骨髓间充质干细胞NMⅡ基因调控对吸入性损伤疗效及机制研究-沪震生物文献

骨髓间充质干细胞NMⅡ基因调控对吸入性损伤疗效及机制研究

王俊杰

第二军医大学

摘要：研究背景吸入性损伤在人类城市发展史中曾造成巨大的灾难,1942年美国波士顿椰树林夜总会火灾,密闭空间起火后患者吸入大量未燃烬的烟雾、炭粒、有刺激性的化学物质等,虽经抢救,但是大量死亡,共造成造成492人死亡,成为美国伤亡最为惨重的火灾事故,主要就是吸入性损伤所致。上海2010年11月15日,静安区胶州路重大火灾,上海市医疗机构共救治伤员127人,其中死亡41人,收治住院治疗71人,死亡和住院的大部分人都有吸入性损伤,其发病率和病死率非常高。骨髓间充质干细胞（BMSC）是一类具备自我更新和分化潜能的多能干细胞,取材简便,不会发生免疫排斥反应,具有重要的免疫调节和抗炎活性,研究发现其能够向多种组织诱导分化,如骨、软骨等,同时具备较强的内分泌能力和免疫调节功能,是理想的组织修复来源,近年研究证实,BMSC移植能改善急性肺损伤（ALI）肺内及全身的炎症反应,调节ALI体内免疫紊乱,“归巢”至肺损伤区域,向肺内功能细胞分化并发挥相应功能,参与受损肺组织的修复,因而被认为是急性肺损伤治疗中极具前景的治疗措施。虽然BMSC移植治疗ALI有很好的效果,但是在体内的移植率和存活率受多因素影响,坏死或凋亡是最主要形式,因此,提高或者改善BMSC移植后在体内的移植率和存活率是这种治疗方法得到广泛应用的关键所在,越来越多的研究者提出了多种学说,探索了多种方法以期能够提高移植BMSC的移植率和存活率。肌球蛋白是一种球蛋白,是肌肉的主要组成分子,主要为肌肉收缩提供力,它具有酶的活性,可以通过与肌动蛋白相互作用,水解ATP的末端磷酸基团和GTP、CTP等,将化学能转化为机械能。肌球蛋白也广泛存在于非肌肉组织中称为非肌肉球蛋白,非肌肉肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosinⅡ,NMⅡ）是非肌球蛋白家族中的一种,文献报道它是多种疾病的关键分子,参与了细胞的各种生理活动,特别是信号转导方面,它是细胞正常生理活动的一种关键蛋白分子,具有很重要信号转导和调节作用,因此具有很高的研究价值。鉴于此,我们选取NMⅡ为研究对象,并经过前期研究发现,下调骨髓间充质干细胞中非肌肉球蛋白NMⅡ,再移植到烟雾急性肺损伤的模型上,通过比较发现其效果比单纯无修饰的骨髓间充质干细胞移植效果更好。通过进一步研究发现,调控NMⅡ基因可以使骨髓间充质干细胞在移植凋亡、减轻炎症反应等方面比未调控NMⅡ基因的骨髓间充质干细胞更为明显。通过一系列实验后我们发现,下调NMⅡ基因表达能够抑制干细胞凋亡,促进骨髓间充质干细胞归巢至损伤部位,降低损伤部位炎症反应,比传统的单纯使用间充质干细胞更为有效,尤其对毛细血管丰富的肺部损伤更加有效。对NMⅡ基因进一步深入研究,可以为干细胞治疗烟雾吸入性损伤以及ALI/ARDS引入新的研究靶点并向临床应用转化。第一部分骨髓间充质干细胞的制备及鉴定研究目的:根据课题研究的目的,制备骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为后续研究NMⅡ基因调控治疗吸入性损伤模型的疗效和保护机制提供载体。研究方法:大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养过程如下:选取周龄4周,体重160g-200g左右的雄性大鼠,分离大鼠的股骨和胫骨获取骨髓,200目滤网过滤至细胞培养皿中,在37°C温度下5%CO₂培养箱中进行贴壁培养,细胞培养2-3代后进行形态学鉴定、表面抗原鉴定、分化潜能的鉴定。研究结果:显微镜下观察到贴壁细胞的形态大小不一,形态各样,大部分成梭形生长,形态类似成纤维细胞;流式细胞仪检测细胞表型鉴定为符合骨髓间充质干细胞的表面抗原;细胞经过成脂成骨诱导后为阳性。研究结论:经过鉴定,所获取的细胞为骨髓间充质干细胞。第二部分干扰NMⅡ表达的载体构建和细胞株的筛选研究目的:制备NMⅡ表达降低的细胞株,为后续治疗提供细胞。研究方法:通过干扰序列的设计和重组载体的构建,转染前面已鉴定的骨髓间充质干细胞中,然后进行鉴定。研究结果:得到重组后的PLL载体,转染至骨髓间充质干细胞中,得到了NMⅡ表达降低的骨髓间充质干细胞研究结论:经过鉴定,转染重组载体的骨髓间充质干细胞NMⅡ表达降低。第三部分骨髓间充质干细胞NMⅡ基因调控对吸入性损伤疗效及机制研究研究目的:检测NMⅡ基因调控的骨髓间充干细胞对吸入性损伤模型的治疗效果并探讨其机制研究方法:首先建立烟雾吸入性肺损伤模型;实验动物进行分组为对照组,损伤组,BMSC治疗组,BMSC-Sh RNA治疗组四组;分别采集大鼠动脉血进行血气分析;使用探针CM-Di I标记的骨髓间充质干细胞技术检测细胞在大鼠体内的分布情况;大鼠支气管肺泡灌洗液的收集;大鼠肺脏的干湿比测定;HE检测24h肺部的炎症反应情况;使用上海沪震实业有限公司ELISA检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α和IL-10因子;NMⅡ基因沉默对BMSC细胞凋亡的影响;NMⅡ基因沉默对BMSC细胞旁分泌系统的影响。研究结果:干细胞移植后的24h时间点取血进行血气分析发现,损伤组大鼠出现明显的低氧血症、二氧化碳潴留和酸中毒症状;而治疗组与损伤组比较差异具有显著性,可推断BMSCs移植后对肺损伤有治疗作用。使用CD-Di I标记的转染NMⅡ-Sh RNA的骨髓间充质干细胞,尾静脉注射吸入性损伤模型,1、4、7天取大鼠肺脏,染色,荧光显微镜下观察到BMSCs细胞的归巢。HE染色发现干扰组的损伤情况明显减轻。肺泡灌洗液（BALF）El ISA法检测肺泡灌洗液中TNF-a降低和IL-10的浓度升高。细胞实验中的干扰组比为干扰组的caspase-3表达明显降低。NMⅡ基因沉默对BMSC细胞旁分泌系统HGF的VEGF都比正常组升高。研究结论:下调NMⅡ基因表达能够抑制干细胞凋亡,促进骨髓间充质干细胞归巢至损伤部位,降低损伤部位炎症反应,比传统的单纯使用间充质干细胞更为有效。 还原

关键词：非肌肉球蛋白Ⅱ; 骨髓间充质干细胞; 吸入性损伤; 凋亡;

导师：夏照帆;

分类号：R644