elisa方法检测（血清中）抗体浓度

我们从构建好的大量抗体中筛选出候选抗体，然后要注入小鼠和食蟹猴体内，在不同时间点取血清，测定其中的抗体浓度，计算抗体的pk值，以进行进一步的抗体筛选。因此要进行大量的elisa实验。

工具/原料

• 试剂：1. 双蒸水（实验室制备） 2. 包被液：碳酸盐缓冲液 na2co3 159mg nahco3 293mg ddh2o to 100ml 3. 1×pbs（实验室配置） nacl 8g kcl 0.2 kh2po4 0.27g na2hpo4 ?12h2o 3.58g ddh2o to 1l 4. pbst（实验室配置）：adding 500ul tween20 into 1l 1×pbs. 5. blocking solution: 2% bsa bsa 2g 1×pbs to 100ml 6. bsa（beyotime， cat number：st023） 7. antigen (pepro tech, cat:200-04r ), dissolved in ddh2o and prepared 100ug/ml stocking solution. 8. human antibodies (mammalian cell expressed) 9. secondary antibody(hrp conjugated)（sino biotechnology, cat: ssa002. working solution：dilute secondary antibody at 1:2000 with 1% bsa . 10. tmb（solarbio，cat number：pr1200） 11. 2m 硫酸（实验室配置）

• 材料： 1. 15ml 离心管（nunc） 2. 96-well elisa 酶标板（jetbio） 3. 300ul 多通道移液器（rainin） 4. 10ul、200ul、1000ul 单通道移液器（rainin） 5. 1.5ml 离心管

• 仪器： 1. 恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司） 2. 酶标仪（md flexstation3）

方法/步骤

1. 方法：

   1.         配制抗原包被液。

   2.        将配好的抗原包被液加入到加样槽中，使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧) 加入96-well 酶标板中，每孔100ul。加样时要注意避免气泡并避免液体粘附于孔壁。加样时使pipette的各个tip对准96-well一行中的各个孔，按照由b行至g行的顺序，逐行加入。

2. 1.        将96-well酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后， 4℃ 冰箱中孵育过夜。

   2.        第二天，将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

   3.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×pbs，每孔300ul。

   4.        室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

   5.        重复步骤5和6，共计三次。 

   6.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入blocking solution，每孔300ul。

   7.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。(37℃ or lower?)

   8.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

   9.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入pbst，每孔300ul。

   10.    室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

   11.    重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。

   12.    ※将稀释好的抗体依次加入到相应的孔中，每个样品做三个复孔，每孔100ul。(加样方法，方向如下。)

3. 1.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。

   2.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

   3.        重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。

   4.        使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution，每孔100ul。

   5.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。

   6.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

   7.        重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。

   8.        确保环境温度为25℃，使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well 板中逐排加入tmb溶液，每孔100ul。

   9.        25℃下，保温3min，立即使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well板中加入2m h2so4 溶液终止反应。

   10.    静置5min后，将96-well板置于flexstation iii 于450nm检测读数。 (在flexstation iii的工作站软件中选择endpoint/hrp-tmb 方法)

   ※  抗体稀释方法：

   prepare 0.1ug/ml antibody solution；

   then to prepare antibody working solution as below：

   
   

   
   

   
   

   end

4. 注意事项

• 使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧);