐挤压、饲料加工对其损伤小等特性，易于生产和保存，作为饲料微生态添加剂和水体微生态调控剂都有广阔前景。芽孢杆菌制成的产品有促菌生（蜡样芽孢杆菌）、整肠生（地衣芽孢杆菌）、抑菌生（枯草芽孢杆菌）、乳康生（含蜡样芽孢杆菌）。 在芽孢杆菌属中也有不少能产乳酸的细菌，其中还有在经济上重要的种。对于这些产乳酸的芽孢杆菌应该属于乳酸细菌的范畴之内。这些种的共同特征：细胞杆状，形成内生芽孢。通常同型发酵产乳酸。接触酶大多为阳性。 六、主要危害大多数芽孢杆菌属细菌是无害的，但有一些对人和动物是有致病性的。蜡样芽孢杆菌可引起食物中毒，症状与金黄色葡萄球菌食物中毒相似。一些菌株在食物中可产生耐热性毒素，该毒素与芽孢萌发有关，在被食入后1-5 h出现呕吐症状。其他菌株产生不耐热肠毒素，在食入后10-15 h内引起腹泻。已知蜡样芽孢杆菌在免疫受损患者引起菌血症以及其他症状如呕吐和腹泻。炭疽杆菌可引起人和动物炭疽。 芽孢杆菌属感染与食用各种食物有关，尤其是米饭、意大利面条、蔬菜以及未加工的牛奶和肉制品。摄入微生物或微生物产生的毒素均可致病。饮用水作为致病性芽孢杆菌（包括蜡样芽孢杆菌）的感染源尚缺乏证据，芽孢杆菌属胃肠炎的水源性传播也未被证实。

              粪大肠菌群质控样品使用说明与检验方法！粪大肠菌群是大肠菌群的一种，又名耐热大肠菌群。是指一群好氧及兼性厌氧,在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌大肠菌群。一、基本信息平台编号：bio-81679英文名称：Fecal coliform中文名称：粪大肠菌群质控样品(定量) 模式菌株：模式菌株 需氧类型：好氧注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、样品说明1、测试项目：粪大肠菌群。2、样品形式：冻干菌粉，包装于真空西林瓶内。3、样品保存：收到样品后立即按照产品证书中推荐的储存温度保存。4、样品复溶：样品需要用总计 40mL 稀释液再水化。样品开启后，立即加入 3-4mL 稀释液，待溶解后吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，即为待测样品原液，最小取样量为 25mL。三、注意事项1、收到样品后，请按照产品标签标注的储存条件保存。2、从冰箱中取出的样品需在室温平衡 30-60min 再使用。3、西林瓶内样品处于真空状态，开启时要小心。4、从开启样品到测试结束均应按照无菌操作进行。5、冻干粉末状态的样品为一个样品单元，是不可分割的整体，勿取其中一部分测试。6、稀释液可以用生理盐水或磷酸盐缓冲液。7、用稀释液溶解样品时，必须在西林瓶中进行，不允许将西林瓶中的样品（冻干菌粉）倒出西林瓶再水化。8、样品中含有活的微生物（可能含有致病微生物），请不要直接用手接触西林瓶内样品，请在符合生物安全规定的条件下操作。9、培养过程中请随时观察检测结果并予以记录。四、在环境污染中的表现形式与存在方式粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示海洋中有否粪便污染。受粪便污染的海洋含有大量的这类菌群。粪大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小，若检出粪大肠菌群即表明已被粪便污染，成为健康风险的指标，从而间接了解海洋是否存在有病原菌的危险性以便及时采取措施进行治理和防护。粪大肠菌群的对海滨浴场的污染，尤其在暑期，海域人数激增，浴场海水受到污染，会有一些肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌等），存在传染性疾病传播的可能，对海浴者身体健康造成影响；受污染的海域内，部分养殖区生物体内粪大肠菌群数量严重超标，这些经济生物被人类食用，危害人体健康。五、粪大肠菌群的检验方法(一)粪大肠菌群与大肠菌群的关系根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法(GB4789．3—94)，粪大肠菌群(Fae—cal coliform)系指一群能在44 ℃24 h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。表5—3中的大肠艾希氏菌I型即属粪大肠菌群。粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此，唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被检样品中，如果有粪大肠菌群存在，则在大肠菌群检验中也被计入。因此，也有将大肠菌群数称为总大肠菌群数者。近年来，曾有人建议采用大肠菌群和粪大肠菌群两种细菌作为食品卫生学的指标菌，如果大肠菌群和粪大肠菌群均高，一般多考虑为近期污染；如果大肠菌群数高，而粪大肠菌群数低，则应着重考虑粪便的远期污染，这在一定条件下，对污染的来源以及工艺学意义可作出恰当的判定。(二)检验步骤1、校样的稀释同大肠菌群。2、44℃乳糖发酵试验将检样以无菌操作接种于乳糖胆盐发酵管内(1 mL以上者1 mL及1 mL以内考，用单料乳糖胆盐发酵管)，置(44土0.5) ℃水浴内，培养(24土2) h。经培养后，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为阴性；如果有产气者，则按下列程序进行。3、证实试验将所有产气发酵管，分别按种在伊红美蓝琼脂平板上．并同时接种蛋白陈水，置(44土0.5) ℃培养24 h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长，粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上菌落呈紫黑色，有金属光泽，同时做革兰氏染色镜检。在蛋白陈水内加入靛基质试剂约0.5 mL，观察靛基质反应。4、结果评定凡靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。5、报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告100 mL(g)粪大肠菌群的最可能数。（三）大肠菌群快速检验大肠菌群检验方法(国标)采用发酵法(乳糖发酵试验、分离培养、证实试验)，需3 d。为了方便食品卫生快速监测的实际需要，多年来大肠菌群科研协作组曾在这方面进行了大量研究，并取得了一定成绩。1985年5月在西宁召开了大肠菌群快速检验方法会议，总结了近年来我国大肠菌群快速检验方面的经验，通过24个单位1099件样品(包括乳与乳制品、冷饮、肉制品、豆制品、调味品、啤酒、糕点等)的统计分析，可以认为当前国内应用的三种快速检验方法(TTC显色法、DC试管法和纸片法)的准确性和符合率均高，与发酵法结果相近，并具有快速、简便等优点，18 b一24 h可报告结果。三种快速检验方法在检验结果上与发酵法均无显著差异，且三法各有其持点，在实际工作中，可根据具体情况选作韧筛之用。

        人胰腺癌相关成纤维细胞的培养步骤与注意事项！一、细胞简介平台编号：bio-108890规格：5*10e5拉丁属名：人胰腺癌相关成纤维细胞（永生化）细胞名称：人胰腺癌相关成纤维细胞（永生化）组织来源：胰腺癌相关成纤维细胞污染：HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌检测阴性。培养条件：Atmosphere: Air, 95%; CO2, 5%。Temperature: 37℃细胞冻存：Freeze medium: FBS/NBS, 92%;DMSO, 8%（for reference）Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、细胞详述癌组织由实质和间质两部分构成，癌细胞构成癌实质，是癌的主要成分，具有组织来源特异性，癌间质一般由结缔组织和血管组成，起支持和营养癌实质的作用，不具有特异性。当实体瘤超过1-2mm时，需要通过新生的血管和活化的癌相关成纤维细胞来获取癌细胞生长和增殖所必须的营养物质。其中，癌相关成纤维细胞可通过分泌多种细胞因子和生长因子来发挥促进癌血管生成的作用。上皮间质转化（EMT）是一种胚胎发育期的表型转化，在肿瘤转移过程中也能观察到相似的EMT过程。而由上皮和间质相互作用所形成的肿瘤-宿主界面微环境的平衡状态直接决定肿瘤的发生发展。多种因素可影响该界面，其中癌相关成纤维细胞是数量最丰富的基质细胞，在调节肿瘤细胞EMT过程中发挥重要作用。它通过细胞与细胞间相互接触及分泌各种细胞因子、蛋白酶类等，促进上皮细胞及其细胞恶性转化，并对界面各组分产生重要的调控作用。该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。三、细胞特性1）细胞来源于人手术胰腺癌组织。2）不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。3）细胞生长方式：长梭形，贴壁培养。四、产品的运输和保存视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。1) 1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。2) T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。五、产品使用1) 本产品仅能用于科研2) 本产品未通过直接用于活体动物和人的审核3) 本产品未通过用于活体诊断的审核六、细胞的培养步骤1、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。（2）加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。（3）按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。（4）将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。2、细胞复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。 2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。七、注意事项1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

                  为全球生物安全治理贡献中国方案！百欧博伟生物：近期，中国科学家与国际同行一道，讨论达成了《科学家生物安全行为准则天津指南》，并得到国际科学院组织核可。这份指南涵盖了负责任生物科研的主要方面，提出了坚守道德基准、遵守法律规范、倡导科研诚信、尊重研究对象、加强风险管理、参与教育培训、传播研究成果、提升公众参与、强化科研监管、促进国际合作等准则。这是国际社会推广负责任生物科研取得的最新成果。负责任生物科研是国际前沿问题，也是全球生物安全治理的重要议题，《禁止生物武器公约》、世界卫生组织框架下的讨论由来已久。中国早在2015年就首倡制定科学家生物安全行为准则，并本着开放务实、合作共赢的精神，推动多边讨论进程，受到国际社会积极评价。科技是发展的利器，也可能成为风险的源头。生物科技对保障、促进人类健康与福祉发挥着巨大作用。做好、管好生物科研，既充分释放潜力和红利，又避免被误用或滥用，符合国际社会的共同利益。各国生物科技水平、科研管理实践不一，但促进生物科技发展、筑牢生物安全防线的决心别无二致。《天津指南》根植于中国倡议，凝聚了国际共识，拿出了金点子，贡献了新方案，可以说是正当其时。制定者们鼓励各国科学家、研究机构和政府部门自愿采纳，国际科学院组织在核可信中也鼓励各国科学院组织积极推广并采纳《天津指南》。相信这份指南对所有利益攸关方都会有所裨益。生物安全无国界，倡导负责任生物科研离不开各国政府和科学界的共同努力。中国天津大学、美国约翰斯·霍普金斯大学、国际科学院组织秘书处牵头，21国科学家共同参与了《天津指南》的制定，展现出了良好的专业素养及合作精神。这让我们看到了合作的力量、科学的力量。这也再次说明，面对全球性问题，只有加强互信、深化合作，才能找到行之有效的解决方案。中国倡议源于中国实践。中国高度重视生物安全，把生物安全纳入国家安全体系，不断提高国家生物安全治理能力。中国一贯倡导负责任的生物科研，建立了行之有效的监管和自律体系，形成了浓厚的负责任科研文化。今年4月施行的《生物安全法》集中体现以人为本的立法原则，使生物技术更好地服务于国家发展、人民幸福、人类文明进步。中国将继续秉持人类命运共同体理念，统筹发展和安全，深入参与全球生物安全治理，贡献中国智慧，提出中国方案，同国际社会一道，不断提升全球生物安全水平，促进普遍安全和共同发展。

             黏质沙雷氏菌的使用方法和要求及注意事项！黏质沙雷氏菌是一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。一、菌种简介平台编号：bio-00007规格：冻干粉拉丁属名：Serratia marcescens菌株名称：黏质沙雷氏菌用途：《中华人民共和国药典》灭菌法保存条件：常温批号：41002-14生物安全等级：1性状：乳白或白色、冻干粉包装：菌种管注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、使用方法和要求1、培养基：普通营养琼脂（培养基 51）或适宜培养基。2.、培养条件：30℃，需氧。3.、启开方法：1) 复苏菌种前应准备各适于该菌种生长的固体、液体培养基和培养设备，所有操作均应在合适的生物安全防护条件下进行；2) 启开菌种宜采用锯开法(锯开前用 75% 酒精棉消毒菌种管外壁)。用吸管将液体培养基 0.5ml 左右注入被启开的菌种安瓿中并吹打，使安瓿中的冻干菌种溶解成菌悬液；3) 将上述菌悬液全部吸出，分别接种到固体斜面和液体培养基中，于 30℃培 养箱中培养 18~24 小时；4) 次日观察菌种的生长情况，如菌种未生长，应继续培养至 72 小时；5) 复苏后的菌种按规定使用。三、储藏条件：暂不启开的安瓿可置于 2~8℃保藏。四、注意事项1、该菌种仅限用于实验室检验及研究用，不能用于商业用途。2、如使用该菌种发表文章，应在文章中注明。3、本中心仅对从本中心直接获取菌种的客户负责。北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                       大鼠胰岛细胞的背景与应用！一、背景大鼠胰岛细胞采用胶原酶灌注消化法结合密度梯度离心法制备而来，细胞经DTZ染色鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。大鼠胰岛细胞分离自胰腺组织；胰腺分为外分泌腺和内分泌腺两部分。外分泌腺由腺泡和腺管组成，腺泡分泌胰液，腺管是胰液排出的通道。胰液中含有碳酸氢钠、胰蛋白酶原、脂肪酶、淀粉酶等。胰液通过胰腺管排入十二指肠，有消化蛋白质、脂肪和糖的作用。内分泌腺由大小不同的细胞团──胰岛所组成，胰岛主要由4种细胞组成：α细胞、β细胞、γ细胞及PP细胞。α细胞分泌胰高血糖素，升高血糖；β细胞分泌胰岛素，降低血糖；γ细胞分泌生长抑素，以旁分泌的方式抑制α、β细胞的分泌；PP细胞分泌胰多肽，抑制胃肠运动、胰液分泌和胆囊收缩。胰岛细胞作为糖尿病新药的细胞筛选模型需保持其结构完整、生理功能稳定和足够长的存活时间。胰岛占胰腺总质量的1%-2%，每个胰岛大概含有1000个细胞。胰岛移植可消除常规治疗产生的严重低血糖症状，具有创伤小及并发症少等优点，是最有前景的Ⅰ型糖尿病治疗方案。移植胰岛的获得需经过供体筛选、胰腺消化、胰岛分离纯化及结果鉴定等步骤，分离纯化效果取决于原料及操作方法的选择。二、应用用于降糖三黄片对大鼠胰岛细胞凋亡通路影响的研究：通过观察不同浓度剂量的降糖三黄片对IL-1β诱导的原代大鼠胰岛细胞凋亡的影响,探讨降糖三黄片对死亡受体Fas/FasL的作用途径,探索降糖三黄片治疗和改善胰岛细胞损伤和凋亡的作用机制。方法：使用胆总管逆行灌注、胶原酶V原位消化及Ficoll梯度离心方法从正常SD大鼠胰腺分离纯化获得原代胰岛细胞；IL-β作用胰岛细胞24h后,使用MTT法选择对胰岛细胞具有保护作用的降糖三黄片有效药物浓度；RT-PCR法检测降糖三黄片对IL-1β诱导下细胞内FasmRNA、BaxmRNA、Bcl-2mRNA表达的影响；Western Blot法检测降糖三黄片对IL-1β干预后细胞内Fasl、Cyto-c、capase-3蛋白表达的影响。结果：1、本实验中使用胆总管逆行灌注、胶原酶V原位消化及Ficoll梯度离心方法从正常SD大鼠胰腺分离纯化获得胰岛细胞,并选用11.lmmol/L葡萄糖浓来度培养细胞。通过测量胰岛素释放量,可制备出细胞形态及功能良好的原代大鼠胰岛细胞。2、IL-1β作用于胰岛细胞24h后,采用MTT法选择对胰岛细胞具有保护作用的降糖三黄片有效药物浓度,遴选出低（50μg/ml）、中（100μg/ml）、高（200μg/ml）三组剂量。3、IL-1β与胰岛细胞和共同培养24h后RT-PCR检测发现与空白对组相比IL-1β刺激下胰岛细胞中FasmRNA及BaxmRNA的表达升高、Bcl-2mRNA的表达降低（P北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                痢疾志贺氏菌的使用方法与操作流程！痢疾志贺氏菌是志贺氏菌属的模式种。至少有1Q个血清型，称为“亚群A0o这些菌株不发酵甘露醇，蔗糖或乳塘。除血清型I外.其它血清型都产生过氧化氢酶。血清型I产生外毒素。一、菌种简介平台编号：bio-00013规格：冻干粉拉丁属名：Shigella dysenteriae菌株名称：痢疾志贺氏菌保存条件：常温,避光批号：51252-9生物安全等级：2性状：乳白或白色冻干粉包装：菌种管用途：教学注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。储藏条件：暂不启开的安瓿可置于 2~8℃保藏。二、使用方法和要求1、培养基：普通营养琼脂（培养基 51）或适宜培养基。2、培养条件：35~37℃，需氧。3、启开方法：1) 复苏菌种前应准备各适于该菌种生长的固体、液体培养基和培养设备，所有操作均应在合适的生物安全防护条 件下进行；2) 启开菌种宜采用锯开法(锯开前用 75% 酒精棉消毒菌种管外壁)。用吸管将液体培养基 0.5ml 左右注入被启开的菌 种安瓿中并吹打，使安瓿中的冻干菌种溶解成菌悬液；3) 将上述菌悬液全部吸出，分别接种到 固体斜面和液体培养基中，于 35~37℃培养箱中培养 18~24 小时；4) 次日观察菌种的生长情况，如菌种未生长，应继续培养至 72 小时；5) 复苏后的菌种按规定使用。三、使用范围（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，酿酒酵母菌组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。 （2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。 （3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 四、操作流程 菌株复苏：（按三区划线法将留菌管内的原始菌株进行复苏） 1) 所有菌株，显色培养基分4区，每区一株，标明菌株号、菌种名常用缩写如下： cal: 白念珠菌 cgl：光滑念珠菌 cpa: 近平滑念珠菌 ctr: 热带念珠菌 ckr: 克柔念珠菌 cne: 新型隐球菌，其他菌种标记全名。 2) 隐球菌除传显色培养基以外，另传1/2块血平皿上述菌株统一37oC孵育48h 菌种鉴定：（48h后观察结果）。五、注意事项1、该菌种仅限用于实验室检验及研究用，不能用于商业用途。2、如使用该菌种发表文章，应在文章中注明。3、本中心仅对从本中心直接获取菌种的客户负责。

              醋酸菌的生长要求与分离鉴别及主要用途！醋酸菌是重要的工业用菌之一。醋酸菌的细胞为椭圆至杆状；单个、成对或成链；端毛或周毛；运动或不运动；革兰氏阴性；专性好氧菌，氧化各种有机物成有机酸及其它种氧化物。一般在乙醇或其它可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基上生长旺盛。 一、菌株简介醋酸杆菌属的重要的特征是能将乙醇氧化成醋酸，并可将醋酸和乳酸氧化成CO2和H2O。有些菌株能够合成纤维素，其纤维素组成细胞壁外的基质，而细菌则埋置于纤维索微丝缠结的片层中。当这些种的细菌生长在静止的液体培养基中，它们就会在表面形成一层纤维素薄膜。 醋酸菌是一种原核生物，以二分裂的形式用来增殖。自然界中的醋酸菌分布广泛，在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面以及未灭菌的醋、果酒和啤酒中都有生长。代谢类型属于异养需氧型，故在发酵过程中一直需要氧气的参与。醋酸菌在发酵工程中常用来酿醋。二、菌株分类醋酸菌作为一类革兰氏阴性、好氧的杆菌，从其发现至今，其分类地位和名称较为混乱，经过了多次的变更和修订。早期的研究把醋酸菌归类为一个属，即醋酸杆菌属（Acetobacter）。 Frater通过不同的生化标准，把该属细菌分成四个亚组：过氧化葡萄糖杆菌亚组（ peroxydans）、氧化葡萄糖杆菌亚组（ oxydans）、半氧化葡萄糖杆菌亚组（ mesOxydans）和弱氧化葡萄糖杆菌亚组（suboxydαns）。随后， Leifson（1954）把醋酸分为两个属：（1）醋酸杆菌属（ Acetobacter），该属细菌有周生鞭毛并能氧化醋酸；（2）醋单孢菌属（Aeeomnas），该属细菌杆极生鞭毛不能氧化醋酸。而Asαi等（1958）则把醋单孢菌属（Acetomonas）更名为葡萄糖杆菌属（ Gluconobacter）。 《伯杰细菌鉴定手册》（第八版，1974）接受了醋酸菌的两属分类，即醋酸杆菌属（不运动或借助周生鞭毛运动）和葡萄糖杆菌属（不运动或借助极生鞭毛运动）。并把葡萄糖杆菌属归类于假单孢菌科（ Pseudomonadaceae），而醋酸杆菌属不属于任何一个科，单列属。 《伯杰细菌系统学手册》（第九版，1984）最终把这两个属归于一个新的科―醋酸杆菌科（ Acetobacteraceae），该科细菌独有的特征是能把酒精氧化成醋酸。其中醋酸杆菌属包括四个种：醋化醋杆菌（Acetobeαcer αceti）、汉逊氏醋杆菌（ Acetobacter hansenii）、液化醋杆菌（ Acetobacter liquefaciens）和巴氏醋杆菌（ Acetobacter pasteurianuma）；葡萄糖杆菌属只有一个种，即氧化葡萄糖杆菌（ Gluconobαcter oxydans）。醋酸杆菌科两个属的区杆在于醋酸杆菌属细菌能把酒精氧化成醋酸并把醋酸氧化成H2O和CO2而葡萄糖杆菌属只能把酒精氧化成醋酸。 鉴于对醋酸菌分类学研究的不断深入，1993年，在《伯杰细菌系统学手册》（第九版）的基础，出版了《伯杰细菌鉴定手册》（第九版）。该手册仍然保留了醋酸菌的两属分类，只是增加了科数。手册把醋酸杆菌属的种数增加了3个（使该属细菌种数达到7个），分别是：重氮营养醋杆菌（ A. diazotrophicus），该种的细菌可以生长于30%的D-葡萄糖的培养基中；甲醇醋杆菌（A. methanolicus），可以以甲醇作为碳源；胶醋酸菌（A. xylinum），该种细菌分离自醋能够在液面产生一层厚的、似革质的纤维素菌胶膜。胶醋酸菌和醋化醋杆菌非常相似，区别在于前者能够在CaCO3-酒精培养基上生长而后者不能。手册把葡萄糖杆菌属的种数也增加了2个种（使该属细菌种数达到3个），即弗氏葡萄糖杆菌（C. frateurii）和浅井氏葡萄糖杆菌（G. asai）、其中弗氏葡萄糖杆菌可以以核糖醇做碳源，而浅井氏葡萄糖杆菌生长需要烟酸。  根据日本朝井勇宣分类，醋酸杆菌依其发育最适温度和特性分为两大类：一类发育适温在30℃以上，氧化酒精为醋酸的称为醋酸杆菌；一类发育适温在30℃以下，氧化葡萄糖为葡萄糖酸的称为葡萄糖氧化杆菌。 （1）醋酸杆菌属。在比较高的温度下39-40℃，可以发育，增殖的适温为30℃以上，主要作用是氧化酒精为醋酸，亦能氧化葡萄糖生成少量的葡萄糖酸，并可继续氧化醋酸为二氧化碳和水。 （2）葡萄糖氧化杆菌属。这属菌能在比较低的温度下（7-9 ℃）发育，增殖的适温在30℃以下。主要作用是氧化葡萄糖为葡萄糖酸，亦能氧化酒精生成少量醋酸，但不能氧化醋酸为二氧化碳和水。 三、细胞形态细胞椭圆形至杆状，直或稍弯曲，以单个、成对或成链存在。有些菌株经常出现中出现退化类型。以周生鞭毛或侧生鞭毛运动，或不运动。菌落灰白色，大多数菌株不产生色素，少数菌株产生褐色水溶性色素，或由于细胞内含卟啉而使菌落呈粉红色。模式种为醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）。 四、生长要求醋酸菌为好氧菌，在实施液体静置培养时，会在液面形成菌膜，但葡萄糖氧化成杆菌时不形成菌膜。在含有较高浓度乙醇和醋酸的环境中，醋酸杆菌对缺氧非常敏感，中断供氧会造成菌体死亡。醋酸菌生长繁殖的适宜温度为28℃-33℃。醋酸菌不耐热，在60℃下经10min即死亡。醋酸菌生长的最适pH为3.5-6.5，一般的醋酸杆菌能耐受醋酸达7%-9%。醋酸杆菌对酒精的耐受力颇高，酒精浓度可达到5%-12%（体积分数），但对食盐的耐受力很差，当食盐浓度超过1%-1.5%时就停止活动。在生产中当醋酸发酵完毕时就添加食盐，其目的除调节食醋滋味外，也是防止醋酸菌继续作用，将醋酸氧化为二氧化碳和水的有效措施。 对醋酸菌最适宜的碳源是葡萄糖、果糖等六碳糖，其次是蔗糖和麦芽糖等。醋酸菌不能直接利用淀粉等多糖类。酒精也是很适宜的碳源，有些醋酸菌还能以甘油甘露醇等多元醇为碳源。蛋白质水解产物、尿素、硫酸铵等都适宜于人作为醋酸菌的氮源至于矿物质，必需的有磷、钾、镁三种元素。由于配制食醋的原料一般是粮食，即使用代用原料，其淀粉、蛋白质、矿物质的含量也很丰富，营养成分已能满足醋酸菌的需要，除少数酿醋工艺外，一般不再需要另外添加氮源、矿物质等营养物质。 五、酶系特征醋酸菌有相当强的醇脱氢酶、醛脱氢酶等氧化酶系活力，因此除能氧化酒精生成醋酸外，还有氧化其他醇类和糖类的能力，生成相应的酸、酮等物质，例如：丁酸、葡萄糖酮酸、木糖酸、阿拉伯糖酸、丙酮酸、琥珀酸、乳酸等有机酸，以及氧化甘油生成二酮、氧化甘露醇生成果糖等。醋酸菌也有生成酯类的能力，接入产生芳香酯多的菌种发酵，可以使食醋的香味倍增。上述物质的存在对形成食醋的风味有重要作用。 六、分离鉴别醋酸为挥发酸，有醋的气味，其钠盐、钙盐等溶液与三氯化铁溶液共热时，生成红褐色沉淀，原液体变成无色，可以此进行分离菌的鉴别。醋酸菌转化乙醇生成乙酸的能力可用0.1mol/LNaOH滴定。 七、常用菌种在工厂，为了提高产量和质量，避免杂菌污染，一般采用人工纯接种的方式进行发酵。由于醋酸菌种类不同，其对酒精的氧化能力也有差异。在实际生产中，选择菌种是很重要的工作，最好选用氧化酒精速度快、不再分解醋酸、耐酸性强、产品风味好的菌种。在食醋生产中，常见的有纹膜醋酸菌（A.aceti）、许氏醋杆菌（A. schutzenbachii）、奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanense）、胶膜醋酸杆菌（A.xytinum）、恶臭醋杆菌（A.rancens）、混浊变种（中科AS 1.41）、巴氏醋酸菌（A. pasteurianus）、巴氏亚种（沪酿1.01）等，采用纯醋酸菌种发酵的，使用最多的是恶臭醋杆菌、混浊变种、巴氏醋酸菌、巴氏亚种这4种醋酸菌。 1、奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanense）法国奥尔兰地区用葡萄酒生产醋的主要菌株是奥尔兰醋酸杆菌。它能产生少量的酯，产醋酸的能力弱，但耐酸陛较强，能由葡萄糖产5.26%葡萄醋。 2、许氏醋酸杆菌（A.schutzenbachii）许氏醋酸杆菌是国外有名的速酿醋菌种，也是制醋工业较重要的菌种之一，产酸可高达115g/L（以醋酸计）。最适生长温度25-27.5℃，在37℃即不再产醋酸，对醋酸没有进一步的氧化作用。 3、恶臭醋杆菌（A.rancens）这是我国食醋生产使用的菌种之一。它在液面形成皱褶的皮膜，菌膜沿容器壁上升，液不混浊。一般能产酸60-80g/L，有的菌株能产20 g/L。葡萄糖酸，能把醋酸进一步氧化为二氧化碳和水。 4、攀膜醋杆菌（A.ascendens）酿造葡萄酒、葡萄醋的有害菌。在醋醅中常能分离出，在液面形成易破碎的菌膜，沿容器壁上升得很高，液很混浊，不适于酿醋使用。 5、胶膜醋杆菌（A.xytinum）一种特殊的醋酸菌，在液面上形成一层皮革状的类似纤维素的厚膜。在酒类的醪液中繁殖，可引起酒酸败、变黏，生酸能力弱，又能再分解醋酸，是酿醋的有害菌。 6、中科AS 1.41醋酸菌该菌对培养基要求粗放，在米曲等培养基中生长良好，专性好气，能氧化酒精为醋酸，于空气中能使酒精变混浊，表面有薄膜，有醋酸味，也能氧化醋酸为二氧化碳及水，繁殖的适宜温度为31℃，发酵温度一般控制在36-37℃。7、沪酿1.01醋酸菌沪酿1.01醋酸菌属于巴氏醋酸杆菌的巴氏亚种。该菌是在1972年从丹东速酿醋中分离而得的，在上海酿造科学研究所实验工厂及上海醋厂投产使用，现已被全国许多醋厂用于液体醋生产。其细胞0.3-0.55μm，专性好气菌，在酵母膏葡萄糖淡酒琼脂培养基上的菌落为乳白色；酒精静置培养表面形成不透明的薄膜。 八、分布范围醋酸杆菌分布在花、果实、棕榈油、葡萄酒、啤酒、苹果汁、醋和果园土等环境中。产醋酸多的氧化醋酸杆菌存在于未杀菌的醋、黄酒、啤酒（传统发酵）、果酒、酒糟、大曲等中。 九、主要用途醋酸菌是重要的工业用菌之一。酿造工业用它来生产食醋。 十、主要危害可以引起菠萝的粉红病和苹果、梨的腐烂病。它是酿酒工业的害菌。

                    小鼠腹腔巨噬细胞的主要获取方法！小鼠腹腔巨噬细胞的主要获取方法从小鼠腹腔提取，现有的提取方法有两种，一种是直接腹腔灌洗后贴壁培养；另一种是先向小鼠腹腔内注射刺激物制造无菌炎症环境以积聚巨噬细胞，再灌洗腹腔获取细胞并贴壁培养。直接灌洗腹腔所得的细胞数量甚少，并不是理想的提取方法。以炎症刺激巨噬细胞聚集再灌洗所得的细胞一直以来被认为是炎性甚至变异的，而对于上述两种方法提取的小鼠腹腔巨噬细胞之间的生物学差异有待进一步研究。３％巯基乙酸盐肉汤诱导法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞方法：选取 3２只健康昆明小鼠，随机分为 ４组，每组 ８只，分别采用以下 ４种不同方法获得腹腔巨噬细胞：ＰＢＳ直接灌洗小鼠腹腔（ＰＢＳ组）；含 １０％血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养液注入小鼠腹腔，３０ｍｉｎ后灌洗小鼠腹腔（培养液组）；６％淀粉肉汤注入小鼠腹腔，每天 １次，３ｄ后以 ＰＢＳ灌洗腹腔（淀粉肉汤组）；３％巯基乙酸盐肉汤注入小鼠腹腔，每天 １次，３ｄ后以ＰＢＳ灌洗腹腔（巯基乙酸盐组）；将各组所获细胞分别转入含 １０％血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养基中贴壁培养，比较细胞形态、数量、吞噬能力、纯度以及活性。牛磺酸对小鼠腹腔巨噬细胞功能调节作用方法：收集小鼠腹腔巨噬细胞, 调整细胞浓度为2×105/mL, 分为5组, 即正常对照组, LPS对照组 (LPS终浓度为1μg/mL) 和低、中、高牛磺酸剂量组 (牛磺酸的终浓度分别为5、50和500μg/mL) , 培养24 h后ELISA法检测细胞上清中IL-12、TNF-α、IL-1、IL-6含量;瑞氏染色法检测并计算巨噬细胞对白色葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数、Griess法检测吞噬葡萄球菌后细胞上清中NO的含量。结果 各剂量牛磺酸组的腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-6含量均高于正常对照组 (P 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

              食品中菌落总数检测能力的验证操作过程！百欧博伟生物：菌落总数的测定方法，看似非常简单，但由于食品种类繁多，食品中可能存在的微生物菌群较多，要在同等条件下把所有的细菌培养出来，反应样品的真实情况，实属不易。一、能力实验的目的开展能力验证试验是检验实验室检测能力和提高检测水平的重要手段。利用实验室间的比对，对实验室的校准或检验工作进行判定。关键是，能力验证是考察实验室检验能力的外部质量活动，组织方提供试验样本，在菌落总数项目上，一般会考虑增加上述难度。二、测定标准食品国家标准：GB 4789.2-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》三、操作过程1、前期做好充足的准备工作：根据国家标准，提前准备好要用的平板计数琼脂、平皿、试管、稀释液（生理盐水）、三角烧瓶等。2、样品接受：收到样品后，确认样品包装是否完好，并将其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力验证平台进行确认。3、样品处理：按照作业指导书操作（一定要仔细阅读作业指导书）看看是几个样品及实验记录要求。一般实验室收到的是干粉样品或者是固体样品等。假如收到的是干粉样品，那么第一步就要水化。样品水化步骤（建议）：一般能力验证样品以国体粉末形式发放，以液体（CFU/mL）形式出报告。样品水化前一定要认真、仔细阅读作业指导书，看看用多少稀释液水化，水化后作为原液还是多大浓度的样品来记录。4、实验前准备：（1）能力验证时最好在超洁净台或者生物安全柜里操作，这样就要把超洁净台或者生物安全柜提前清理、消毒处理，确保实验环境无菌。（2）提前把要用到的平皿、试管、稀释液等放到操作台上。5、实验操作：（1）稀释将样品从冰箱中取出达到室温后开启使用，在超洁净台或者生物安全柜下先用少许稀释液（选取的生理盐水）进行水化后吸入无菌瓶或袋中，再用剩余的稀释液进行洗涤并全部转入无菌瓶或袋中。（具体公需多少稀释液要看作业指导书说明）洗涤转移时注意样品瓶盖的清洗和无菌操作，将全部的水化液进行均质混匀，一般作为原液立刻进行接种；再取25ml到225ml稀释液中均质混匀，制成10-1梯度样品匀液。用1ml无菌吸管取1:10的样液到9ml生理盐水试管中，制成1:100的样液，以此类推。再将几个稀释度的样液接种到提前做好标记的无菌平皿中。（2）倾注平板将提前在水浴锅里凉至46℃的平板计数营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。倾注过程一般左手拿平皿，右手拿琼脂瓶，左手将平皿打开30度左右的缝隙，倾注琼脂大约到平皿底的二分之一处，左三圈、右三圈轻轻混匀，然后放到台面上。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。（3）观察计数最好，第二天先看看，检测结果有没有异常、是否有蔓延菌落出现。按照GB 4789.2的要求进行菌落计数（4）上报数据在对结果进行分析后，选取检测结果的平均值进行网络提交。四、注意事项1、一般能力验证的样品添加的菌落浓度都比较搞，检测过程一定要多做几个稀释度，每个稀释度多做几个平板平行。2、梯度稀释：是关键步骤，必须尽可能地减少误差（新手建议涡旋混匀，涡旋时间不宜过长，长时间离心力等作用下，微生物细胞可能死亡）。3、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。4、倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。5、倾注过程力度一定掌握好，绝不能把琼脂减出来。6、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿时要尽可能放在中央部位，然后应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。7、琼脂瓶放水浴锅前一定要混合均匀，以防出现平皿不凝固现象；拿出倾注时要用喷有75%酒精的抹布擦拭干净。8、冷却的过程不要着急，冷却充分后再倒置放进培养箱培养，放置的时候要尽量避免放到风机口处，每摞不要超过6个平皿。9、检验结束后所有的稀释液样品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏，以备必须再用（一旦第二天发现实验做错了，在做一次实验，死马当活马医）。

                 副干酪乳杆菌的生产工艺及使用范围！副干酪乳杆菌经发酵培养、离心、急速冷冻、干燥、包装等步骤生产而成。一、菌种简介平台编号：bio-03644提供形式：冻干物拉丁属名：Lactobacillus paracasei中文名称：副干酪乳杆菌拉丁名称：Lactobacillus paracasei 属名：Lactobacillus种名：paracasei原始编号：2000-5菌株来源：←中国科学院微生物研究所保藏人：周宇光直接来源国家：中国保藏时间：1/11/2000生物危害：四类模式菌株：非模式菌株菌株用途：益生菌剂培养温度：37℃培养基：0006    分离源：保健品胶囊用途：益生菌剂注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用储存条件：冻干菌种和试管斜面请置于 6-10℃冷藏。二、培养条件MRS 培养基酪蛋白胨 10 克 牛肉浸取物 10 克酵母提取液 5.0 克 葡萄糖 20 克乙酸钠 5.0 克 柠檬酸二胺 2.0 克吐温 80 1.0 克 磷酸氢二钾 2.0 克七水硫酸镁 0.2 克 七水硫酸锰 0.05 克碳酸钙 20.0 克 琼脂 20.0 克蒸馏水 1.0 升 PH 6.8如果要配制液体培养基，则不用加入碳酸钙和琼脂三、生产工艺简述1、来源健康人体胃肠道2、分离基物酸奶3、培养基蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2克，硫酸镁0.2克，硫酸锰0.2克，吐温80 1毫升，水1000毫升，琼脂1.5～2.0%，pH6.2-6.6。四、使用范围乳制品、保健食品、饮料、饼干、糖果、冰淇淋。五、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。

                    人早幼粒急性白血病细胞的应用！一、背景人早幼粒急性白血病细胞由Collins SJ从一位患有急性早幼粒细胞性白血病的36岁白人女性的外周血中分离建立；可自发分化，或在丁酸盐、次黄嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸(PMA,TPA)、DMSO(1%to 1.5%)、放线菌素D和视黄酸的刺激下发生分化；PMA刺激后可分泌TNF-α。该细胞具有吞噬活性和趋化反应，癌基因myc阳性，表达补体受体和FcR。急性早幼粒细胞白血病是一种血癌，是由15号和17号染色体包含的遗传物质发生重组（易位）而诱发的。此种染色体易位，在医学上被记作t(15;17)，指的是15号染色体的PML基因中的某些遗传物质与17号染色体的RARA基因中的某些遗传物质发生的移位现象。在个体一生中的任何阶段，特定细胞中的某些基因突变都有可能发生。15号染色体包含的PML基因为某些蛋白质的合成提供遗传指令编码，该类蛋白质有抑制肿瘤生长的功能，即：此类蛋白质可阻止细胞恶性失控地生长或分化。PML蛋白可抑制恶性细胞的生长与分化，和其他蛋白质一样，可促进人体新陈代谢。17号染色体上的RARA基因，为生成转录因子（α视黄酸受体）提供遗传指令编码。转录因子是一类位于DNA特定区域的蛋白，有助于控制特定基因的某些遗传学表达活动。正常情况下，RARα蛋白控制着某些基因的转录过程，在早幼粒细胞阶段过后，这些基因对于白细胞的分化和成熟是至关重要的。PML-RARα合成蛋白会影响PML，RARα蛋白的原本发挥的正常功能。因此，某些血细胞在早幼粒阶段便会附着在一起，或是异常激增。多余的早幼粒细胞累积在骨髓中，而正常的白细胞却无法形成，从而导致急性早幼粒细胞白血病。二、应用用于急性髓系白血病Galectin-3表达及其意义研究：1、选择298例初诊非M3型急性髓系白血病患者、108例初诊急性早幼粒细胞白血病患者为研究对象,疾病的诊断及分型依据英法美（FAB）协作组及世界卫生组织（WHO）对AML的分型诊断标准,严格遵照纳入及排除标准。另外选择30例正常人作为对照组。2、血清Galectin-3蛋白测定采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者及正常人血清中Galectin-3蛋白表达水平操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。3、临床资料的回顾性分析对所有患者初诊时及序贯性治疗的病例资料进行回顾性分析,比较Galectin-3蛋白表达与临床特征、临床分期、实验室检查结果及治疗效果的关系。4、患者随访住院序贯性治疗的患者以其住院资料作为随访依据,结束治疗的患者院外随访多数通过电话,少数采用走访。非M3型急性髓系白血病研究组平均随访期为25.8个月,急性早幼粒细胞白血病研究组平均随访期为30.3个月。5、统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析,两组间均数比较采用t检验；率的检验采用卡方检验（样本量少时采用Fisher确切概率检验）；不同变量的相关性分析采用Spearman秩相关分析法；生存分析采用Kaplan-Meier方法,单因素分析采用log-rank检验,多因素分析采用Cox比例风险模型；以P结果：血清Galectin-3蛋白的表达情况非M3型急性髓系白血病患者血清Galectin-3蛋白表达水平明显高于正常人（5.40±4.31 vs 2.21±1.84 ng/ml;P急性早幼粒细胞白血病患者血清Galectin-3蛋白表达水平明显高于正常人（4.09±2.25 vs 2.21±1.84 ng/ml;P

                   聚多曲霉（萨氏曲霉）的功效作用及注意事项！                                    聚多曲霉，又名喜多式曲霉，属于散囊菌目发菌科曲霉属的一种真菌。可生长在土壤、粪、酒曲、食品、望远镜筒内壁及各种材料的基物上。聚多曲霉在形态上十分接近杂色曲霉，但形成暗蓝色的丝绒状菌落可资区别。本菌常易于在初看时误认为青霉，需用显微镜检查才能辨明。一、菌种简介平台编号：bio-52595规格：冻干物拉丁属名：Aspergillus sydowii (Bain. Et sart.) Thom et church中文名：聚多曲霉外文名：Aspergillus sydowii别名：喜多式曲霉其他编号：AS3.4258培养基编号：15培养温度：25-28℃用途：除光学含仪器外的防霉试验菌种。注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用保藏条件：安瓿瓶冻干菌种应在 2-8°C 保存。 二、培养基综合马铃薯培养基（PDA）20%马铃薯汁 1L 葡萄糖 20g MgSO4.7H2O 1.5g KH2PO4 3gVitanib B1 (硫胺素) Trace 微量约 8mg Agar (琼脂) 20g pH 自然20%马铃薯汁配制方法：马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块 , 加水 1000 毫升煮沸 20 分钟后滤去马铃薯块，将滤液补足 1000ml。 三、聚多曲霉(萨氏曲霉) 功效 1、分解出长石、云母等矿物中的钾、硅,也能分解出磷灰石中的磷,,具有溶磷、释钾和固氮功能,同时能在生长繁殖过程中产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等有利于植物吸收和利用的物质。2、本品在土壤中繁殖后,分泌植物生长刺激素及多种酶,以增强作物对一些病害的;也抑制其他病原菌的生长。3、菌体内的钾在菌体死亡后,游离出来,又可被植物吸收利用。作为微生物肥料中的一种重要功能菌,可提高土壤速效钾、磷含量,提高作物产量和品质等多种效 .四、聚多曲霉(萨氏曲霉) 特征特性 营养体:粗长杆状,两端钝圆,革兰氏染色反应不定,产生聚 β- *盐( PHB )颗粒。菌体大小为( 1.0 ~ 1.2 ) ×? ( 2.5 ~ 7.0 ) μm? ,菌体周围有厚荚膜。芽孢:壁厚,椭圆形,中生或近端生,芽孢囊不膨大或微膨大。菌落圆形,无色,隆起,胶质粘稠,透明或半透明,边缘整齐。好氧或兼性厌氧生长,水解淀粉,接触酶反应阳性,氧化酶和卵磷脂酶反应阴性,在无氮培养基上生长良好,生长温度 10?℃? ~ ?45?℃ 。五、聚多曲霉(萨氏曲霉) 特点 1、该菌具有解磷、解钾的功能。2、具有活化土壤中硅、钙、镁中量元素作用。  3、具有提高铁锰铜锌钼硼供应的功效。  4、提高或延长肥效,减少化肥用量。  5、提高作物抗逆性,预防或减轻病害。   六、聚多曲霉(萨氏曲霉) 使用方法生产符合行业标准的生物有机肥、复合微生物肥料(有效菌数 ≥0.2 亿 / 克)。以 100 亿 cfu/ 克为例,每吨有机肥添加 2000 克。本品可配合其他复混肥冲施,用量按 250-500 克 / 亩地。微生物菌肥用量：粉劑每噸添加膠質芽孢桿菌 20 公斤、顆粒加 10 公斤。 七、注意事项1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用 0.1-0.2ml 的培养液或无菌水溶解，接种在 2 支斜面，因冻干粉处于休眠状态，请勿接种多支斜面或平板，以避免因接种量不足而导致复苏不成功；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

               食用菌灰树花的生物学特性与栽培技术！灰树花，俗称“舞菇”，是食、药兼用蕈菌，夏秋间常野生于栗树周围。子实体肉质，柄短呈珊瑚状分枝，重叠成丛，其外观，婀娜多姿、层叠似菊；其气味、清香四溢，沁人心脾；其肉质脆嫩爽口，百吃不厌。其营养具有好的保健作用和很高的药用价值。近年来作为一种保健食品，风行日本、新加坡等市场。 一、形态特征灰树花子实体肉质，短柄，呈珊瑚状分枝，末端生扇形至匙形菌盖，重叠成丛，大的丛宽40～60厘米，重3～4公斤；菌盖直径2～7厘米，灰色至浅褐色。表面有细毛，老后光滑，有反射性条纹，边缘薄，内卷。菌肉白，厚2～7毫米。菌管长1～4毫米，管孔延生，孔面白色至淡黄色，管口多角形，平均每毫米1～3个。孢子无色，光滑，卵圆形至椭圆形。菌丝壁薄，分枝，有横隔，无锁状联合。灰树花在不良环境中形成菌核，菌核外形不规则，长块状，表面凹凸不平，棕褐色，坚硬，断面外表3～5毫米呈棕褐色，半木质化，内为白色。子实体由当年菌核的顶端长出。灰树花是一种中温型、好氧、喜光的木腐菌，夏秋季发生于栎树、板栗、栲树、青冈栎等壳斗科树种及阔叶树的树桩或树根上，造成心材白色腐朽，木质部成了灰树花的主要营养源。海拔800米以上，日降水量达200毫米的年份，灰树花发生较好。 二、生物学特性及对环境条件的要求1、营养灰树花是一种木腐菌, 同其他食用菌一样,在生长过程中需要从外界吸收营养, 对碳源、氮源等营养元素的要求与香菇、滑菇等的要求区别不大。在灰树花生长过程中可以适当多添加一些氮源物质。 2、温度在自然界中,灰树花多在夏秋季节生长。其菌丝生长的温度范围较广, 在3~32℃均可以生长。与一般食用菌相类似, 其最适合的温度为20~25℃。灰树花较耐高温, 在32℃时不会停止生长, 但此时菌丝较弱。灰树花原基形成的温度一般在18~22℃, 而子实体在10~25℃都可以生长, 其最适宜的生长温度为15~20℃。如果温度较低, 子实体生长较慢;在温度较高时，子实体生长则较快。 3、水分与空气湿度灰树花培养基中的水分 (含水量) 一般控制在60%~65%为好。在菌丝生长阶段空气相对湿度一般在60%~65%, 与培养基的含水量基本一致, 这一方面可以防止培养基中的水分散失, 另一方面也可以防止棉塞或封口纸受潮发霉。在子实体生长发育阶段,空气相对湿度应保持在85%~95%, 以90%为好。空气相对湿度低于80%, 会造成子实体原基干枯、死亡;而空气相对湿度过大, 子实体又容易腐烂。4、光照灰树花在菌丝生长阶段对光照要求不严, 在黑暗条件下, 菌丝生长要快一些, 但是, 如果没有光的刺激则不容易形成子实体厚基;当形成厚基后, 没有散射光照射, 原基不会变成灰黑色, 子实体也不会正常的生长发育。只有在光照正常的情况下, 灰树花的子实体才能正常分化和生长。光照不足, 使子实体分化困难, 菌盖多畸形, 色泽发白, 朵形也不正常。 三、栽培技术1970年，日本开始人工栽培，产量逐年提高，年产已超过万吨，市场鲜售价约每公斤1 000日元。由于供不应求，日本还要从中国进口一些。近十几年来，中国浙江、河北、四川、云南、福建、上海等地一些科研单位进行了引种驯化和实验栽培。浙江省庆元、河北省迁西等地区开始了规模化生产，北京市昌平黑山寨也曾种植。1、菌种制作不同菌种和菌种质量对灰树花的产量和质量有决定性的作用。有的菌种质量低劣，甚至干脆就不出子实体。因此一定要选用经生产验证，抗逆性强，生长快，产量高的优良菌种。无论是引进的或自己分离的菌种，在大规模扩接前都应进行出菇试验。灰树花母种适宜的培养基为PDA综合培养基和麸皮培养基，也可用谷粒培养基，按常规方法制作。这三种培养基可用于灰树花母种的分离和转扩，分离部位以灰树花菌盖与菌柄连接处的内部菌肉为佳。选择待分离株应是品系中分化好的健壮株，分离和转扩均在无菌操作下进行。制作灰树花原种的常用培养基配方有：(1)栗木屑80%、麦麸皮8%、石膏和糖各1%、沙壤土或壤土10%。(2)棉籽皮80%、麸皮8%、石膏和糖各1%、沙壤土或壤土10%。培养基配水拌匀，含水量60%，拌好后装瓶、灭菌、接种，在25～26℃培养，30天左右即可满瓶。经质量检查，菌丝粗壮，无杂菌污染方可使用。2、菌袋的制作流程：配料→装袋→灭菌→接种→培菌。(1)培养料配方①栗木屑70%、麸皮20%、生土8%、石膏1%、糖1%。②栗木屑50%、棉籽皮40%、生土8%、石膏和糖各1%，加105%～110%水拌料，使含水量达55%～57%。湿度过大，子实体形成时渗出棕色液体太多，易导致子实体腐烂。(2)装袋：用长宽17厘米×30厘米，厚度为0.5～0.6毫米的聚丙烯袋或高密度聚乙烯袋，装料15厘米左右，袋口套直径3厘米高、3厘米的套环，加棉塞盖防水纸，用皮筋或小线扎紧，然后灭菌。(3)灭菌：常压灭菌，保持100℃ 8～9小时，或高压灭菌1.5小时。(4)接种：按前述要求，采用优良品种，无菌操作。(5)培养菌丝：保温25～28℃，室内湿度70%以下，避光培养，日通风1～2次。15天后加散射光，加强通风，温度22～25℃，30天后菌丝长满袋底，表面形成菌皮，然后逐渐隆起，逐渐变成灰白色至深灰色，即为原基，可以进入出菇管理。 3、栽培管理灰树花出菇有袋式和仿野生出菇两种管理方式。袋式出菇——将长原基的菌袋移入出菇室，保持温度20～22℃，空气湿度85%～90%，光照200～500勒克斯，3～5天后除去环、棉塞，直立床架上，袋口上覆纸，纸上喷水，每天通风2～3次，每次1小时。约20～25天后，菌盖充分展开，菌孔伸长时采摘。采摘时，可用小刀将整丛菇体割下，连采2～3潮，生物效率30%～40%。仿野生出菇——木屑作培养基的栽培菌袋，菌丝满袋后，脱去塑料袋，将菌棒整齐地排列事先挖好的畦内，菌棒间留适当间隙，在菌棒缝隙及周围填土，表面覆上1～2厘米的土层。这是覆土栽培的一种形式，生物效率可达100%～120%。这种方式远远优于前者(袋式出菇)，故在此着重介绍。排菌时间——灰树花在唐山地区栽培，最佳排菌下地期在11月至次年4月底。因为此时空气和土壤中的杂菌、病虫不活跃，不侵害菌丝，而灰树花菌丝耐低温，菌丝连接紧密，长势健壮，对菌丝吸收营养有利。低温期排菌下地尽管发育期较长，但出菇早、产量高，可在雨季前完成产量的80%，4月底以后栽种的灰树花因为气温高、杂菌活跃，灰树花菌袋易感染，并会出现子实体生长快，单株小，总产量低，易受高温和暴雨危害。排菌方法——①场地：选择背风向阳、地势高、干燥、不积水、近水源、排灌方便、远离厕所或畜禽圈的地方。②挖地坑：要求东西走向，挖宽45～55厘米、长2.5～3.0米、深25厘米的地坑，地坑之间的距离为60～80厘米，在其中间修排水沟，以便于行走、管理和排水。③栽前预备工作：地沟挖好后，要先灌一次大水，目的是保墒。水渗干后，在沟底和沟帮撒一层石灰，目的是增加钙质和消毒，再在沟底和沟帮撒一薄层敌百虫粉，最后在沟底铺少量表土。④排放菌棒：将发好菌丝的菌袋全部剥去塑料袋，将菌棒横成排竖成行地排放在沟内，相邻菌棒要挨紧，每4个菌棒之间要有一个空隙。同时，要通过扒或垫沟底的回土，使排放在沟内的菌棒上表面齐平。这样在沟内可排放4～5行菌棒。⑤填缝隙：将菌棒与菌棒之间和菌棒与沟帮之间的空隙填上土，至菌棒以上1厘米。⑥灌水：往坑内放水使土落实，有空隙或凹坑用湿润土拢平，保持表层土厚1～2厘米。⑦包帮：用塑料薄膜或尼龙袋将坑四周包严，以防坑边土脱落。2月以前排菌下地的还需在畦内铺一层薄膜，在薄膜上覆盖5～7厘米土层，到4月中旬将畦内薄膜和浮土铲净，准备出菇管理。⑧搭阴棚：在坑北侧和坑中部立两道横杆，中部横杆距地面15厘米，北侧横杆距地面25厘米，在横杆上搭塑料布和草帘，呈南低北高倾斜状。4月份以前北部塑料布直铺到地面上，并用土压紧，东西两侧留排气孔。⑨铺砾：冬季下菌时盖浮土和薄膜的要在铲除浮土和薄膜后铺砾。畦内平铺一薄层1.5～2.5厘米直径的光滑石砾。出菇管理——①水分管理：4月下旬自然气温达到15℃以上，在畦内灌一次水，水量以没畦面2厘米左右为宜，自动渗下后每天早、中、晚各喷水一次，水量以湿润地面为宜，并尽量往空间喷。根据降雨情况，干旱时每隔5～7天要浇水一次，水能立即渗下为宜，有降雨时少灌。灰树花原基发后，喷水时应注意远离原基，避免将原基上的黄水珠冲掉。灰树花长大后可以在菇上喷水，促进菇体生长。灰树花采收后3天，其根部不要喷水，以利菌丝复壮，再长下潮菇。高温季节还需要往草帘和坑外空地洒水，降温增湿。低温季节喷水和灌水时最好用日光晒过的温水，以利保温。雨季降雨充足，可以少喷水或不喷水，干旱燥热需在白天中午增喷一次大水。②温度管理：4月下旬或5月上旬以保温为主，晚上要盖严草帘和塑料布，或者草帘在下塑料布在上，并在日光充足时适当延长阳光直射畦面的时间。6月下旬至8月高温高热期应以降温为主，可以用喷水降温和增加草帘上的覆盖物增加遮荫程度。晚上揭开塑料布或草帘露天生长，白天气温高时再盖上草帘或塑料布等覆盖物。③通气管理：4月中旬以后要将北侧塑料布卷起叠放在草帘上，使北侧长期保持通风，每天早晚要揭开草帘通风1～2小时。注意低温时和大风天气要少通风，高温和阴雨时要多通风，早晚喷大水前后，适当加大通风。通风要和保温、保湿、遮光协调进行，不可不通风，也不可通风过多。菇蕾分化期少通风多保湿，菇蕾生长期多通风促蒸发。④光照管理：用支斜架的方法保持灰树花生长的稳定散射光，每天早晚晾晒1～2小时增加弱直射光。生产上不采用过厚的草帘，以保留稀疏的直射光，出菇期避免强直射光，不可为保温和操作方便而撤掉遮荫物，造成强光照菇。⑤光温水气协调管理：光、温、水、气这些因子必须协调执行，在不同的季节、不同的时期和不同的天气情况，以及栽培管理条件，抓主要方面，但不能忽视以致偏离次要方面的极限，还需要通过任何一种因子的概貌措施来创造对其它因子的需求条件。如雨天增加通风达到出菇的湿润条件，干热时通过增加遮荫减少高温伤害；每天早晚揭帘晾晒，可与通风、喷水同时进行，或者在此时采菇。灰树花畸形菇多是由于环境不协调造成的，如原基黄化萎干不分化，由于通风大湿度小造成；小散菇是由于通风小缺少光照造成；菇盖形如小叶，分化迟缓的鹿角菇和高脚菇是由通风不畅、湿度过大造成的；黄肿菇是由于水汽大、通风弱或高温造成；白化菇多是由于光照弱造成；焦化菇由于光强水分小造成；原基不生长，多是由于覆土厚、浇水过勤、浇冷水造成温度低，生长缓慢所致；薄肉菇是由于高温、高湿，通风不畅，菇体不蒸发而成；培养基塌陷是由于高温、不通风以致菌丝体死亡造成的。总之，灰树花高产的前提是协调光、温、水、气因子，创造适宜生长发育的条件。4、病虫害防治灰树花出菇期较长，特别是贯穿整个高温夏季，时常发生病虫侵害，在坚持以防为主综合防治的同时，通常还采用如下应急防治措施：①发现局部杂菌感染时，通常用铁锨将感染部位挖掉，并撒少量石灰水盖面，添湿润新土，拢平畦面，感染部位较多时，可用5%草木灰水浇畦面一次。②发现虫害，用敌百虫粉撒到畦面无菇处。用低毒高效农药杀虫，尽量避免残毒危害。③在7～8月份高温季节，当畦面有粘液状菌棒出现时，用1%漂白粉液喷床面以抑制细菌。 5、采收和贮运采收的时间：灰树花由现蕾到采收的时间与子实体生长期的温度有关。一般地说，如果温度在23～28℃之间，由现蕾到采摘需13～16天，如果出菇时的温度在22℃以下至14℃，由现蕾至采摘要经过16～25天。采摘时的标志：(1)如果阳光充足，灰树花幼小时颜色深，为灰黑色，长出菌盖以后在菌盖的外沿有一轮白色的小白边，这轮小白边是菌盖的生长点。随着菌盖的长大，菌盖由深灰色变为黄褐色，作为生长点的白边颜色变暗，边缘稍向内卷曲，此时可采摘。(2)如果光照不足，灰树花幼小时，颜色较白，生长点不明显，到菌盖较大时，要看菌盖背面是否出现多孔现象，如果恰好出现菌孔，此时可采摘；如果菌管已经很长，说明灰树花已经老化。老化的灰树花不但质量差，也影响下茬的出菇，所以应及时采收。采收的方法：采收灰树花时，将两手伸平，插入子实体底下，在根的两边稍用力，同时倾向一个方向，菌根即断。注意不要弄伤菌根。有的菌根可以长出几次灰树花。检净碎片及杂草等，过1～2天上一次大水，照常保持出菇条件，过20～40天就可出下潮菇。将采下的灰树花除掉根部的泥土和沙石及子实体上面的杂草等即可鲜售。贮运：鲜灰树花应贮放在密闭的箱内或筐内，每朵灰树花单层排放，尽量不要堆得过高，造成挤压。需要密集排放时，应使菇盖面朝下，菇根面朝上。灰树花贮藏温度以4～10℃为宜，温度过高，鲜菇继续生长因而老化。灰树花鲜品运输要力争平稳，将每箱(筐)单层或双层排放，避免挤压、碰撞和颠簸。干制和盐渍是灰树花的主要加工方式。

                      COC1细胞的培养步骤与应用！一、背景COC1细胞是人卵巢癌悬浮细胞系，该细胞建系于1993年。细胞于原代培养至第17天首次传代，以后反复传代，生物学特性稳定。可表达多种肿瘤标志物和野生型P53蛋白、突变型P53蛋白。裸鼠接种产生分化差的腺癌。卵巢癌是卵巢肿瘤的一种恶性肿瘤，是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90%～95%为卵巢原发性的癌，另外5%～10%为其它部位原发的癌转移到卵巢。由于卵巢癌早期缺少症状，即使有症状也不特异，筛查的作用又有限，因此早期诊断比较困难，就诊时60%～70%已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。二、培养步骤1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。三、应用用于双氯芬酸对卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP化疗敏感性的影响研究：用MTT检测药物对卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP的增殖抑制作用；应用流式细胞技术检测药物作用后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP的凋亡率；应用免疫细胞化学法检测卵巢癌细胞COC1和卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP细胞中E2F1的表达情况。方法：应用MTT和流式细胞技术检测双氯芬酸单药、顺铂单药及顺铂联合双氯芬酸作用后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP的生长抑制率及其对顺铂的半数抑菌浓度（IC50）和细胞凋亡率；应用免疫细胞化学法检测卵巢癌细胞COC1及卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP中E2F1表达情况，检测不同浓度的双氯芬酸作用48h后及浓度为50mol/L的双氯芬酸作用72h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP中E2F1表达情况。统计学方法：采用SPSS17.0统计和分析实验数据。以a=0.05作为检验水准。结果：1、双氯芬酸单药作用48h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP的生长抑制率差异有统计学意义，进一步两两比较，药物浓度10mol/L、30mol/L、50mol/L三组两两比较差异均无统计学意义（P>0.05），药物浓度70mol/L、90mol/L与以上三组两两比较差异有统计学意义（P2、顺铂单药作用48h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP对顺铂的IC50=8.39g/ml，顺铂联合双氯芬酸作用48h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP对顺铂的IC50=4.35g/ml，两者抑制率比较差异有统计学意义（P3、浓度为50mol/L的双氯芬酸单药作用48h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP细胞凋亡率=（2.850.37）%，浓度为4g/ml的顺铂单药作用48h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP细胞凋亡率=（12.740.45）%，顺铂联合双氯芬酸作用48h后卵巢癌铂类耐药细胞COC1/DDP细胞凋亡率=（23.780.49）%，凋亡率比较差异有统计学意义（P

                土壤微生物分离与纯化的实验原理和方法！一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫· 霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1 /4000mm3。   使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1、活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2、器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法   1、视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2、取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3、将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 4、静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5、计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 6、对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。 7、测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                肉葡萄球菌的培养方法及应用与举例！                                                        肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)是肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作发酵肉产品起始培养物已经超过 60 年。与其他葡萄球菌相比，它不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌属中被完全确认的食品级 GRAS(generally regarded as safe)菌株。肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解能力，所以该菌可以作为基因克隆宿主菌用于分子遗传学方面进行葡萄球菌属相关代谢途径的研究，以及安全正常地表达和分泌异源蛋白。一、菌种简介平台编号：bio-67907规格：冻干物拉丁属名：Staphylococcus carnosus subsp. carnosus中文名：肉葡萄球菌外文名：Staphylococcus  carnosus其他编号：DSM 20501=ATCC 51365培养基编号：109培养温度：37℃分离源：干香肠培养基信息培养基编号：109名称：Trypticase Soy Agar（TSA）备注：Pancreatic Digest of Casein 15.0 gPapaic Digest of Soybean Meal 5.0 g氯化钠 5.0 g蒸馏水 1000.00 ml 琼脂 15.0 g pH 7.3注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、培养基*营养琼脂培养基（NA）*胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSA）*LB 培养基（以上三种任选一种即可）三、保藏条件斜面菌种和安瓿瓶冻干菌种应在 2-8°C 保存。西林瓶请置于-20°C 保存。四、培养方法1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。五、应用在肉制品加工中，亚硝酸盐具有发色、抑菌(尤其是对肉毒梭菌)、防腐、抗氧化、可形成腌肉风味等多重功能，尚无一种物质可以替代它。但是，肉中亚硝酸盐可以与仲胺类物质反应，生成 N- 亚硝基化合物，这种物质具有致癌性、致畸性，与脑瘤和胃肠道癌变密切相关。为此，国内外进行了大量的亚硝酸盐替代研究。国外已有研究结果证明，某些乳酸菌和其他微生物可在不添加亚硝酸盐的条件下，转化高铁肌红蛋白产生具有红色色泽的肌红蛋白衍生物，使肉制品获得较好的色泽。肉葡萄球菌广泛用于发酵肉制品，具有硝酸盐还原酶活性，其在 15～20℃便可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，30℃时转化效率更高。在培养基和肉基质中，肉葡萄球菌均可将高铁肌红蛋白转化为红色肌红蛋白衍物。 六、举例香肠加工工艺：原料肉→解冻→修割→绞制→斩拌(过程中分步加入辅料、肉葡萄球菌冻干粉和脂肪)→真空灌肠→保温→煮制→冷却包装香肠制作的肉葡萄球菌最佳发色条件：硝酸盐添加量为 0.005%、异 VC-Na 添加量为 0.01%、肉葡萄球菌冻干粉添加量为0.25%、保温温度 30℃和保温时间 3h。按上述条件，采用肉葡萄球菌发色的香肠经过80℃蒸煮熟制，真空包装并于4℃条件下贮藏 2个多月后，菌落总数小于 10CFU/g。采用接种肉葡萄球菌并添加少量硝酸盐(或含有硝酸盐的天然物质)替代直接添加亚硝酸盐进行香肠发色是完全可行的。 七、注意事项1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用 0.2m 左右培养液或无菌水溶解，接种在 2 个斜面上，因冻干粉处于休眠状态，请勿接种多支斜面或平板，以避免因接种量不足而导致复苏不成功；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

           人组织细胞淋巴瘤细胞的处理方法与培养步骤！一、细胞简介平台编号：bio-53913规格： 1*10 6拉丁属名： U-937 人组织细胞淋巴瘤细胞细胞名称：人组织细胞淋巴瘤细胞注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、细胞介绍该细胞是由Nilsson K实验室于1974年从一名37岁的患有恶性组织细胞性淋巴瘤的白人男性的胸水中分离建立的。1979年来的研究显示该细胞在人混合淋巴细胞培养物上清、佛波酯、Vit D3、γ-IFN、TNF和维A酸的诱导下可以向终末单核细胞分化。该细胞不合成免疫球蛋白，EBV阴性；可产生溶菌酶、β-2-微球蛋白，受PMA刺激后可产生TNF-α；表达C3R；可作转染宿主；表达Fas，对TNF和抗Fas的抗体敏感。 三、细胞特性1）来源：淋巴瘤2）形态：单核细胞，悬浮生长3）含量：>1x106 细胞数4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装5) 用途：仅供科研使用。四、细胞的运输和保存干冰运输及复苏好存活细胞（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。五、细胞接收后的处理方法1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。3）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。六、细胞培养步骤1、培养基及培养冻存条件准备：1）准备1640 培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。2、细胞处理：1）冻存细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：悬浮状态下生长的细胞，可以通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，一般情况下细胞密度维持在1×105~1×106个/mL（不同细胞对密度要求不同，）可以维持细胞的正常生长。如需分瓶可以将细胞悬液收集到离心管中1000rpm，离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                艰难梭菌感染的实验室诊断技术研究进展！艰难梭菌是一种专性厌氧革兰阳性芽孢杆菌，本身没有侵袭性，但长期使用广谱抗菌药物等因素易导致菌群失调，引起艰难梭菌感染( Clostridium difficile infection，CDI) 及相关性腹泻，严重时可出现伪膜性肠炎甚至死亡。误诊或漏诊该菌感染可能延误治疗并增加交叉感染风险，因此，对其快速精准检验尤为重要。检验结果可为 CDI 的诊断与治疗提供重要依据。该文对 CDI 实验诊断技术作一综述。 艰难梭菌作为人类肠道正常菌群，是一种专性厌氧革兰阳性芽孢杆菌，由于其较难在实验室中分离和生长而被命名为艰难梭菌。肠道菌群的平衡对于维持人体健康至关重要，而广谱抗菌药物、免疫抑制剂或化疗药物的大量使用会引起菌群失调，导致艰难梭菌感染( Clostridium difficile infection， CDI) 及相关性腹泻，严重时可导致伪膜性结肠炎、暴发性结肠炎、中毒性巨结肠甚至死亡。近年来，CDI 发病率显著增加，严重威胁公共卫生安全。有数据表明 2003 年美国出院人群 CDI 发病率为 7．5‰，2012 年增加到 13．5‰，平均每年有 453000人感染、29 000人死亡，由 CDI 导致的经济负担为 4．36～ 30 亿美元。目前，CDI 已成为重要的医院感染之一，及早、正确地根据相关症状及实验室检查结果诊断 CDI，不仅有助于临床诊疗和疾病预防，还可降低不必要的医疗费用支出。本文就常用的艰难梭菌实验室诊断方法进行综述，以期为 CDI 诊断提供方法学参考。一、目前常规使用的艰难梭菌实验室诊断方法艰难梭菌的实验室诊断技术一般分为 3 类：微生物培养、免疫学检测( 艰难梭菌毒素、谷氨酸脱氢酶) 和分子生物学检测。1、微生物培养⑴艰难梭菌的厌氧培养艰难梭菌是专性厌氧菌，对培养条件要求严格，在常规厌氧培养条件下不易生长，在环丝 氨酸－头孢西丁－果糖琼脂( cycloserin-cefoxitin-fructose agar， CCFA) 培养基中厌氧培养 24 ～ 48 h 时，可形成白色或淡黄色、边缘不整齐以及典型马粪气味的菌落，在紫外线照射下可见黄绿色荧光，因此使用 CCFA 进行培养后，可根据菌落形态、荧光特点、气味和革兰染色结果进行鉴定。Kochan 等对传统的 CCFA 培养方法进行一些改进，如在 CCFA 培 养基中加入牛磺胆酸钠或溶菌酶，可以进一步富集芽孢，提高敏感性。此外，显色培养基也被用于艰难梭菌的培养及鉴定，如法国 BioMérieux 公司先后开发的 IDCd 培养基、CLO 培 养基和 CDIF 培养基，艰难梭菌在此类培养基上可形成特征性黑色菌落，更易辨别。艰难梭菌分离培养作为一种传统方法，不仅敏感性高，而且可获取相应菌株用于分子分型和耐药分析，能更全面地了解其流行病学特征，为临床治疗提供依据。但其缺点也不可忽视，分离培养耗时较长，不能明确区分产毒株和非产毒株，因此不能为临床快速诊断提供依据，导致很难在临床实验室广泛开展。⑵细胞毒性试验( cell cytotoxicity assay，CCTA) 艰难梭菌可分泌致病性毒素，CCTA 是检测毒素的重要方法。可取患者新鲜粪便标本进行稀释，经离心、过滤后，将滤液滴加到微量滴定板上单层细胞中，培养 24～ 48 h 后观察是否出现细胞病变效应( cytopathic effect，CPE) ，然后通过特异性抗血 清中和试验确定 CPE 的特异性，鉴定 CPE 是否由艰难梭菌相关毒素引起。CCTA 敏感性、特异性高，是检测粪便毒素的金标准，但结果易受多种因素影响，如细胞系种类、粪便滤液标本制备质量和工作人员经验等，此外，CCTA 操作具有一定复杂性，且需要无菌环境和细胞培养设备，目前未在临床实验室中常规开展。⑶毒力生成培养试验( toxigenic culture，TC) TC 试验包括艰难梭菌培养和毒素检测两部分，只有培养结果阳性才进行毒素检测，主要有细胞毒性检测、免疫学检测毒素以及分子生物学检测毒素基因等。TC 虽然是一种兼具高敏感性和高特异性的检测技术，但由于仅检测艰难梭菌的体外产毒能力，故不能用于反映菌株在高度可变的体内产生毒素情况，不能区分产毒性菌株在体内是否引起真正感染。和 CCTA 类似，TC 也会耗费大量时间，引起治疗延迟，使患者症状加重，甚至死亡。因此，TC 主要用于流行病学研究及新方法评估，一般不用于临床。2、免疫学检测⑴毒素的免疫学检测毒素 A 和毒素 B 是艰难梭菌发病机制中的关键毒力因子，被视为诊断 CDI 的重要指标。在美国，90%以上的实验室均采用免疫学检测方法，包括 酶免疫方法( enzyme immunoassays，EIAs) 、荧光酶免疫测定 ( enzyme linked fluorescence assay，ELFA) 等。EIAs 是以酶标记抗体作标志物检测样本中毒素 A、B 的分析技术。目前市面上有多种基于 EIAs 的商品化试剂盒，其性能因厂家而异，其中比较常见的是采用 ELISA 双抗体夹心法。尽管 EIAs 的敏感性受到标本储存方式、运 输途径等多种因素影响，但快速、简单、价廉、设备技术要求不高等特点使其在临床应用中具有独特优势。目前普遍认为 EIAs 是临床应用频率较高的检测方法。 VIDAS CDAB 检测系统由法国 BioMérieux 公司研发，采用 ELFA 方法检测毒素 A、B。VIDAS CDAB 检测系统技术成熟，性能稳定，是一种定量检测方法，15 min～ 2 h 可报告结果，与传统培养法相比，具有快速便捷、工作量少等优点，但该检测方法需要特殊仪器。⑵谷氨酸脱氢酶( glutamate dehydrogenase，GDH) 的免疫学检测 GDH 是艰难梭菌表面大量表达的一种抗原性蛋白质，数量多，稳定性强，敏感性高，在各型艰难梭菌中具有高度保守性，因此 GDH 也为艰难梭菌检测提供了一个方向。目前可采用胶体金免疫层析法、ELFA、EIAs 等对 GDH 进行 检测。 德国 Nadal 公司研发的即用型检测卡，即采用胶体金免疫层析法，将稀释后的样本悬浮液在检测卡上扩散，GDH 与胶体金标记抗体反应，当移动至固定在硝酸纤维素膜上的抗体区域时，发生特异性结合而被截留，聚集，显色，实现对 GDH 的目视化检测。此外，还有采用 ELFA 的 Vidas C． difficile GDH Assay ( 法 国 BioMérieux 公 司) 以 及 采 用 EIAs 的 Quik Chek-60( 美国 Techlab 公司) 。 3、分子生物学检测⑴核 酸 扩 增 试 验 ( nucleic acid amplification tests， NAATs) 艰难梭菌致病性决定区( PaLoc) 内含有编码毒素 A 和 B 的 tcdA、tcdB 基因，以及 tcdＲ、tcdC 及 tcdE 3 种辅助基 因。在致病性决定区外的二元毒素决定区( CdtLoc) 内则含 有编码二元毒素的 cdtA 和 cdtB 基因。NAATs 多是检测毒 素 A、B 及二元毒素的编码基因。NAATs 包括 PCＲ、环介导 等 温 扩 增 技 术 ( loop-mediated isothermal amplification， LAMP) 、依赖解螺旋酶恒温扩增技术( helicase-dependent amplification，HDA) 等，这些方法均是针对艰难梭菌的毒素基 因进行检测。 NAATs 方法众多，有采用 PCＲ 技术的 BD GeneOhm、BD Max、ProDesse ProGastro Cd Assay、Cepheid GeneXpert C．difficile Assay 等，采用 LAMP 技术的 Meridian Illumigene 等，以及 采用 HDA 技术的 Quidel AmpliVue C．difficile、Great Basin Portrait Analyzer 等。这些技术一般先通过高温或解旋酶将模板 DNA 变为单 链，再将引物与模板杂交，然后在聚合酶催化下延伸合成，反 复循环，实现目的 DNA 的扩增。这几种 NAATs 检测方法虽 然基本原理和操作过程等有所不同，但与免疫学检测毒素和 GDH 相比，其敏感性、特异性更高，且可以快速获取结果。虽然 NAATs 被认为优于其他方法，但由于不能准确区分艰难梭菌的定植和感染，易导致对 CDI 的过度诊断和治疗，可能高估 CDI 发病率，因此需要结合其他检测方法以及临 床症状进行综合判断。⑵分子分型 快速、准确的分子分型对艰难梭菌暴发流行的早期监测和追踪溯源具有重要意义。目前常用的分子分型方法包括限制性内切酶分析分型( restriction endonuclease analysis typing，ＲEA) 、聚合酶链反应核糖体分型( polymerase chain reaction ribotypin，PCＲ ＲT) 、脉冲场凝胶电泳 ( pulsed-field gel electrophoresis，PFGE) 、多位点序列分析 ( multilocus sequence typing，MLST) 、重复序列 PCＲ( repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction，rep-PCＲ) 分 型、多位点可变数目串联重复序列分析( multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA) 和全基因组测序分析( whole-genome sequencing，WGS) 等。这些方法各有利弊，ＲEA 稳定性好，PCＲ ＲT 和 PFGE 分辨力强，但三者费时费力，且结果受实验条件影响较大，不易推广到各级医院; MLST 具有数字化优势，使不同实验室之间 的结果具有可比性，但较高的成本限制了 MLST 在临床方面 的应用; rep-PCＲ、MLVA 和 WGS 分型能力强大，但前两者较 难进行室间数据交流，后者对生物信息分析能力要求较高，暂未被推荐常规使用。随着分子生物学技术不断发展，艰难梭菌分子分型方法在分辨能力、可重复性、成本效益以及操作简便程度上都会有更大的进步。依据艰难梭菌分子分型结果，能够更快速地识别 CDI 暴发，更有效地制定 CDI 防控措施，更合理地指导临床用药。4、检测策略———二步法成三步法 自艰难梭菌被发现以来，检测该细菌的方法层出不穷，但每种方法都存在着优缺点，不建议将任何一项检测方法作为诊断 CDI 的独立方法。综合考虑各种方法的敏感性、特异性、费用、报告时间等因 素，目前许多专家和一些指南支持采用二步法或三步法进行 CDI 诊断。欧洲临床微生物学和传染病学会更新的艰难梭 菌感染诊断指南文件中推荐二步法，即 GDH 和毒素 A/B EIAs 同步联合检测，二者结果不一致时用 NAATs 或 TC 验 证。三步法先用 GDH EIAs 或 NAATs 初筛，阳性时进行毒素 A/B EIAs 试 验，若免疫学试验阴性再用 TC 或 NAATs 确认。2017 年发表的我国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识推荐的实验室诊断流程也基本如此，见图 1。相比 其他常规检测方法，二步法或三步法具有较高的敏感性、特异性和准确性，有助于减少 NAATs 引起的艰难梭菌过度诊断，在整体效益上可明显缩减医疗费用，有较大临床应用前景。目前用于 CDI 诊断的主要检测方法的敏感性、特异性、 费用、报告时间、检测对象和应用评价的比较见表 1。          二、艰难梭菌实验室诊断技术的发展目前已有的艰难梭菌诊断技术存在一些不足，寻找更实用、更有效的实验诊断方法仍是目前临床面临的一大难题。当前正研究一些新技术，未来有望应用于临床。1、超高效液相色谱－质谱法( ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS ) 与代谢组学 UPLC-MS技术以超高效液相色谱作为分离系统，串联质谱作 为检测系统。样品在液相色谱部分和流动相分离，被离子化 后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数和电荷数的比 值大小依次排列成谱记录下来，经检测器得到质谱图，实现 对复杂混合物准确的定量和定性分析。而物质代谢是肠道 菌群的重要功能，CDI 伴随着严重的肠道菌群紊乱，势必引 起肠道内物质代谢发生改变。因此，研究人员尝试利用 UPLC-MS 技术进行代谢组学综合分析，以诊断 CDI。虽然该方法存在仪器昂贵、操作和维护复杂、样本通量有限等缺点，但分辨率高、敏感性高、特异性高、分析速度快，且进行代谢 组学检测性能稳定，结果可靠，通过对相关代谢物及代谢通 路进行深入分析，发现能反映机体代谢功能变化的“生物标 志物群/谱”，可为研究 CDI 机制、筛查或治疗提供一种新的 思路。2、拉曼光谱法( raman spectroscopy，ＲS) 样品被激光产 生的单色光照射，一些入射光子被透射或吸收，其他光子与 样品的分子相互作用后被散射; 大多数散射光子具有与入射 光子相同的能量，这种称为弹性瑞利散射。发射的光子具有 比入射光子更高或更低的能量，称为非弹性散射。在 106 ～ 108 个光子中，只有约 1 个光子在光学频率上与入射光子频率不同( 即非弹性散射) ，产生拉曼光谱。拉曼光谱表明了分 子中固有的振动、旋转和其他低频振动模式，被视为物质的 “指纹”，可用于确定待测物质的性质及成分，已经在疾病 诊断和检测等生物医学领域显示出潜在应用价值。虽然这项技术有待完善，如研究对象是人为加入的毒素血清而非 原始样本，但快速、廉价、高特异性、高敏感性、无需标记等优 点使 ＲS 具有较大潜力，有望成为一种监测患者体内艰难梭菌毒素的床旁检测工具。3、单分子阵列( single-molecule array，Simoa) 分析研究表明，CDI 严重程度与粪便中毒素水平相关，量化粪便中毒素对疾病预后和疗效观察具有一定价值。Simoa 技术的基本原理为包被于磁珠上的捕获抗体与样本中抗原结合，而后 β－半乳糖苷酶标记的检测抗体再与磁珠上的抗原结合，形成 磁珠－抗原抗体复合物，将其转导于单分子阵列微孔板上，保证每个微孔只含有 1 个复合物，检测酶作用于底物产生荧光信号强度，从而获得样本抗原浓度，量化粪便中的毒素。 Simoa 技术是一种数字化形式的 ELISA，敏感性是 ELISA 方法的 1 000 倍。目前，采用 Simoa 技术研究艰难梭菌还缺 乏临床大样本的应用性研究，对低水平毒素的临床意义还需探索( 即定植与感染界限不明) ，但是快速、廉价、高敏感性、 高特异性、低样本量、全自动化、高通量等优点使国际上一直没有间断对其研究，这一技术有望促进 CDI 诊断。 3 结语 综上所述，艰难梭菌常规检测方法为微生物培养、免疫学检测和分子生物学检测，还有 UPLC-MS、ＲS、Simoa 等新技。这些检测方法均有利弊，应依据行业公认的检 测流程( 二步法或三步法) 严格操作，分层次、多渠道与临床进行沟通交流，为临床 CDI 诊疗提供实验室依据。

             小鼠神经干细胞的培养操作规程与处理方法！一、细胞简介平台编号：bio-105907规格：1*10 6拉丁属名：C17.2 小鼠神经干细胞细胞名称：小鼠神经干细胞细胞用途：仅供科研使用注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用二、细胞特性1）来源：小鼠小脑神经2）形态：上皮细胞样，贴壁生长3）含量：>1x106 个/mL4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性5）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装三、细胞的运输和保存可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式（1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。（3）收到细胞后请拍照，3天内如果发现污染，请及时拍照与我们联系。四、细胞接收后的处理方法1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。2）在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。4）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。5）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。6）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议1：2传代。五、细胞培养操作规程，供参考1、培养基及培养冻存条件准备：1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。2、细胞处理：1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。3、轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。4、移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。下面T25瓶为例；1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。六、注意事项1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。