具有眼球屏障穿过作用的Tat PTD-Endostatin-RGD的制备、滴眼抑制眼底新生血管生成及眼部药代动力学研究-沪震生物文献

具有眼球屏障穿过作用的Tat PTD-Endostatin-RGD的制备、滴眼抑制眼底新生血管生成及眼部药代动力学研究

李妍

山东大学

摘要：视网膜和脉络膜中血管畸形增生是很多疾病导致失明的主要原因,例如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、老年性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,RP)以及视网膜中央和分支静脉阻塞等疾病。对于眼底新生血管疾病目前临床上应用较为广泛的治疗方法包括激光光凝法、玻璃体切除术和药物治疗3种方法。其中,药物治疗应用最为广泛,但由于眼睛存在多种生物膜屏障,使得大分子药物在局部滴眼给药后难以跨膜进入眼底病变处发挥作用,只能通过玻璃体注射的方式进行给药,玻璃体注射往往会给患者带来不可逆的损伤。因此,寻找一种安全、有效、操作简便的治疗方法显得尤为重要。内皮抑素(endostatin, Es)作为一种内源性新生血管抑制剂具有较好的临床应用前景,它不仅可以应用于肿瘤的治疗,而且在抗眼底新生血管疾病方面也发挥着重要作用。但是,Es不能自主穿透眼球屏障到达眼底病变处发挥作用,只能选用传统的玻璃体注射进行给药,同样会给患者带来极大的痛苦与不便。为了使Es能够自主到达眼底,本课题组已证明将具有穿透细胞膜能力的人类1型免疫缺陷病毒HIV反式激活因子的蛋白转导域(protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD)与Es融合表达后得到的重组蛋白Tat PTD-Es能够到达眼底。但是,由于Tat PTD的穿膜能力较强,使得目标分子的分布不可控,导致目标分子不能大量富集于病灶处发挥作用,因此需要对Tat PTD-Es进行进一步改造。整合素αvβ3在新生血管的内皮细胞处高表达,并且具有三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的特异性结合位点,因此RGD对新生血管的内皮细胞具有靶向性。故本课题利用基因工程的方法,将穿膜肽Tat PTD和靶向肽RGD分别融合到Es的N端和C端表达得到重组蛋白Tat PTD-Es-RGD,以期望其能够自主穿透眼球屏障并能靶向治疗眼底新生血管疾病。本课题的研究内容及结果有以下几个方面：(1) Tat PTD-Es-RGD在大肠杆菌中的表达选取pET28a(+)作为表达质粒,构建重组质粒pET28a(+)-Es、pET28a(+)-Tat PTD-Es、pET28a(+)-Es-RGD和pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,转化入E.coli Origami2 (DE3)进行表达,其中表达出的Es和Tat PTD-Es不带有任何标签,而Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD带有纯化标签6×His-tag。利用Ni2+-Sepharose亲和层析纯化Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD,利用Heparin-Sepharose亲和层析纯化Es和Tat PTD-Es,所得产品再经Sephadex G-50进行进一步纯化。为了提高产量,考虑从包涵体中获得目的蛋白。摸索包涵体的洗涤条件,采用稀释法复性包涵体蛋白,考察不同GSSG/GSH对复性效率的影响,最后经亲和层析和Sephdex G-50从复性液中纯化出目的蛋白。结果表明,获得可溶性表达的条件如下：Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD为25℃诱导16h,Tat PTD-Es为37℃C诱导4h；而4种重组蛋白以包涵体形式表达的条件均为37℃诱导4h。3L发酵产物的裂解液上清可分别得到0.5 mg、4.2mg、3.4 mg和3.2 mg的Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD。对于包涵体的复性,Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD复性效率达到最高时,GSSG/GSH分别为1:1、1:1、0.2：1和0.8：1。对于3 L的发酵产物,从包涵体中纯化得到的重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD的产量分别为5.8 mg、9.6 mg、18.9 mg和15.1 mg,纯度分别为90.1%、85.6%、80.6%和90.3%。(2) Tat PTD-Es-RGD的体外活性及体外穿透眼球屏障的能力采用CCK-8法测定从包涵体蛋白中分离纯化得到的重组蛋白Es、Tat PTD-Es、 Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD对人脐静脉内皮细胞EAHY926增殖的抑制作用；利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型评价重组蛋白对CAM血管生成的抑制作用；用划痕实验考察重组蛋白对内皮细胞EAHY926迁移的抑制作用；利用体外血管生成实验考察重组蛋白对内皮细胞EAHY926血管生成的抑制作用。结果表明,4种重组蛋白均能抑制内皮细胞EAHY926的增殖,并具有剂量依赖性,在浓度为8 μmo/L时4种蛋白的抑制率均能达到80%左右；使用上海沪震实业有限公司在CAM模型中,4种重组蛋白均能抑制由bFGF诱导的血管生成,与bFGF组相比Tat PTD-Es-RGD可以使血管面积由(38.4±3.2)%降低到(17.9±2.5)%,并且与Es组相比,其它3种重组蛋白对CAM血管生成的抑制作用均无显著性差异；划痕实验结果表明,重组蛋白Tat PTD-Es-RGD在24 h能抑制(54.92±3.36)%的内皮细胞EAHY926迁移,在48 h仍能抑制(42.30±7.92)%的细胞迁移,4种重组蛋白对内皮细胞迁移的抑制作用相似；Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD能够显著地抑制管状结构的形成,与对照组相比其抑制率分别为(60.77±8.42)%、(60.30±8.41)%、(64.89±6.38)%和(61.70±6.38)%。结果表明,在Es的N端和C端分别引入Tat PTD和RGD后,并没有对Es的活性产生显著性影响。采用air-lifting多层培养大鼠角膜上皮细胞(rat corneal epithelial cell, RCEC)构建体外角膜屏障,采用大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cell, RMEC)和大鼠视网膜微血管周细胞(rat retina microvascular pericytes, RRPC)共培养的方法构建体外血-视网膜屏障(blood retina barrier,BRB)；通过测定跨膜电阻(Trans-epithelial electrical resistance, TEER)值和荧光素钠(Na-F)渗透率对上述两种屏障的性能进行评价；用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记目的蛋白,通过荧光酶标仪来测定穿透屏障的重组蛋白浓度从而判定不同重组蛋白的穿膜能力；利用S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP)上调BRB共培养物中RMEC表面整合素αvβ3的表达量,考察FITC标记的Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力,间接反应两种重组蛋白与RMEC表面整合素αvβ3的结合能力。结果表明,采用上述方法建立的体外角膜屏障和BRB均具有较好的生物膜屏障的特性；对于角膜屏障,与Es相比,Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD组均在下室中检测到较高的荧光强度,且具有显著性差异,而Es-RGD没有显著性差异,这表明Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD具有较强的穿透角膜屏障的能力；BRB模型中检测到与角膜屏障相似的结果,表明相对于Es而言,Tat PTD-Es和TatPTD-Es-RGD同样具有较强的穿透BRB的能力；与未加入SNAP刺激的BRB模型相比,Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力显著性地降低,而Tat PTD-Es并未与之前表现出显著性差异,由此可以间接证明Tat PTD-Es-RGD与RMEC表面的整合素αvβ3具有较高的亲和性。(3) Tat PTD-Es-RGD眼部药代动力学及药效学研究对重组蛋白的眼部药代动力学进行研究,考察4种重组蛋白在滴眼给药后能否到达视网膜及在视网膜的代谢情况。结果显示Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在视网膜中的最高浓度(Cmax值)分别为(8.43±0.85)ng/mg和(9.42±0.77)ng/mg,与Es最高浓度(0.68±0.10)ng/mg相比,显著性升高。Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在视网膜中的半衰期(T1/2)分别为(9.64±1.31)h和(11.03±1.95)h,另外两种蛋白质的半衰期没有统计学差异。表明带有Tat PTD的重组蛋白能够通过局部滴眼到达眼底,而且Tat PTD-Es-RGD的浓度相对较高。建立氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型,通过滴眼给药后,对4种重组蛋白的药效学进行评价。视网膜铺片结果表明,与负对照组相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼组的无灌注区面积和新生血管簇面积显著性降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼组的效果要显著优于Tat PTD-Es;HE染色结果说明,与负对照组相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼组突破视网膜内界膜的细胞核数显著性地降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼组更低；免疫组化结果显示,与负对照组相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼能够显著性地抑制VEGF在视网膜处的表达,且外源性Es的染色结果显示,这两种重组蛋白通过滴眼给药的方式能够到达视网膜。以上结果证明,Tat PTD-Es-RGD和TatPTD-Es均能够通过局部滴眼的给药方式到达视网膜并发挥抑制新生血管生成的活性,且由于靶向肽RGD的引入使得Tat PTD-Es-RGD的效果要优于Tat PTD-Es。(4) Tat PTD-Es-RGD抗肿瘤转移活性的研究建立黑色素瘤B16-F10人工肺转移模型,考察重组蛋白对肿瘤转移的抑制作用。结果显示,造模后腹腔注射不同重组蛋白(20 mg/kg)14 d,均能显著性降低小鼠肺表面的肿瘤结节数,且Tat PTD-Es-RGD组的结节数要显著地低于其它3种重组蛋白组；HE染色结果表明给药组的肺组织肿瘤结节面积明显降低,细胞核异性数明显减少,并少见炎症细胞浸润,其中Tat PTD-Es-RGD组的肿瘤结节的面积最小。免疫组化结果显示,4种重组蛋白均能显著性地抑制CD34的表达,CD34+微血管面积与阴性对照组相比显著性降低,其中在Tat PTD-Es-RGD组中达到最低。这表明,重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有较好的抗肿瘤转移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要显著高于其它3种重组蛋白。本研究取得的成果和结论：(1)首次构建出大肠杆菌表达菌株pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,并成功获得纯度较高的重组蛋白。(2)重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均能在体外抑制内皮细胞的增殖、迁移、血管生成及CAM血管生成,并表现出较好的体外活性。(3) Tat PTD能够携带Es穿透体外角膜屏障和BRB,而Tat PTD-Es-RGD与RMEC表面整合素αvβ3分子具有较高的亲和性。(4)重组蛋白Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD能够通过局部滴眼到达视网膜并发挥较好的药效,并且Tat PTD-Es-RGD的药效要优于Tat PTD-Es。(5)重组蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有较好的抗肿瘤转移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要显著高于其它3种重组蛋白。 还原

关键词：Tat PTD; Endostatin; RGD; 眼球屏障; 视网膜新生血管;

导师：王凤山;

分类号：R943