小鼠骨髓间充质干细胞的应用！

                     小鼠骨髓间充质干细胞的应用！

一、背景

小鼠骨髓间充质干细胞来源于实验小鼠的正常骨髓血组织，CD44免疫荧光染色为阳性，CD45免疫荧光染色为阴性。细胞生长方式：长梭形细胞，不规则细胞，贴壁培养，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织。在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。

贴壁细胞传代：若细胞生长密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留5ml左右继续培养，直至细胞密度达80%左右再进行传代操作，瓶盖可稍微拧松。

二、细胞传代的操作步骤：

1、挑选细胞：镜检细胞，挑选生长状态良好，细胞界限清晰，具有立体感，形态好无污染、无异常及可疑病变细胞。

2、配制细胞培养液：按以下配比配制MEM-0.2%LH培养液100ml内，加入灭活小牛血清10m1，庆大霉素溶液0.3m1，7.5%碳酸氢钠溶液3ml。（仅供一般参考）。

3、消化细胞：先用PBS洗液冲洗细胞表面1-2次，每次10m1，弃去洗液，向细胞瓶内加入0.25％胰蛋白酶溶液，每瓶1m1，细胞瓶平放，使消化液完全覆盖细胞表面。

4、至细胞完全脱落到胰酶中：每瓶加入10m1细胞培养液吹打分散细胞，按所需的传代比例分装于小方瓶(100m1)中，再加入10m1细胞培养液重复吹打一次后分装，然后补加至所需培养量。

5、加塞，置于37±1℃孵箱培养。约2～4天成片(由细胞接种浓度决定)。

三、应用

用于SDF-1/CXCR4轴以及MCP-1/CCR2轴对小鼠骨髓间充质干细胞迁移及归巢的影响研究：

成功培养了ICR小鼠的骨髓间充质干细胞,建立ICR小鼠心肌梗死模型,分选骨髓间充质干细胞中CXCR4和CCR2表达阳性的细胞,研究其归巢和迁移能力的差异,对小鼠梗死心肌修复的影响,并对PI3K/Akt通路在该归巢效应中的潜在作用进行了初步探讨。

方法：

1、无菌条件下取5-8周龄ICR小鼠的胫腓骨,体外全骨髓贴壁法培养,80%铺满后进行传代,流式鉴定细胞表面分子表达以及细胞周期,G0/G1期细胞量较多,CD44、CD90、CD105阳性率较高的细胞符合骨髓间充质干细胞特征。

2、气管插管辅助3、4肋间开胸结扎冠状动脉下支的方法建立小鼠心梗模型,检测LVEF、FS、LVEDD等指标,鉴定小鼠模型是否构建成功。

3、小鼠骨髓间充质干细胞体外培养扩增联合免疫磁珠分选（MACS）纯化CXCR4/CCR2阳性骨髓间充质干细胞,并作克隆培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞分选前后的细胞表面标志物的表达情况。

4、采用Transwell模型检测CXCR4/CCR2对骨髓间充质干细胞迁移的影响及其可能机制。下室种植心肌细胞,上室为纯化的骨髓间充质干细胞。实验共分为四组,对照组,CXCR4+/CCR2+组,CXCR4+/CCR2-组,CXCR4-/CCR2+组,24h后5个高倍视野计数迁移的细胞。免疫荧光检测下室穿过细胞。

5、左冠脉前降支（LAD）结扎建立小鼠心梗模型后,在梗死区周边选取5个位点注射分选后的细胞,观察移植骨髓间充质干细胞对体内归巢及对心梗修复的影响。

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