盐酸小檗碱对2型糖尿病胰岛素抵抗的改善作用及其机制分析盐酸小檗碱(黄连素)对2型糖尿病胰岛素抵抗的改善能力及发挥功效的机制。方法 130例2型糖尿病患者随机分为2组。给予胰岛素治疗的同时额外服用黄连素为观察组,同期只给予胰岛素为对照组。于黄连素治疗前后同时检测两组空腹血糖、空腹胰岛素、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、游离脂肪酸(FFA)及血管生成素样蛋白(ANGPTL)3,观察两组治疗前后胰岛素敏感系数及抵抗系数情况。结果治疗1个月后,观察组空腹血糖、空腹胰岛素、TG、TC、HDL、LDL、TNF-α、FFA、ANGPTL3显著低于对照组(P

308准分子激光治疗白癜风的临床疗效及其对皮肤黑色素水平和黑素细胞的影响探讨308准分子激光治疗白癜风的临床疗效及其对皮肤黑色素水平和黑素细胞的影响。方法前瞻性选取2013年9月至2016年9月期间确诊治疗的白癜风患者100例,依据随机数表法随机分为激光组和常规组,每组50例。常规组患者给予常规0.1%他克莫司软膏治疗,激光组患者在此基础上给予308准分子激光治疗。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清细胞间黏附分子-1(ICAM1)、白介素-2(IL-2)、α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)水平。采用皮肤病生活质量问卷(DLQI)评估生活质量。随访6个月,统计分析所有患者治疗疗效、血浆因子和不良反应及生活质量情况。结果激光组患者复色显效率明显高于常规组,差异有统计学意义(P0.05);激光组患者治疗后1、3、6个月的DLQI得分明显低于常规组,差异有统计学意义(P

2018年国庆节放假安排的通知 各客户、各部门： 　　根据《国务院办公厅关于2018年部分节假日安排的通知》精神，结合我司实际，现就2018年国庆节放假的有关事宜通知如下：　　一、放假安排　　2018年国庆节放假7天。　　2018年10月1日至10月7日放假，共7天，10月8日正常上班。　9月26日-30日仍可正常发货，为确保不耽误贵司的正常运作，请贵司提前做好所需库存计划安排，因放假给您带来的不便，敬请谅解！在此，上海沪震实业有限公司全体员工恭祝您国庆愉快，身体健康，财源广进。希望您能继续支持我们的工作，愿我们的合作更加紧密，愿我们的事业更加辉煌！ 上海沪震实业有限公司2018年9月28日

miRNA-29b在急性冠脉综合征病人中的表达水平及意义探讨miRNA-29b在急性冠脉综合征病人中的表达水平及意义。方法选取2013年2月—2014年3月在昆明医科大学附属延安医院急诊医学科及心血管内科确诊的急性冠脉综合征病人58例,其中急性心肌梗死(AMI)30例为观察组,不稳定型心绞痛(UA)28例为对照组。同时选取健康体检者10名作为正常组。发病后不同时间点位采用微小RNA提取试剂盒对各组观察对象血浆中RNA进行提取,应用RT-PCR及qRT-PCR方法对miRNA-29b表达水平进行检测,比较各组表达差异;结合各组对象血清细胞外基质(ECM)含量、增强MRI(DE-MRI)结果、心律失常发生情况等阐述其意义。结果发病后1d、7d、14d和30d,观察组血浆中miRNA-29b表达水平显著低于对照组(P

革兰染色检验法、PCR检验法与细菌培养法在阴道细菌检查中的应用比较探讨革兰染色检验法、PCR检验法与细菌培养法在阴道细菌检查中的应用效果。方法:随机选取2011年4月-2015年5月我院的90名阴道疾病患者作为研究对象,采集90名患者的阴道分泌物采用革兰染色检验法、PCR检验法与细菌培养法进行检验,比较三种不同方法检验的效果。结果:细菌培养法细菌检查率为76.7%,PCR检验法细菌检查率为72.2%,革兰染色检验法细菌检查率为34.4%。细菌培养法与PCR检验法检出率没有较大的差异,P>0.05。革兰染色检验法与细菌培养法、PCR检验法的检出率存在较大的差异,P 

应用PCR-DGGE方法研究甜酒曲中真菌多样性提取6种甜酒酒曲的总DNA,利用真菌18S rRNA基因片段的通用引物NS1、Fung-GC,采用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法,进行不同甜酒酒曲中真菌多样性的分析。结果表明,6种甜酒酒曲中共分离出3属真菌和不可培养真菌,湖南韶山的甜酒曲中主要是扣囊复膜酵母属和根霉属的菌株;湖南湘潭甜酒曲中的真菌为酿酒酵母属、扣囊复膜酵母属和根霉属;湖南祁东、福建福州和浙江丽水甜酒曲中的真菌均为酿酒酵母属、扣囊复膜酵母属、根霉属和不可培养真菌;浙江兰溪甜酒曲中的真菌为根霉属和不可培养真菌。在传统的酒曲中的真菌主要是酿酒酵母属和扣囊复膜酵母属,此外不可培养真菌在甜酒酒曲中也起到非常重要的作用。

慢性肾脏病合并急性肾小管间质损伤患者血清NGAL和尿KIM-1水平变化及临床意义探讨慢性肾脏病(CKD)继发急性肾小管间质损伤(ATIL)患者血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和尿肾损伤分子-1(KIM-1)水平的变化及临床意义。方法随机选择CKD患者167例,根据是否继发ATIL分为CKD继发ATIL组(106例)和CKD未继发ATIL组(61例),根据肾小管间质损伤程度将CKD继发ATIL患者分为轻度组(35例)、中度组(49例)和重度组(22例)。以40例体检健康者作为对照组。收集研究对象临床资料,采用酶联免疫吸附法检测血清NGAL和尿KIM-1水平。结果 CKD继发ATIL组血清NGAL和尿KIM-1水平高于CKD未继发ATIL组和对照组,CKD未继发ATIL组高于对照组(P

多巴酚丁胺联合美罗培南对先天性心脏病合并心衰肺炎患儿血清BNP、IGF-1、IGFBP-3、TNF-a、IL-6及hs-CRP的影响探讨多巴酚丁胺联合美罗培南对先天性心脏病合并心衰肺炎患儿血清脑钠肽(BNP)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及超敏C-反应蛋白(hs-CRP)的影响。方法 :选择我院收治的70例先天性心脏病合并心衰肺炎患儿,随机分为对照组和治疗组各35例。对照组单纯给予多巴酚丁胺治疗,治疗组给予多巴酚丁胺联合美罗培南治疗,两组连续给予治疗10d。检测并比较两组治疗前后血清BNP、IGF-1、IGFBP-3、TNF-α、IL-6及hs-CRP水平。结果:两组血清BNP、IGF-1、IGFBP-3、TNF-α、IL-6及hs-CRP的治疗前水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组血清BNP、TNF-α、IL-6及hs-CRP的治疗后水平均明显低于治疗前,血清IGF-1、IGFBP-3的治疗后水平均明显高于治疗前,并且治疗组血清BNP、TNF-α、IL-6及hs-CRP水平下降明显大于对照组,血清IGF-1、IGFBP-3水平升高明显大于对照组,差异均具有统计学意义(P

PCT、hs-CRP、WBC及NEUT在肺部感染诊断中的临床价值目的探讨降钙素原(PCT)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞计数(WBC)及中性粒细胞(NEUT)在肺部感染诊断中的临床价值。方法选择2015年3月~2016年8月期间在我院进行治疗的肺部感染患者167名及同期健康体检者156名作为本次临床研究的观察对象。根据感染程度及病原菌感染类型将肺部感染患者依次分组。分别检测两组患者血清PCT、hs-CRP、WBC及NEUT水平。结果肺部感染组患者血清中PCT、hs-CRP、白细胞及中性粒细胞比重均明显高于对照组(P0.05,差异不具有统计学意义。病毒性感染组患者与健康组hs-CRP相比,P>0.05,差异不具有统计学意义。结论 PCT、hs-CRP、WBC及NEUT四项炎症指标均在一定程度上能够反应患者肺部感染的病情。其中PCT的诊断效果最好,在判断肺部感染的严重程度及是否细菌感染中具有重要的临床价值,因此,血清PCT检测可作为肺部感染病情诊断及监测中一种简单、可靠方法。

早期肠内营养对慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭患者营养状态及肿瘤坏死因子、白介素-6的影响目的探讨早期肠内营养对慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重合并呼吸衰竭患者营养状态及肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)的影响。方法选取2013年12月至2017年1月COPD急性加重合并呼吸衰竭于患者90例,将其随机分为对照组和试验组,每组45例。对照组于机械通气后24 h即采用肠外营养支持,试验组采用早期肠内营养支持,14 d为1个疗程。比较两组临床疗效。结果治疗后,试验组TNF-α、血红蛋白(Hb)、IL-6、白蛋白(Alb)各并发症发生率及病死率指标均优于对照组,差异均有统计学意义(P

BiPAP呼吸机联合药物治疗慢性阻塞性肺病急性期的效果目的探讨BiPAP无创呼吸机联合药物治疗慢性阻塞性肺病急性期(AECOPD)疗效及对E-选择素、D-二聚体水平的影响。方法选取2013年9月~2017年2月因AECOPD在我院就诊的82例患者纳入研究并随机分组,对照组40例患者采用常规药物治疗,观察组42例采用药物联合BiPAP无创呼吸机治疗,7 d为1个疗程。比较两组患者的临床疗效。结果治疗后,两组患者FEV1/FVC、血氧分压均升高,二氧化碳分压、D-二聚体及E-选择素水平则降低,观察组改善更显著,差异有统计学意义(P

替罗非班联合尿激酶在ST段抬高性急性心肌梗死中的临床分析目的:探讨替罗非班联合尿激酶在ST段抬高性急性心肌梗死(ASTEMI)中的临床疗效及对炎症反应影响。方法:将2013年10月-2017年1月因ASTEMI于我院就诊的86例患者纳入观察并依据1∶1比例随机分组。对照组43例患者采用尿激酶溶栓,观察组43例联合替罗非班,7d后比较治疗前、后白介素-6(IL-6)、血浆肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎症因子及B型利钠肽(BNP)、LVEF改善情况,比较两组溶栓后120min血液灌注情况。结果:治疗后,两组患者IL-6、TNF-α等炎症因子及BNP降低,LVEF升高(P0.05)。结论:替罗非班联合尿激酶治疗ASTEMI疗效显著,但前者可更好地改善炎症反应,促进心功能恢复,值得推广。

心外膜脂肪组织与冠心病进展的相关性研究及其干预治疗周迎中国人民解放军医学院摘要：背景和目的：心外膜脂肪组织(Epicardial adipose tissue, EAT)为直接沉积在心包和冠状动脉血管周围的脂肪组织,其与心脏及冠状动脉的联系最为紧密。研究表明,EAT与冠状动脉粥样硬化斑块形成和成分,以及管腔狭窄程度和钙化进展密切相关。但EAT体积增加是否可促进支架再狭窄(In-stent restenosis, ISR)及冠状动脉粥样硬化高危斑块进展,目前仍较少有人研究。而且,目前针对EAT作为治疗靶点的研究也较少。本研究旨在以冠状动脉CT成像(Coronary computed tomography angiogrphy, CCTA)作为冠状动脉粥样硬化和EAT体积的无创性影像学评价方法,探讨EAT体积增加与支架再狭窄和冠状动脉粥样硬化高危斑块进展的相关性；并以奥美沙坦酯作为治疗药物,探讨其对EAT体积的影响,以及其在调节EAT活性因子分泌、改善冠状动脉粥样硬化方面的作用。内容与方法：第一部分选择2011年10月至2014年12月于我院行CCTA检查的可疑冠心病患者,并于1个月内在我院首次接受经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention, PCI),1年左右再次行冠状动脉造影检查(Coronary angiography, CAG)随访支架内通畅情况,按入组排除标准,最终共纳入364例患者。根据支架通畅与否，将患者分为ISR组(46例)和NISR组(318例),对ISR相关变量进行单因素和多因素回归分析。第二部分选择2013年5月至2015年4月于我院行CCTA检查的冠心病患者,并于1年左右再次行CCTA检查随访冠状动脉粥样硬化高危斑块进展情况,按入组排除标准,最终共纳入284例患者。根据高危斑块进展与否,将患者分为斑块进展组(52例)和非进展组(232例),对斑块进展相关变量进行单因素和多因素回归分析。第三部分将30只新西兰大白兔按随机方法分成高脂组(n=10)，奥美沙坦酯低剂量组(n=10)和奥美沙坦酯高剂量组(n=10),3组均给予高脂饲料饲养12周,建立动脉粥样硬化模型。模型建立成功后,奥美沙坦酯低剂量组在高脂饲料基础上加用奥美沙坦酯片(5mg/Kg/d),奥美沙坦酯高剂量组在高脂饲料基础上加用奥美沙坦酯片(15mg/Kg/d),所有新西兰大白兔共饲养16周后采血并处死留取病理标本。测量新西兰大白兔体重变化情况及检测血脂变化情况。留取EAT、冠状动脉及主动脉标本行HE染色,观察各组EAT中脂肪细胞及动脉形态变化；行Western blot免疫印迹检测EAT中’使用上海沪震实业有限公司NF-α和脂联素蛋白表达水平；行RT-PCR检测EAT中TNF-α、脂联素、IL-6和ACE2 mRNA表达水平。结果：第一部分：ISR组的EAT体积明显高于NISR组(154.5±74.6 ml vs.131.0±52.2 ml,P还原关键词：心外膜脂肪组织; 双源CT; 支架再狭窄; 斑块进展; 奥美沙坦酯;导师：陈韵岱;分类号：R541.4

具有眼球屏障穿过作用的Tat PTD-Endostatin-RGD的制备、滴眼抑制眼底新生血管生成及眼部药代动力学研究李妍山东大学摘要：视网膜和脉络膜中血管畸形增生是很多疾病导致失明的主要原因,例如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、老年性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,RP)以及视网膜中央和分支静脉阻塞等疾病。对于眼底新生血管疾病目前临床上应用较为广泛的治疗方法包括激光光凝法、玻璃体切除术和药物治疗3种方法。其中,药物治疗应用最为广泛,但由于眼睛存在多种生物膜屏障,使得大分子药物在局部滴眼给药后难以跨膜进入眼底病变处发挥作用,只能通过玻璃体注射的方式进行给药,玻璃体注射往往会给患者带来不可逆的损伤。因此,寻找一种安全、有效、操作简便的治疗方法显得尤为重要。内皮抑素(endostatin, Es)作为一种内源性新生血管抑制剂具有较好的临床应用前景,它不仅可以应用于肿瘤的治疗,而且在抗眼底新生血管疾病方面也发挥着重要作用。但是,Es不能自主穿透眼球屏障到达眼底病变处发挥作用,只能选用传统的玻璃体注射进行给药,同样会给患者带来极大的痛苦与不便。为了使Es能够自主到达眼底,本课题组已证明将具有穿透细胞膜能力的人类1型免疫缺陷病毒HIV反式激活因子的蛋白转导域(protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD)与Es融合表达后得到的重组蛋白Tat PTD-Es能够到达眼底。但是,由于Tat PTD的穿膜能力较强,使得目标分子的分布不可控,导致目标分子不能大量富集于病灶处发挥作用,因此需要对Tat PTD-Es进行进一步改造。整合素αvβ3在新生血管的内皮细胞处高表达,并且具有三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的特异性结合位点,因此RGD对新生血管的内皮细胞具有靶向性。故本课题利用基因工程的方法,将穿膜肽Tat PTD和靶向肽RGD分别融合到Es的N端和C端表达得到重组蛋白Tat PTD-Es-RGD,以期望其能够自主穿透眼球屏障并能靶向治疗眼底新生血管疾病。本课题的研究内容及结果有以下几个方面：(1) Tat PTD-Es-RGD在大肠杆菌中的表达选取pET28a(+)作为表达质粒,构建重组质粒pET28a(+)-Es、pET28a(+)-Tat PTD-Es、pET28a(+)-Es-RGD和pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,转化入E.coli Origami2 (DE3)进行表达,其中表达出的Es和Tat PTD-Es不带有任何标签,而Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD带有纯化标签6×His-tag。利用Ni2+-Sepharose亲和层析纯化Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD,利用Heparin-Sepharose亲和层析纯化Es和Tat PTD-Es,所得产品再经Sephadex G-50进行进一步纯化。为了提高产量,考虑从包涵体中获得目的蛋白。摸索包涵体的洗涤条件,采用稀释法复性包涵体蛋白,考察不同GSSG/GSH对复性效率的影响,最后经亲和层析和Sephdex G-50从复性液中纯化出目的蛋白。结果表明,获得可溶性表达的条件如下：Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD为25℃诱导16h,Tat PTD-Es为37℃C诱导4h；而4种重组蛋白以包涵体形式表达的条件均为37℃诱导4h。3L发酵产物的裂解液上清可分别得到0.5 mg、4.2mg、3.4 mg和3.2 mg的Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD。对于包涵体的复性,Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD复性效率达到最高时,GSSG/GSH分别为1:1、1:1、0.2：1和0.8：1。对于3 L的发酵产物,从包涵体中纯化得到的重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD的产量分别为5.8 mg、9.6 mg、18.9 mg和15.1 mg,纯度分别为90.1%、85.6%、80.6%和90.3%。(2) Tat PTD-Es-RGD的体外活性及体外穿透眼球屏障的能力采用CCK-8法测定从包涵体蛋白中分离纯化得到的重组蛋白Es、Tat PTD-Es、 Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD对人脐静脉内皮细胞EAHY926增殖的抑制作用；利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型评价重组蛋白对CAM血管生成的抑制作用；用划痕实验考察重组蛋白对内皮细胞EAHY926迁移的抑制作用；利用体外血管生成实验考察重组蛋白对内皮细胞EAHY926血管生成的抑制作用。结果表明,4种重组蛋白均能抑制内皮细胞EAHY926的增殖,并具有剂量依赖性,在浓度为8 μmo/L时4种蛋白的抑制率均能达到80%左右；使用上海沪震实业有限公司在CAM模型中,4种重组蛋白均能抑制由bFGF诱导的血管生成,与bFGF组相比Tat PTD-Es-RGD可以使血管面积由(38.4±3.2)%降低到(17.9±2.5)%,并且与Es组相比,其它3种重组蛋白对CAM血管生成的抑制作用均无显著性差异；划痕实验结果表明,重组蛋白Tat PTD-Es-RGD在24 h能抑制(54.92±3.36)%的内皮细胞EAHY926迁移,在48 h仍能抑制(42.30±7.92)%的细胞迁移,4种重组蛋白对内皮细胞迁移的抑制作用相似；Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD能够显著地抑制管状结构的形成,与对照组相比其抑制率分别为(60.77±8.42)%、(60.30±8.41)%、(64.89±6.38)%和(61.70±6.38)%。结果表明,在Es的N端和C端分别引入Tat PTD和RGD后,并没有对Es的活性产生显著性影响。采用air-lifting多层培养大鼠角膜上皮细胞(rat corneal epithelial cell, RCEC)构建体外角膜屏障,采用大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cell, RMEC)和大鼠视网膜微血管周细胞(rat retina microvascular pericytes, RRPC)共培养的方法构建体外血-视网膜屏障(blood retina barrier,BRB)；通过测定跨膜电阻(Trans-epithelial electrical resistance, TEER)值和荧光素钠(Na-F)渗透率对上述两种屏障的性能进行评价；用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记目的蛋白,通过荧光酶标仪来测定穿透屏障的重组蛋白浓度从而判定不同重组蛋白的穿膜能力；利用S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP)上调BRB共培养物中RMEC表面整合素αvβ3的表达量,考察FITC标记的Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力,间接反应两种重组蛋白与RMEC表面整合素αvβ3的结合能力。结果表明,采用上述方法建立的体外角膜屏障和BRB均具有较好的生物膜屏障的特性；对于角膜屏障,与Es相比,Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD组均在下室中检测到较高的荧光强度,且具有显著性差异,而Es-RGD没有显著性差异,这表明Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD具有较强的穿透角膜屏障的能力；BRB模型中检测到与角膜屏障相似的结果,表明相对于Es而言,Tat PTD-Es和TatPTD-Es-RGD同样具有较强的穿透BRB的能力；与未加入SNAP刺激的BRB模型相比,Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力显著性地降低,而Tat PTD-Es并未与之前表现出显著性差异,由此可以间接证明Tat PTD-Es-RGD与RMEC表面的整合素αvβ3具有较高的亲和性。(3) Tat PTD-Es-RGD眼部药代动力学及药效学研究对重组蛋白的眼部药代动力学进行研究,考察4种重组蛋白在滴眼给药后能否到达视网膜及在视网膜的代谢情况。结果显示Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在视网膜中的最高浓度(Cmax值)分别为(8.43±0.85)ng/mg和(9.42±0.77)ng/mg,与Es最高浓度(0.68±0.10)ng/mg相比,显著性升高。Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在视网膜中的半衰期(T1/2)分别为(9.64±1.31)h和(11.03±1.95)h,另外两种蛋白质的半衰期没有统计学差异。表明带有Tat PTD的重组蛋白能够通过局部滴眼到达眼底,而且Tat PTD-Es-RGD的浓度相对较高。建立氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型,通过滴眼给药后,对4种重组蛋白的药效学进行评价。视网膜铺片结果表明,与负对照组相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼组的无灌注区面积和新生血管簇面积显著性降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼组的效果要显著优于Tat PTD-Es;HE染色结果说明,与负对照组相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼组突破视网膜内界膜的细胞核数显著性地降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼组更低；免疫组化结果显示,与负对照组相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼能够显著性地抑制VEGF在视网膜处的表达,且外源性Es的染色结果显示,这两种重组蛋白通过滴眼给药的方式能够到达视网膜。以上结果证明,Tat PTD-Es-RGD和TatPTD-Es均能够通过局部滴眼的给药方式到达视网膜并发挥抑制新生血管生成的活性,且由于靶向肽RGD的引入使得Tat PTD-Es-RGD的效果要优于Tat PTD-Es。(4) Tat PTD-Es-RGD抗肿瘤转移活性的研究建立黑色素瘤B16-F10人工肺转移模型,考察重组蛋白对肿瘤转移的抑制作用。结果显示,造模后腹腔注射不同重组蛋白(20 mg/kg)14 d,均能显著性降低小鼠肺表面的肿瘤结节数,且Tat PTD-Es-RGD组的结节数要显著地低于其它3种重组蛋白组；HE染色结果表明给药组的肺组织肿瘤结节面积明显降低,细胞核异性数明显减少,并少见炎症细胞浸润,其中Tat PTD-Es-RGD组的肿瘤结节的面积最小。免疫组化结果显示,4种重组蛋白均能显著性地抑制CD34的表达,CD34+微血管面积与阴性对照组相比显著性降低,其中在Tat PTD-Es-RGD组中达到最低。这表明,重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有较好的抗肿瘤转移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要显著高于其它3种重组蛋白。本研究取得的成果和结论：(1)首次构建出大肠杆菌表达菌株pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,并成功获得纯度较高的重组蛋白。(2)重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均能在体外抑制内皮细胞的增殖、迁移、血管生成及CAM血管生成,并表现出较好的体外活性。(3) Tat PTD能够携带Es穿透体外角膜屏障和BRB,而Tat PTD-Es-RGD与RMEC表面整合素αvβ3分子具有较高的亲和性。(4)重组蛋白Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD能够通过局部滴眼到达视网膜并发挥较好的药效,并且Tat PTD-Es-RGD的药效要优于Tat PTD-Es。(5)重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有较好的抗肿瘤转移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要显著高于其它3种重组蛋白。 还原关键词：Tat PTD; Endostatin; RGD; 眼球屏障; 视网膜新生血管;导师：王凤山;分类号：R943

骨髓间充质干细胞NMⅡ基因调控对吸入性损伤疗效及机制研究王俊杰第二军医大学摘要：研究背景吸入性损伤在人类城市发展史中曾造成巨大的灾难,1942年美国波士顿椰树林夜总会火灾,密闭空间起火后患者吸入大量未燃烬的烟雾、炭粒、有刺激性的化学物质等,虽经抢救,但是大量死亡,共造成造成492人死亡,成为美国伤亡最为惨重的火灾事故,主要就是吸入性损伤所致。上海2010年11月15日,静安区胶州路重大火灾,上海市医疗机构共救治伤员127人,其中死亡41人,收治住院治疗71人,死亡和住院的大部分人都有吸入性损伤,其发病率和病死率非常高。骨髓间充质干细胞（BMSC）是一类具备自我更新和分化潜能的多能干细胞,取材简便,不会发生免疫排斥反应,具有重要的免疫调节和抗炎活性,研究发现其能够向多种组织诱导分化,如骨、软骨等,同时具备较强的内分泌能力和免疫调节功能,是理想的组织修复来源,近年研究证实,BMSC移植能改善急性肺损伤（ALI）肺内及全身的炎症反应,调节ALI体内免疫紊乱,“归巢”至肺损伤区域,向肺内功能细胞分化并发挥相应功能,参与受损肺组织的修复,因而被认为是急性肺损伤治疗中极具前景的治疗措施。虽然BMSC移植治疗ALI有很好的效果,但是在体内的移植率和存活率受多因素影响,坏死或凋亡是最主要形式,因此,提高或者改善BMSC移植后在体内的移植率和存活率是这种治疗方法得到广泛应用的关键所在,越来越多的研究者提出了多种学说,探索了多种方法以期能够提高移植BMSC的移植率和存活率。肌球蛋白是一种球蛋白,是肌肉的主要组成分子,主要为肌肉收缩提供力,它具有酶的活性,可以通过与肌动蛋白相互作用,水解ATP的末端磷酸基团和GTP、CTP等,将化学能转化为机械能。肌球蛋白也广泛存在于非肌肉组织中称为非肌肉球蛋白,非肌肉肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosinⅡ,NMⅡ）是非肌球蛋白家族中的一种,文献报道它是多种疾病的关键分子,参与了细胞的各种生理活动,特别是信号转导方面,它是细胞正常生理活动的一种关键蛋白分子,具有很重要信号转导和调节作用,因此具有很高的研究价值。鉴于此,我们选取NMⅡ为研究对象,并经过前期研究发现,下调骨髓间充质干细胞中非肌肉球蛋白NMⅡ,再移植到烟雾急性肺损伤的模型上,通过比较发现其效果比单纯无修饰的骨髓间充质干细胞移植效果更好。通过进一步研究发现,调控NMⅡ基因可以使骨髓间充质干细胞在移植凋亡、减轻炎症反应等方面比未调控NMⅡ基因的骨髓间充质干细胞更为明显。通过一系列实验后我们发现,下调NMⅡ基因表达能够抑制干细胞凋亡,促进骨髓间充质干细胞归巢至损伤部位,降低损伤部位炎症反应,比传统的单纯使用间充质干细胞更为有效,尤其对毛细血管丰富的肺部损伤更加有效。对NMⅡ基因进一步深入研究,可以为干细胞治疗烟雾吸入性损伤以及ALI/ARDS引入新的研究靶点并向临床应用转化。第一部分骨髓间充质干细胞的制备及鉴定研究目的:根据课题研究的目的,制备骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为后续研究NMⅡ基因调控治疗吸入性损伤模型的疗效和保护机制提供载体。研究方法:大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养过程如下:选取周龄4周,体重160g-200g左右的雄性大鼠,分离大鼠的股骨和胫骨获取骨髓,200目滤网过滤至细胞培养皿中,在37°C温度下5%CO2培养箱中进行贴壁培养,细胞培养2-3代后进行形态学鉴定、表面抗原鉴定、分化潜能的鉴定。研究结果:显微镜下观察到贴壁细胞的形态大小不一,形态各样,大部分成梭形生长,形态类似成纤维细胞;流式细胞仪检测细胞表型鉴定为符合骨髓间充质干细胞的表面抗原;细胞经过成脂成骨诱导后为阳性。研究结论:经过鉴定,所获取的细胞为骨髓间充质干细胞。第二部分干扰NMⅡ表达的载体构建和细胞株的筛选研究目的:制备NMⅡ表达降低的细胞株,为后续治疗提供细胞。研究方法:通过干扰序列的设计和重组载体的构建,转染前面已鉴定的骨髓间充质干细胞中,然后进行鉴定。研究结果:得到重组后的PLL载体,转染至骨髓间充质干细胞中,得到了NMⅡ表达降低的骨髓间充质干细胞研究结论:经过鉴定,转染重组载体的骨髓间充质干细胞NMⅡ表达降低。第三部分骨髓间充质干细胞NMⅡ基因调控对吸入性损伤疗效及机制研究研究目的:检测NMⅡ基因调控的骨髓间充干细胞对吸入性损伤模型的治疗效果并探讨其机制研究方法:首先建立烟雾吸入性肺损伤模型;实验动物进行分组为对照组,损伤组,BMSC治疗组,BMSC-Sh RNA治疗组四组;分别采集大鼠动脉血进行血气分析;使用探针CM-Di I标记的骨髓间充质干细胞技术检测细胞在大鼠体内的分布情况;大鼠支气管肺泡灌洗液的收集;大鼠肺脏的干湿比测定;HE检测24h肺部的炎症反应情况;使用上海沪震实业有限公司ELISA检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α和IL-10因子;NMⅡ基因沉默对BMSC细胞凋亡的影响;NMⅡ基因沉默对BMSC细胞旁分泌系统的影响。研究结果:干细胞移植后的24h时间点取血进行血气分析发现,损伤组大鼠出现明显的低氧血症、二氧化碳潴留和酸中毒症状;而治疗组与损伤组比较差异具有显著性,可推断BMSCs移植后对肺损伤有治疗作用。使用CD-Di I标记的转染NMⅡ-Sh RNA的骨髓间充质干细胞,尾静脉注射吸入性损伤模型,1、4、7天取大鼠肺脏,染色,荧光显微镜下观察到BMSCs细胞的归巢。HE染色发现干扰组的损伤情况明显减轻。肺泡灌洗液（BALF）El ISA法检测肺泡灌洗液中TNF-a降低和IL-10的浓度升高。细胞实验中的干扰组比为干扰组的caspase-3表达明显降低。NMⅡ基因沉默对BMSC细胞旁分泌系统HGF的VEGF都比正常组升高。研究结论:下调NMⅡ基因表达能够抑制干细胞凋亡,促进骨髓间充质干细胞归巢至损伤部位,降低损伤部位炎症反应,比传统的单纯使用间充质干细胞更为有效。 还原关键词：非肌肉球蛋白Ⅱ; 骨髓间充质干细胞; 吸入性损伤; 凋亡;导师：夏照帆;分类号：R644

细胞侵袭服务matrigel是从小鼠ehs肉瘤中提取的基质成分，含有ln、iv型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在dmem培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8μm，而且膜孔都被matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。可通过这种模型来检测细胞的侵袭情况。 　　通过体外模型来检测细胞的侵袭情况，主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究。 实验步骤：　　1. matrigel在4℃过夜融化　　2. 稀释matrigel至终浓度1mg/ml　　3. 在chamber上室底部中央垂直加入稀释后的matrigel。37℃温育4-5 h　　4. 所有细胞培养试剂和transwell chamber放在37℃恒温水浴箱温育　　5. 消化培养至对数期的细胞，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为5*105/ml　　6. 在下室加入含20%血清的培养基。上室加入细胞悬液，37 ℃、5％co2、饱和湿度条件下继续培养24 h　　7. 取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入甲醇的孔中，室温固定30min　　8. 取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入结晶紫染液的孔中，室温染色15-30min；用pbs冲洗浸泡数次，取chamber，先用干棉签将上室内液体吸去，再用棉签轻轻擦matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞　　9. 揭下膜表面上的细胞，晾干，封片　　10. 显微镜下计数，统计结果；（若不用保存底膜，可省去步骤9） 结果示意图：     服务周期：服务内容说明价格∕元实验周期细胞侵袭建议3重复1000/板3个工作日温馨提醒：　　1. 提供105细胞　　2. 一块板共有24个小室，不足一块板按照一块板收费

干细胞培养服务干细胞(stem cells, sc)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，es细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。 我们提供：　　提供106冻存细胞和图片 服务周期：服务内容说明价格∕元实验周期干细胞培养培养方案询价15-30个工作日温馨提醒：　　提供新鲜组织标本和实验方法

原代细胞培养服务细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。 　　这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。 实验步骤：　　1. 试剂耗材准备　　2. 取新鲜动物组织　　3. 酶消化　　4. 过滤网筛选、分离细胞　　5. 加培养液，37℃、5%co2培养　　6. 传代　　7. 冻存　　8. 复苏 我们提供：　　提供106冻存细胞   服务周期：服务内容说明价格∕元实验周期原代培养新鲜组织和方案询价15-30个工作日温馨提醒：　　提供新鲜组织标本

培养基制造和灭菌的办法以及步骤微生物培育基是供微生物成长、繁衍、代谢的混合养料。因为微生物具有不同的养分类型，对养分物质的要求也各不相同，加之研究的意图不同，所以培育基的种类许多，运用的质料也各有差异，但从养分视点剖析，微生物培育基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、成长素以及水分等。别的，培育基还应具有适合的 pH 值、必定的缓冲才能、必定的氧化还原电位及适宜的渗透压。为了到达特定要求的研究，需求进行培育基制造和灭菌，那么微生物培育基该怎么制造与灭菌呢?1. 调理 pH 值用 pH 试纸 (或 pH 电位计、氢离子浓度比色计) 测验培育基的 pH 值， 如不契合需求，可用 10%HCl 或 10%NaOH 进行调理, 直到调理到配方要求的 pH 值停止。2. 分装已过滤的培育基应进行分装。 如果要制造斜面培育基，须将培育基分装于试管中。 如果要制造平板培育基或液体、半固体培育基，则须将培育基分装于锥形瓶内。3. 过滤用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培育基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。4. 制造溶液向容器内参加所需水量的一部分，按照培育基的配方，称取各种质料，顺次参加使其溶解，最终补足所需水分，对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热进程所蒸腾的水分，应在悉数质料溶解后加水补足。制造固体培育基时，先将上述已配好的液体培育基煮沸，再将称好的琼脂参加，持续加热至彻底消融。并不断搅拌，防止琼脂糊底烧焦。分装时，一手捏松绷簧夹，使培育基流出，另一只手抓住几支试管或锥形瓶，顺次接取培育基。分装时, 注意不要使培育基粘附管口或瓶口，防止浸湿棉塞引起杂菌污染。装入试管的培育基量，视试管和锥形瓶的巨细及需求而定。一般制造斜面培育基时，每只 15×150 毫米的试管，约装 3～4 毫升 (1/4～1/3 试管高度)，如制造深层培育基，每只 20×220 毫米的试管约装 12～15 毫升。每只锥形瓶装入的培育基，一般以其容积的一半为宜。5. 制造斜面培育基和平板培育基培育基灭菌后，如制造斜面培育基和平板培育基，须趁培育基未凝结时进行。(1) 制造斜面培育基。在试验台上放 1 支长 0.5～1 米左右的木条，厚度为 1 厘米左右，将试管头部枕在木条上，使管内培育基天然歪斜，凝结后即成斜面培育基。(2) 制造平板培育基。将刚刚灭过菌的盛有培育基的锥形瓶和培育皿放在试验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手翻开培育皿盖, 右手敏捷将培育基倒入培育皿中，每皿约倒入 10 毫升，以铺满皿底为。铺放培育基后放置 15 分钟左右，待培育基凝结后，再 5 个培育皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24 小时后查看，如培育基末长杂菌，即可用来培育微生物。6. 加棉塞分装结束后, 需求用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的首要意图是过滤空气，防止污染。棉塞应选用普通新鲜、干燥的棉花制造，不要用脱脂棉，防止因脱脂棉吸水使棉塞无法运用。制造棉塞时，要根据棉塞巨细将棉花铺展成恰当厚度，揪取手掌心巨细一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，一起左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成 1 个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应敏捷塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为适宜。棉塞的 2/3 应在管内或瓶内，上端露出少量棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。

ELISA实验中突发问题与相应的解决办法ELISA试剂盒试验时可能遇到的问题：1、过长(特别是室内温度较高时)。2、手工操作中，加样板过多形成加样后放入孵箱前等待时间。3、加完标本再加酶试剂时酶溅起孔外。.血清或血浆标本别离欠好即进行加样。 ELISA试剂盒的相应解决办法：标本为血清：最好将血液先天然寄存1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟，标本为血浆：有必要运用含抗凝剂的血液标本搜集管，采血后有必要当即倒置采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟，若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃的低温冰箱内。1、加样后及时放入孵箱。2、加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。3、如果选用AT或其他全自动加样，最好挑选FAME或其他后处理仪器加酶试剂。4、标本较多时，请分批操作。

在ELISA试剂盒中温育的小技巧ELISA试剂盒总需求时间来保温，是因为ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，参与板孔中的标本，其间的抗原并不是都有对等的和固相抗结合的机遇，只需最靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐渐平衡的进程，因此需经涣散才干抵达反应的结尾。在ELISA试剂盒中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的结束需求有必定的温度和时间，这一保温进程称为温育，有人称之为孵育，在ELISA试剂盒中似不恰当。保温的办法除有的ELISA试剂盒仪器附有特制的电热块外，一般均选用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度灵敏平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA试剂盒应放在湿盒内，湿盒要选用传热性出色的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最终将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规矩的温度，特别是在气温较低的时分更应如此。无论是水浴仍是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能灵敏平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严峻约束在规矩的范围内，标准室温温度是指20～25℃，但具体操作时可根据说明书的要求操控温育。室温温育时，ELISA试剂盒只需平置于操作台上即可。应留心温育的温度和时间应按规矩力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板一同测定。

ELISA试剂盒试验清洁留意注意事项今日咱们来看看公司为大家共享的ELISA试剂盒试验清洁方面应留意什么：1. 加样① 标本为血清：最好将血液先天然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：有必要运用含抗凝剂的血液标本搜集管，采血后有必要当即倒置采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。② 加样后及时放入孵箱。③ 加酶试剂后用吸水纸在酶标板外表轻拭吸干。④ 假如选用AT或其他全自动加样，最好挑选FAME或其他后处理仪器加酶试剂。⑤ 标本较多时，请分批操作。2. 洗板① 确保洗液注满各孔，洗板针疏通，洗完板后最好在吸水纸（挑选洁净、无或少尘的吸水资料）上轻轻拍干；② 合理安排，或多用几台洗板机。3. 读板应确保酶标板清洁，在整个操作过程中确保酶标板不接触次氯酸；尽可能结束ELISA检测规范自动化，有用行进检测质量。

进行ELISA实验时所要留心的疑问在ELISA试剂盒实验操作所恳求的条件是比照严峻的，无论是对实验的硬件条件仍是对实验的操作人员的技术恳求，都是如此。下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要留心15个疑问。1、要保证移液枪的精确性，过失不能超过2%。可用水和电子天平进行断定。但最佳有专业人员进行纠正。2、要装备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。罗致不一样的液体后，要更换枪头。即使是罗致标准品时。3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使效果更安稳。4、ELISA试剂盒实验时，要使底物避光保存。5、温浴时，要用封板膜封好酶标板，防止水分的蒸发。6、待检样品要弄清，否则会影响效果。7、温浴时刻应恪守试剂盒规则。8、应尽量做双孔实验，这么才华保证数据的精确性。9、ELISA试剂盒对效果有疑问的样品要用其它方法进行确证。10、查看前，要翻开酶标仪，使之安稳10分钟以上。11、底物有必定的毒性，中止液对肌肤有腐蚀性，应尽量防止接触。12、用枪罗致液体时速度不能太快，防止发生气泡而使罗致量不精确。13、罗致液体时，要用量程和需要量靠近的枪去吸，削减过失。14、将液体加到酶标孔中时，防止枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会天然流下去。15、洗板时，每次洗液参与后，应静置1-2分钟，使清洁更加彻底。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。

春节放假公告上海沪震实业有限公司全体员工：向敬爱的顾客朋友们致以节日的问候和真诚的祝福，祝愿我们的客户在新的一年里万事如意幸福吉祥！自2018年2月10日至2018年2月25为我公司放假期，届时将停止发货，所有订单都将在春节假期回来的第一天处理，预定商品2天内陆续发出，给您带来的不便，敬请谅解！提前预祝大家春节快乐！团团圆圆！阖家幸福，因放假给您带来不便，敬请原谅。

innov-research现货促销            关于innov-research创新性的研究是在1998后实现的，即实现可靠、高质量和负担得起的研究材料是很困难的。从人血浆和血清的核心产品，创新的研究已经成为一个值得信赖的实验室所有试剂供应商，包括人类的生物制品及ELISA试剂盒。 今天，我们生产和超过3000的高质量的人类和动物生物制品包括血浆、血清、组织供应，和蛋白质。2007，我们构建并搬到我们在Novi的艺术境界，密歇根（下图）以适应我们不断增长的产品线。Innovative 公司提供各种动物血浆，抗凝剂如血浆纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)，抗体， 纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)即凝血因子Ⅰ，血纤维蛋白溶酶原plasminogen，纤溶酶(plasmin，PL)，纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)，组织外连素（vitronectin，VN）， 组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)、肾素Renin，血小板生成素(thrombopoietin， TPO)， ELISA 试剂盒。www.innov-research.com

GoldBio现货促销        Gold Biotechnology公司是由Paul Gold博士创立于1986年，其旨在为实验室研究人员提供低成本高品质的产品。由于我们低廉的价格和对客户的恪守承诺，GoldBio得到了世界各地的 研究人员的支持。多年来，我们的客户已表示对我们公司继续提供最低价格最优质产品的承诺很有信心。Goldbio提供1500多种分子生物学级产品，同时 具有一个活跃的分子生物学研究与发展计划，旨在为您的研究开发新产品。热销产品：荧光素钾盐  X-gluc  双丙氨磷   草胺磷  X-a-gal关于美国关于GoldBio：goldbio研究金生物科技股与每个研究者视野：生命科学研究的各个方面将为我们介绍一种有效的发现和学习的未来，造福整个世界。我们的愿景会实现的更快如果一个研究者的热情不因为担心他们的试剂的质量，尤其是对质量成本。这就是我们在这里的原因！我们相信未来的变化和繁荣，我们希望帮助你成为一个资源，为高质量的产品在特殊的价格。我们的客户提供最好的化学物质可能在goldbio实验室测试来保证我们自己的质量规格符合要求，你可以确定你的研究将非常顺利。 使命陈述：“在GoldBio，我们努力超越客户的期望，通过高质量的产品供应商和战略合作伙伴，卓越的服务和对细节的关注。我们的可持续经营模式和与其他供应链的关系，使我们能够为研究人员和科学家提供独特的低价格，同时保持最高质量的行业。我们全力支持我们所有的产品，希望它们能被用于造福所有人的发现中。我们的理念：提供最高质量的产品保持低成本传递给研究人员是这个行业的倡导者作为忠诚的商业伙伴支持我们的客户成为行业内的盟友满怀希望地推出产品展望未来我们怀着希望展望未来，因为我们送出我们的产品，目的是将它们用于伟大的发现。我们是一家小公司，致力于为我们所提供的人的成功而努力。因此，我们向科学家和研究人员提供高质量的低成本材料。我们给客户最好的东西，让他们发现、发明和创新。因为这就是我们的发现…。质量承诺：我们致力于为客户提供最优质的产品。我们测试我们的产品从我们信任的全球供应商网络，以确保他们满足我们的质量规格。我们支持我们所有的产品，知道我们的信誉取决于你们试验的成功。历史：Paul Gold博士20世纪80年代，Paul Gold博士从替补席上走出来，认为研究人员需要一种低成本、高质量的化学试剂替代品。认识到他的企业的诀窍，他开始酝酿的想法，一个公司的时候，创业孵化器几乎是闻所未闻的期间，与互联网、社交媒体与众不存在。有一个支持的妻子，慷慨的家庭成员，在他的网络有帮助的人，金博士在1986建立的goldbio。最初的主办公室位于前圣路易斯技术中心（现在是圣路易斯科学中心所在地），而第一个实验室位于圣路易斯大学。雄心勃勃的创业旅程的开端销售三种产品：IPTG、X-gal和后。现在，经过近30年的发展，goldbio已经有了明显的变化，从三个产品扩大到超过3000的产品目录。纵观历史，goldbio的成功依赖于那些我们提供成功的承诺。在goldbio，我们相信，把我们的产品质量在手中导致发现影响整个世界。www.goldbio.com

用DNA 芯片技术检测基因的表达实验步骤一、芯片制备基因芯片的制备主要有两种基本方法，一是在片合成法，另一种方法是点样法。在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。目前，已有多种模板技术用于基因芯片的在片合成,如光去保护并行合成法、光刻胶保护合成法、微流体模板固相合成技术、分子印章多次压印原位合成的方法、喷印合成法。在片合成法可以发挥微细加工技术的优势，很适合制作大规模DNA探针阵列芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。美国Affymetrix公司制备的基因芯片产品在1.28*1.28cm2表面上可包含300,000个20至25mer寡核苷酸探针，每个探针单元的大小为10um X 10um。其实验室芯片的阵列数已超过到1,000,000个探针。 基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。这种方式较灵活，探针片段可来自多个途径，除了可使用寡聚核苷酸探针，也可使用较长的基因片段以及核酸类似物探针（如PNA等）。探针制备方法可以用常规DNA探针合成方法、或PCR扩增的cDNA、EST文库等。固定的方式也多种多样。点样法的优越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和仪器或cDNA探针库，探针的长度可以任意选择，且固定方法也比较成熟，灵活性大适合于研究单位根据需要自行制备科研型基因芯片，制作点阵规模较小的商品基因芯片。 二、靶基因样品的制备与普通分子生物学实验一样，靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和组织中提取模板分子，进行模板的扩增和标记。基因芯片包括大量探针分子，因此，靶基因样品的制备方法将根据基因芯片的类型和所研究的对象(如mRNA 、DNA等)而决定。对于大多数基因来说，mRNA 的表达水平大致与其蛋白质的水平相对应，因此，对细胞内mRNA 表达水平进行定量检测对于了解细胞的性质与状态十分重要。用基因芯片可以对细胞内大量基因的mRNA表达差异进行检测，其靶基因的制备一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物进行扩增。待测样品的标记，主要采用荧光分子。常规标记的过程是通过在扩增过程中加入含有荧光标记的dNTP（至少一种为荧光标记的），荧光标记的单核苷酸分子，在转录和复制过程中，被引入新合成的DNA片段。后者变性后，即可与基因芯片上的微探针阵列进行分子杂交。也可采用末端标记法，直接在引物上标记荧光。即在引物合成时通过应用荧光标记的dNTP制备荧光标记引物，或通过标记生物素，进行荧光标记。对于阵列密度较小的基因芯片(经常用膜片作为基底)可以用同位素检测法，采用32P标记技术，这样可以运用现在普通使用的同位素显影技术和仪器。但是，在使用同位素靶基因标记法过程中，一些表达量高杂交信号强的点阵，容易在其周围产生光晕，当其周围点阵的杂交信号较弱时，其杂交信号容易受到强杂交信号的掩盖。  三、靶基因的杂交及其信号的检测cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与一般常规的分子杂交过程基本相同。在基因芯片的杂交检测中，为了更好的比较不同来源样品的基因表达差异，或者为了提高基因芯片检测的准确性和测量范围，通常使用多色荧光技术。即把不同来源的靶基因用不同激发波长的的荧光探针来修饰，并同时使它们与基因芯片杂交。通过比较芯片上不同波长荧光的分布图，可以直接获得不同样品中基因表达的差异。人们还发展了其它灵敏度高、特异性好的基因芯片杂交检测方法。例如短序列偶联法。该方法首先将非标记的DNA靶序列与基因芯片上探针阵列进行完全杂交，若基因芯片上探针的固定端是5’端时，继续以靶基因为模板，可以在暴露于溶液中的3’-OH上用DNA聚合酶合成上新的带有荧光标记的碱基（ddNTPs）。通过检测ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 美国Nanogen公司提出了一种通过交变电场加速基因芯片的杂交速度的主动式基因芯片。他们利用核酸分子所带的负电性质，通过快速反转电场的极性，使靶基因与探针间产生快速结合和分离。通过控制电场的大小，使得完全匹配杂交的核酸分子保留在阵列表面，而非特异性结合的DNA在电场的作用下与探针分离。这种芯片的分子杂交速度可缩短至1分钟以下甚至数秒（cheng et al，1998），因此有较广阔的应用前景。

淋巴细胞的分离和激化实验实验试剂1. PBS（Dulbecco）：   0.10g/L 无水CaCl2   0.20g/L KCl   0.20g/L KHPO4   0.10g/L MgCl2.6H2O   8.00g/L NaCl   2.16g/L NaH2PO4.7H2O   调pH至7.42. 生长培养基：   不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基   10% FBS   庆大霉素（可不用）（10μg/ml）   2mmol/L L-谷氨酰胺   1mmol/L 丙酮酸钠3. 促细胞分裂剂（终浓度）   5μg/ml PHA：1mg/ml母液-20℃分装冻存   25μg/ml 刀豆凝集素A（conA）：0.4mg/ml母液-20℃分装冻存   商陆促分裂原：再水华母液-20℃分装冻存实验步骤1. 收集10ml全血，加入不含防腐剂的肝素（0.2ml肝素/10ml全血）。实验全过程保持无菌操作。2. 在15ml离心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖，室温放置20~30min，沉降红细胞。沉降时间不宜过长，否则单核细胞将不再保留在富含白细胞的血浆。3. 从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层的富含白细胞的血浆。4. 富含白细胞的血浆室温300g离心8min，沉淀细胞。5. 弃上清，细胞轻悬于1ml PBS中。6. 于室温下，用无菌巴斯德吸管小心将细胞悬液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技术熟练，才能保持血浆曾在Ficoll-Hypaque层之间界面清晰。7. 400g低温（4℃）离心30min，沉淀细胞。离心后切记不要破坏管中的分层。8. 淋巴细胞在血浆和Ficoll-Hypaque层之间的白色浑浊条带中，小心取出贮存，弃红细胞沉淀。9. 5ml PBS洗一次细胞，室温250g离心5min，沉淀细胞悬于3~5ml生长培养基中。10. 全部细胞悬液转移至T25组织培养瓶，加促细胞分裂剂。

双抗原夹心检测抗体 的原理示意动物疫病抗体的检测方法有2种，a通过elisa试剂盒检测；b 通过胶体金试纸条检测。相比较方法b的检测速度，检测方便程度要高于方法a。工具/原料胶体金试纸条方法/步骤通过胶体金检测血清中未知抗体的方法，采用双抗原夹心检测抗体的方法。双抗原加心的原理是，将抗原固定在固相载体表面，抗体与抗原结合后，洗去未结合的杂质抗体，由于抗体2条臂不能同时结合抗原，此时将经过酶标或者金标的抗原加入，使其与抗体的另外一条臂结合，经显色剂显色。示意图如下2此方法可以应用于胶体金和elisa，更多的是应用于胶体金（如乙肝抗体的检测），elisa可用间接法来检测抗体。3希望对感兴趣的朋友有帮助。

elisa方法检测（血清中）抗体浓度我们从构建好的大量抗体中筛选出候选抗体，然后要注入小鼠和食蟹猴体内，在不同时间点取血清，测定其中的抗体浓度，计算抗体的pk值，以进行进一步的抗体筛选。因此要进行大量的elisa实验。工具/原料试剂：1. 双蒸水（实验室制备） 2. 包被液：碳酸盐缓冲液 na2co3 159mg nahco3 293mg ddh2o to 100ml 3. 1×pbs（实验室配置） nacl 8g kcl 0.2 kh2po4 0.27g na2hpo4 ?12h2o 3.58g ddh2o to 1l 4. pbst（实验室配置）：adding 500ul tween20 into 1l 1×pbs. 5. blocking solution: 2% bsa bsa 2g 1×pbs to 100ml 6. bsa（beyotime， cat number：st023） 7. antigen (pepro tech, cat:200-04r ), dissolved in ddh2o and prepared 100ug/ml stocking solution. 8. human antibodies (mammalian cell expressed) 9. secondary antibody(hrp conjugated)（sino biotechnology, cat: ssa002. working solution：dilute secondary antibody at 1:2000 with 1% bsa . 10. tmb（solarbio，cat number：pr1200） 11. 2m 硫酸（实验室配置）材料： 1. 15ml 离心管（nunc） 2. 96-well elisa 酶标板（jetbio） 3. 300ul 多通道移液器（rainin） 4. 10ul、200ul、1000ul 单通道移液器（rainin） 5. 1.5ml 离心管仪器： 1. 恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司） 2. 酶标仪（md flexstation3）方法/步骤方法：1.         配制抗原包被液。2.        将配好的抗原包被液加入到加样槽中，使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧) 加入96-well 酶标板中，每孔100ul。加样时要注意避免气泡并避免液体粘附于孔壁。加样时使pipette的各个tip对准96-well一行中的各个孔，按照由b行至g行的顺序，逐行加入。 1.        将96-well酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后， 4℃ 冰箱中孵育过夜。2.        第二天，将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。3.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×pbs，每孔300ul。4.        室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。5.        重复步骤5和6，共计三次。 6.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入blocking solution，每孔300ul。7.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。(37℃ or lower?)8.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。9.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入pbst，每孔300ul。10.    室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。11.    重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。12.    ※将稀释好的抗体依次加入到相应的孔中，每个样品做三个复孔，每孔100ul。(加样方法，方向如下。) 1.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。2.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。3.        重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。4.        使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution，每孔100ul。5.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。6.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。7.        重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。8.        确保环境温度为25℃，使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well 板中逐排加入tmb溶液，每孔100ul。9.        25℃下，保温3min，立即使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well板中加入2m h2so4 溶液终止反应。10.    静置5min后，将96-well板置于flexstation iii 于450nm检测读数。 (在flexstation iii的工作站软件中选择endpoint/hrp-tmb 方法)※  抗体稀释方法：prepare 0.1ug/ml antibody solution；then to prepare antibody working solution as below： end注意事项使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧);