加入已知浓度A的待测物质，用该方法测定其浓度值B，回收率=（A/B）×100%.注：已知浓度A应在该检测方法的可以检测浓度范围内。加标回收率，一般是测定样品中待测物质的浓度为C；再取另一份样品，加入定量待测物质（定量加入待测物质的理论浓度为E）（加入待测物质的量最好与样品中待测物质的量一样）测定其浓度为D，加标回收率=（（D-C）/E）×100%绝对回收率因为不论是生物基质还是制剂辅料中的药物，经过样品处理都有一定的损失。作为一个分析方法，绝对回收率一般要求大于50%才行。它是在空白基质中定量加入药物，经处理后与标准品的比值。标准品为流动相直接稀释而来，而不是同样品一样处理。空白加标回收：在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为空白加标回收率。 　　样品加标回收：相同的样品取两份，其中一份加入定量的待测成分标准物质；两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。

一、使用不同：除了内标法和归一化法，常用的气相色谱方法还有外标法。与内标法相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。二、含义不同：面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质，根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。应用范围外标法适用于工厂中的常规分析，它用于衡量组分的分析也能得到满意的结果。这个方法的精确度，在很大程度上取决于操作条件的控制。样品分析的操作条件，必须严格控制于绘制校正曲线时的条件。当峰高对操作条件的敏感性以及对拖尾峰、柱子超负荷和检测器有大的响应时，给出非线性的校正曲线，此时峰面积计算常常可以得到更好的结果。不过，对重叠峰，难以准确的测量峰面积，必须提高分离度才能达到预期的效果。

一、微载体培养应用 此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。二、微载体 是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。三、微载体培养原理与操作1、原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。2、搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。3、细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。4、细胞在微载体表面的生长 影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面。在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、DC以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。5、微载体培养操作要点培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。 四、微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应（O2 、N2 、CO2、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。因此，应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。1、搅拌式生物反应器系统 搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制了其应用范围。尽管如此，由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点，国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道。例如，Werner A（2000年）成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。2、灌注式生物反应器系统 灌流培养是目前研究热点之一。它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖，即省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。3、旋转生物反应器 近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。五、微载体培养优点表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；放大容易；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间小。

为什么要研究蛋白质相互作用？蛋白质是细胞的功能分子，控制了细胞中所有生物系统。但是，通常它们不是“孤军奋战”，绝大多数蛋白质会与其他的蛋白质相互作用，一起参与生命的过程。因此了解未知或已知蛋白质的生物学功能和从细胞水平上确定细胞机制，已成为蛋白质组学研究的主要目标。而当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括免疫共沉淀，荧光共定位，荧光双分子互补，荧光双分子互补，荧光能量共振转移等研究方法，通过了解各种研究方法的原理和特点，在实验中可根据不同的要求和目的选择合适的方法。免疫共沉淀 (co-IP)原理是以抗原和抗体的特异性结合以及来自细菌的两种蛋白—Protein A/G—特异性结合抗体分子的现象为基础的研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在细胞内相互作用的有效方法。人们将抗体和大质量的琼脂糖颗粒或者磁珠进行进行交联或者亲和，然后用这个带有抗体的大颗粒物去识别溶液中的目标蛋白，此时如果目标蛋白已经与其他蛋白相互作用形成复合体，那么含有目标蛋白的蛋白复合体就会被这些大质量的颗粒物所亲和，由于抗体锚定在了这些大质量的颗粒物上。人们通过各种缓冲液的清洗除去非特异性的结合后的颗粒物可以通过离心或者磁力架吸引进行收集，此时结合在这些颗粒物上的蛋白质理论上就是可以和目标蛋白直接或者间接相互作用的蛋白了。通常情况下，做实验前你对于这些可能的互作蛋白已经有了猜测，那么可以将大颗粒物拖拽下来的蛋白复合体跑 SDS-PAGE。然后用 western-blot 的方法，可以用这些可能的互作蛋白的抗体去进行检测，就能验证这种蛋白质之间的相互作用了。根据实验目的的不同，免疫共沉淀的方法可以有很多可以修改的地方。比如，如果你希望验证蛋白之间直接的相互作用，那么你可以选择体外翻译系统，在试管中合成需要验证互作的一对蛋白，然后混合孵育，并进行检测，也可以通过原核表达系统纯化这对蛋白，然后进行混合孵育并检测等等。免疫沉淀的方法运用合理，可以玩出很多有意思的实验，回答很多问题。荧光共定位，Fluorescenceco-localization，在过去，这个技术一般用于细胞内辅助证明蛋白相互作用，前些年，如果是其他物种的蛋白质，你应用酵母双杂交系统验证了它们的相互作用，reviewer 可能会说你这个并不能反映原物种中的真实情况，可能是假阳性。这个时候，一些研究者就将这两个蛋白分别与不同颜色的荧光蛋白融合表达于原物种细胞当中，在高分辨显微镜下，如果两种荧光出现在同一位置，那么就证明它们空间上较为接近，很有可能产生了相互作用。然而，就如上一句话里所说的，只是很有可能，并不能作为直接证据证明它们真的相互作用了。这个技术一般都是没办法时候的办法，就不举例子啦。荧光双分子互补， bi-molecular fluorescence complementation(BiFC), 人们把绿色荧光蛋白 GFP 分子分割成两段，分别与接受测试的两个蛋白融合表达。如果两个蛋白相互作用，那么在细胞中 GFP 的两个片段就可以在空间上相互接近，并最终能够在激光的激发下发出绿色的荧光。这里的 GFP 也可以换成萤火虫荧光素酶 Luciferase，原理相同，不同的是荧光素酶需要有底物的存在，发出的是自发荧光而非激发光 。这类技术的好处是可以再活细胞里进行观测，可以进行实时监控，定量等实验。但是该技术的空间分辨率大概是 250nm，可以说对于蛋白质相互作用来说，依然是相当远的一个距离，因此也有很大可能是假阳性，同时融合蛋白也可能对受试蛋白的空间构象造成影响造成假阳性假阴性的结果。总的来说，这类技术还是要优于前两个的。荧光能量共振转移，fluorescence resonance energy transfer(FRET)，这个技术与第三条又有所不同。人们将目标蛋白 A 与青色荧光蛋白 CFP 融合表达，将 A 的可能的互作蛋白 B 与黄色荧光蛋白 YFP 融合表达，CFP 的激发光是波长是 414nm 紫外光区域，而荧光波长是 475nm 蓝光区域，恰好 YFP 的激发光是 475nm 附近蓝光区域，而荧光则是 525nm 附近黄色光区域。如果 AB 两蛋白相互作用，空间上相互接近，导致 CFP 和 YFP 分子也在空间上相互接近，那么当仅用紫外光激发 CFP 时，CFP 接收能量放出的蓝光将直接被 YFP 吸收，从而发出黄色的光，如果能够定量 CFP 的蓝光被转化成为 YFP 的黄光效率的变化，那么就可以检测出两个蛋白间的距离的变化 。因此，这项技术不仅能验证蛋白质的相互作用，还能够表征这种相互作用距离的动态变化，比如蛋白质分子直接相对运动的方向速度等。比如在这篇文章里 ，作者们就用 FRET 测定了细胞运动时的受力情况。亲和纯化 - 质谱，affinity purification-mass spectrometry(AP-MS)，刚才说了，如果你在实验之前已经对目标蛋白有推测的互作蛋白，那么你可以做 western-blot 对它进行检测。可是，如果你想找一些以前未被报道，你自己也无法猜测的新互作蛋白呢？这个时候，你可以把免疫共沉淀后得到的样品，送去做蛋白组学质谱的实验室，通过质谱对这个复合体中的所有成员进行鉴定，理论上你就获得了整个目标蛋白复合体的成员信息。如果说，之前的实验都是用一把枪，瞄准对面山头的敌人然后各个击破，那么质谱的方法就是拿了一门炮，将对面山头的敌人一网打尽。AP-MS 的方法还有很多变种。比如利用一些可以对周围蛋白进行生物素标记的酶，我们可以将目标蛋白与这些酶融合表达，那么，在细胞内，这些融合蛋白就可以对目标蛋白附近的所有蛋白打上亲和素的标记，然后通过生物素与亲和素超强的亲和性，我们可以大幅提高 AP-MS 鉴定的灵敏度，在冲洗非特异性结合的时候，我们就不用担心弱相互作用被我们丢失，这类方法叫做邻近标记（proximity labeling）- 质谱法。酵母双杂交，Yeasttwo hybrid（Y2H）, 这是一个古老的技术，Stanley Fields 和 Ok-KyuSong 在 1989 年的时候利用大肠杆菌中 GAL4 乳糖操纵子的原理，开发出这个方法用于检测蛋白质之间的相互作用 。GAL4 操纵子有两个结构域，BD（binding domain）结构域和 AD（activation domain），其中 BD 结构域可以结合在 UAS（upstreamactivating sequence）DNA 区域，在 AD 结构域可以激活 UAS 下游的基因表达。因此，他们把 GAL4 的两个结构域切分开，这样，BD 可以与目标蛋白结合，并且先行结合在报告基因 lacZ 上游的 UAS 区域，接着，把需要检验是否与目标蛋白相互作用的蛋白与 AD 结构域融合表达，如果目标蛋白和被检测蛋白可以相互作用，它们必定会在空间上相互接近彼此，这种相互作用可以使得 AD 和 BD 结构域也在空间上相互接近，这样就可以激活报告基因 lacZ 的表达，使得人们可以检测到 。这个方法的优势在于廉价且易操作，这个方法一度非常流行，既可以用于筛选目标基因的相互作用蛋白，也可以用于验证相互作用，以及定量检测相互作用的强度。但是缺点在于受试蛋白都需要和 AD/BD 结构域形成融合蛋白，空间构象可能改变，其次，许多蛋白质的相互作用可能同时需要其他蛋白的协助，而这个系统并无法把这些辅助蛋白也拉进来检测，因此经常漏掉很多的蛋白相互作用，第三，由于反应发生在真菌细胞内，如果你的目标蛋白来自其他物种，这个实验可能并不能反应蛋白在原物种细胞里的真实状态，最后，有的蛋白质可能自身就能够激活报告基因表达，比如转录因子，这样，这类蛋白就没办法通过酵母双杂交进行筛选和验证相互作用了（当然也可以将该蛋白换至 AD 载体上，但是依然有其局限性）。

噬菌体是一类侵害细菌的病毒，又称为细菌病毒(bacterialvirus)。英文名称为bacteriaophage，简称phage，来源于希腊文“phagos”，意为“吞噬”。1.噬菌体特征噬菌体具有一般病毒所有的特征：为非细胞生物，其结构主要由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成；它们只能在活细胞内营专性寄生，靠其宿主代谢补充，协助来复制核酸合成蛋白质等组分，然后再进行装配增殖。在离体条件下，能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性；非常专一的寄生性，在自然环境条件下，它们只能侵染细菌和一些原生生物，而不能侵染高等生物和植物；对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感；个体小，可通过除菌滤器。噬菌体没有个体的生长过程，只有基本成分的合成和装配，所以一般将噬菌体的繁殖称作复制。烈性噬菌体在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，达到一定数量时，由于噬菌体合成酶类的溶解，导致宿主细胞裂解，释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌。温和噬菌体感染宿主菌后并不增殖，而是将其基因整合于细菌染色体上，形成前噬菌体。在前噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。噬菌体的危害噬菌现象：液体培养基溶氧急剧上升，产生大量气泡，在较短时间内菌体大量自溶，发酵液最终变清。固体培养基出现噬菌斑。利用细菌或放线菌进行的发酵容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐,使工业生产遭到严重损失。噬菌体的防治措施1.外来可疑菌种一律不做增殖。2.多菌种交替使用，采用抗噬菌体的感受态。3.划分大肠杆菌的操作区域，接种区，发酵区，收菌区，菌种保藏区要严格分开。4.严禁活菌排放，废菌高压灭菌后方可倾倒。5.规范操作，避免污染。6.保证洁净，干燥的工作环境。噬菌体的杀灭方法高温大多数病毒耐冷不耐热，高压蒸汽或者干热180°C可彻底灭活。pH多数病毒在pH6~9范围内比较稳定，在pH5.0以下或PH9.0以上迅速灭活。射线γ射线、x射线及紫外线都能灭活病毒。酚类和醛类及其衍生物蛋白变性剂，能破坏病毒衣壳蛋白。氧化剂，卤素及其化合物70%甲醇，乙醇均可使多数病毒灭活。虽然甲醛熏蒸的效果显着，但对于大多数实验室来说并不具备该条件，且对人体有害。实验室适用的方法表面消毒对于物品表面的消毒，可用84或新结尔灭。紫外照射选用254nm光谱紫外过夜照射。臭氧杀菌臭氧过夜杀菌，早上通风1小时，无残留。臭氧作为-神绿色消毒剂，对大肠杆菌、乙肝病毒、黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等具有极强的灭活效果，其灭菌速度是紫外线的3000倍。臭氧的半衰期为20-50分钟，且最终的分解物为氧气，所以对人员及物品不会有残留污染。

人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。所以今天详细给大家分享一下有关原代细胞的取材，想了解的小伙伴往下看哟~一、取材的基本要求1．取材要注意新鲜和保鲜2．应严格无菌3．防止机械损伤4．去除无用组织和避免干燥5．应注意组织类型、分化程度、年龄等6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4c㎡。内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。动物组织取材鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5min后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。人胚体组织取材取材方法与鼠类相同鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤（1）取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。（2）将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干；（3）经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；（4）用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；（5）用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。以上关于原代细胞的取材介绍到这里，有需要的小伙伴可以收藏起来！

慢病毒（Lentivirus）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它可以感染分裂细胞和非分裂细胞，可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。此外，慢病毒具有嗜核性，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在体内较长期表达。慢病毒的多种优点，使它成为基因传递的强大而有效的工具，获得了广泛的应用。因此，慢病毒成为了实验室的一大常客。在使用慢病毒的过程中，我们会遇到一些问题，比如细胞转染效率低，细胞状态差等等。为了在实验过程中更好地使用慢病毒，我们应该注意哪些问题呢？慢病毒载体是经过处理的HIV，理论上对人体是无害的，但病毒仍然具有潜在的生物学危险，慢病毒相关实验需要在生物安全柜（BL-2级别）内进行操作。因此在进行操作的时候，我们要按照如下基础规范进行实验：1、在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩；2、操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅；3、如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机；4、如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去；5、如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心；6、实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。慢病毒的储存与稀释1、病毒长期储存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超过1周，4℃保存不要超过3天；2、病毒的运输采用干冰，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于3天内用完）。若短时间内不用，收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融，否则会降低病毒滴度；3、一般病毒可在-80℃存放1年，但存放时间超过6个月后使用，需重新检测病毒滴度；4、需要稀释病毒时，将病毒从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培养基（不含血清）稀释到所需浓度后轻柔混匀，尽快使用；慢病毒的使用预实验摸索慢病毒的最佳MOI每种细胞对慢病毒的敏感性不同，有些容易感染，有些不容易感染，不同慢病毒的荧光强度也有差异，所以进行慢病毒操作实验之前，首先要了解MOI的概念，MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。选择合适的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞，比如293细胞MOI=1时，95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低，MOI值可能达到200-300。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等）感染细胞MOI值的摸索。1、感染前一天，一般用24孔板接种2×10?个细胞，第二天病毒感染时的细胞汇合度达到40-50%左右；2、MOI值的设置若有文献参考，可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值，举例：文献中某细胞系慢病毒MOI值为10，则设置MOI梯度为2.5,5,10,20,40等；若无文献参考可按10倍梯度稀释进行设置，每个梯度3次重复；注：（1）每孔加病毒量（μL）=MOI*细胞数/滴度（TU/mL）*10?一般第二天按照细胞数倍增计算;如果病毒滴度很高，每孔加病毒量过少，可进行稀释后再加；Polybrene（常用浓度为5-10μg/mL）是否添加根据细胞种类及具体实验决定；3、第三天（加病毒后12h-24h左右），弃去含病毒就培养基，更换新鲜培养基继续培养；4、第五天，观察荧光情况，并进行拍照，确定最适合MOI值；5、对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长病毒感染时间，根据细胞状态决定何时更换培养基，保持细胞的活性。慢病毒感染目的细胞1、通过感染预实验，确定细胞接种密度、最佳MOI等条件。正式实验前，调整并保持良好的细胞状态；2、按实验需要将细胞铺板（qPCR检测用12孔板，WB检测用6孔板或更大面积的培养皿），细胞数以第2天密度约40-50%为宜，37℃ 培养过夜；3、感染前，从-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀释成所需浓度，用移液器吹打均匀；4、感染前给细胞换液，然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液，轻轻摇匀，37℃培养过夜；5、感染后根据细胞状态决定，更换新鲜的完全培养液，继续37℃培养。若病毒对细胞无毒性也可不换液。感染后48-72h观测荧光，拍照记录；6、根据需要，或收细胞抽提RNA检测目的基因在mRNA水平的表达，或收细胞抽提蛋白检测目的蛋白的表达，或收细胞进行细胞功能检测；7、在培养过程中，需要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒，则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜完全培养液。慢病毒在使用过程中可能遇到的其他问题如何使用慢病毒感染细胞？使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类，因此首先要了解细胞的来源和背景。通常来讲首先要根据MOI和需要感染细胞量计算所需要的病毒量，然后将所需病毒液加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。慢病毒染后为什么细胞中出现大量黑点，并影响细胞生长？在排除细菌及真菌污染后，细胞中的黑点通常为细胞碎片，导致细胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，细胞破碎通常有两个原因：a. 慢病毒使用量过多，或细胞数量过少；b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖，故支原体污染被许多实验室所忽略。但支原体易在病毒感染细胞后爆发，故会出现大量细胞碎片。建议在使用病毒制品时，应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染，以节约时间。病毒感染目的细胞感染不上或效率低？和以下几个因素有关：1、病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新测滴度；2、目的细胞：最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如悬浮细胞，原代细胞等，或者动物实验适合用腺病毒或AAV；3、MOI值：一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的，同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样，如果感染细胞所用的病毒量不够的话，感染效率肯定不好；需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。4、感染时间：慢病毒一般在感染后24h换液，感染后换液太早会导致感染效率下降；感染后换液太晚，则对细胞的损伤太大，效率也不高。感染后48h开始观察荧光，由于慢病毒的表达时间较长，有的72h，120h才能看到荧光。5、其他：是否加入 polybrene 以及荧光显微镜的使用等因素有关要曝光很长时间才能观察到荧光？要曝光很长时间才能观察到的荧光，说明荧光比较弱，可能的原因有：1、显微镜汞灯使用时间长，这个可以通过对照排除，看是否有比较亮的对照，或者如果有其他比较亮的样品，证明不是汞灯的问题。2、PH值低，看培养基是否发黄导致绿色荧光猝灭。3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒荧光强度与对照相比弱一些，这个属于正常现象，增加曝光时间，看感染上的阳性细胞比例如何，看看目的和对照的荧光的差异，如果感染比例尚可，差异不是很大，用Puromycin筛选有大量细胞存活，则病毒也可以使用。

WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。WB可大致分为以下7步，分别是蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、电转印、封闭、抗原-抗体免疫反应、蛋白检测。一、蛋白提取常规的样品无外乎3种，分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解，细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来，随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。同时，裂解液中还包含其它成分，如Tris-Hcl作为缓冲剂，可防止蛋白在提取过程中变性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司生产的裂解液成分大同小异，多是以上成分按不同比例组成，可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。最重要的是我们要清楚自己研究的蛋白到底在细胞哪里表达，是细胞膜、胞浆还是细胞核。这决定我们该使用哪种强度的裂解液。如果裂解不充分，我们抽提的总蛋白中可能已经不包括目标蛋白或目标蛋白随着沉淀物被丢弃，那么整个WB实验从一开始就悄无声息地失败了。二、蛋白定量为什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比较同样细胞数量的细胞或同等重量的动物组织中目的蛋白的表达量高低变化。那么首先，我们需要控制样品本身重量大小或细胞数量的多少对实验结果的影响，故不同组间的样本需要控制一致才可提取蛋白。因此，在第1步中提取的蛋白上清液即是同等质量下，同样提取方法下，抽提的总蛋白混合物，这里面包含了各种各样的蛋白。我们必须知道这个上清液中的总蛋白浓度，才能在第三步电泳时保-证每一个上样孔中加入的总蛋白质量一致，这样后面对条带上的蛋白定量分析才是有意义的。我们怎样才能知道这个上清液中，总蛋白的浓度呢？目前有4种方法，分别是双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。较常用的是BCA法，其原理：蛋白质可在碱性环境下将2价铜离子还原为1价铜离子，而1价铜离子可以与BCA试剂发生颜色反应，2分子的BCA螯合后可形成紫色的复合物，这种复合物具有非常好的吸光性(用OD值反应)。在562nm的紫外光下，溶液中复合物的OD值与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。我们可以通过这种线性关系大致地计算出自己的样品中总蛋白浓度。自然而然，我们需要一个OD值-蛋白浓度标准曲线。购买商用的蛋白标准品(即包含已知浓度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三种。首先，按照(铜离子体积：BCA regent体积=1：50)配制BCA工作液。准备好4mg/ml蛋白标准品，使用去离子水倍比稀释蛋白标准品，最-后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8个不同浓度的蛋白溶液，单位μg/μl。随后将自己的要测的样品按照一定倍数稀释(因为待测样品的蛋白浓度肯定是过高而超过BCA检测的线性范围，稀释倍数根据样本类型和经验来定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待测样品(一个孔一个样品，如待测样品数量为15，则一共使用标准蛋白梯度浓度的8个孔+15=23个孔，小编建议每个孔做2个复孔，防止加样误差)。随后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使发生紫色螯合反应。孵育结束后立刻拿到酶标仪中，在562nm光下，测算每一个孔的OD值，并通过标准蛋白梯度浓度和其相应的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白浓度线性公式(R方值建议0.99以或以上)；同时根据待测样品的OD值和上述公式计算出每一份样品中总蛋白的浓度。测定完浓度的蛋白根据体积比例加入5X或者1X的蛋白上样缓冲液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分变性，解除二级或三级结构，只保留一级链式结构。上样缓冲液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异；DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构；甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；溴酚蓝为小分子蓝色物质，有指示作用。三、SDS-PAGE电泳终于到了电泳时刻。电泳是为了使得我们的加样孔中同等质量的总蛋白在相同电场作用下，从配置好的凝胶中由上往下迁移。我们都学过物理，知道带电物体在电场中移动距离与物体本身的电荷、物体的质量相关。蛋白质本身的电荷、质量、结构是不同的，这些都是影响蛋白在凝胶中移动的因素。通过煮沸，我们让蛋白仅保留了一级结构；上一步添加的上样缓冲液中SDS消除蛋白质本身电荷的差异。那么此时，上样的总蛋白中各种各样蛋白在凝胶中的迁移距离只与蛋白的质量相关。电泳时，整个凝胶处在一个大致呈“U”型的电场中，因此常能看到电场强度过高时，整条溴酚蓝呈现微笑的形状。借助电泳时的电场力作用，首先总蛋白在较小电压下移动到浓缩胶和分离胶的交界处，此时见溴酚蓝呈现一条笔直的蓝线；随后，在高电压的作用下，所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移，一定时间后，总蛋白中各种蛋白会在分离胶中的不同位置中分离开，分离后蛋白所处的水平位置只与蛋白分子量大小有关。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚蓝则在最下面的位置。每一种分子量的蛋白会在分离胶中形成一条直线，当然我们是看不见这条线的，这也是为什么我们要加溴酚蓝的目的，溴酚蓝刚好跑出最下方玻璃板时，电泳就可以停止了，否则你关注的小分子量蛋白可能会跑出胶外。我们可以通过彩色的Marker来大致地确定目标蛋白在哪里。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。四、电转印电转印就是将凝胶中的蛋白，转移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔，都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化)，易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转印。电转时，电场线是垂直于我们的凝胶和膜的。因此凝胶中的蛋白质再次在电场作用下向紧贴着凝胶的膜上转移，并最终被吸附在膜的表面。我们可以通过丽春红染色大致地评价电转印的情况(丽春红可将膜上的蛋白染成红色，而膜其它位置基本不着色)，但是丽春红染色仅仅是粗糙的评价方法，并不是我们的目标蛋白是否转移到膜上的直接证据，做＞150KD分子量蛋白的同志们尤其得注意。电转印的时间和电转强度需根据蛋白分子量来决定。五、封闭一旦电转印结束，我们就开始了封闭的过程，常采用5%、8%的脱脂奶粉或胎牛血清，室温下，摇床孵育膜1h。常规采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用胎牛血清封闭，因为奶粉中含有大量酪an酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景。为什么要封闭呢？我们知道，电转后蛋白质已迁移至膜的表面，而膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔。此时我们采用牛奶或胎牛血清封闭，其中包含大量的蛋白质，这些蛋白质会吸附在那些小孔上，堵住这些孔。如果没有封闭，那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置，且很难洗掉，最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等，浪费抗体不说，还会影响最终的判断。当然，这些奶粉中的蛋白也会一定程度地吸附到目标蛋白表面，但是与抗原-抗体特异性反应相比，这种非特异性的结合会很轻松的在后面漂洗步骤中消除。有时候也会遇到未封闭，但没有出现杂带。对此，小编只想说，常在河边走，哪有不湿鞋啊。六、抗原-抗体免疫反应这一步是比较简单的。就是你购买的特异性抗体与你的目标蛋白发生抗原-抗体特异性免疫反应。首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合，而膜表面其它位置的孔因为被封闭过程中牛奶的蛋白质所填满，因此结合量很少，后面漂洗时可去除。比较重要的是一抗孵育温度和时间，最chang用的条件是4℃摇床过夜孵育，温度适宜，分子运动温和。有人也用37℃孵育1-2h，可能会成功，但是温度越高，分子间的运动越激烈，那么出现非特异性杂带的可能性就越高；同时孵育时间较短，也可能会导致一抗与目标蛋白结合不充分。当然，如果你使用的是多克隆抗体，那情况就更难说了，一抗结合之后，就是采用二抗，二抗可与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，该 底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。总之，选好自己的一抗是很重要的。特异性高的一抗，WB你怎么做都能出；特异性差的抗体，WB发明人都不一定做得出来。建议不要省钱买国产抗体，你懂得。买抗体之前，看看近年发的高分文章，查查他们用的什么哪个公司抗体。如果找不到参考，一定要买经过该抗体公司敲除验证过的抗体。七、蛋白检测前几步，我们几乎无法看到膜上有啥变化，条带也看不见在哪，反正就是一直将膜洗洗涮涮。终于到了蛋白检测，这也是WB最-后一步，终于可以一睹蛋白条带的真容了。蛋白检测包括DAB法和ECL发光法。DAB法就是和免疫组化染色类似，出现的条带在肉眼下即可见，呈现棕黄色，条带可保存1-2年，但是现在用的较少。目前较多采用的是ECL化学发光法，ECL工作液包括鲁米诺(是的，就是我们看刑侦节目时案发现场看血迹的东西)和过氧化物，二者避光保存，现配现用(1：1配制)，用时滴在膜上就行，目标条带将在黑暗环境下发出荧光，荧光会进一步在胶片上曝光，荧光越强则胶片上曝光的条带越黑，最-后洗出胶片即可。现在还有凝胶成像仪可以使用，省去了胶片曝光和洗胶片的步骤，方便而高-效，再也不用去小黑屋待着发光了。

血清的热灭活是很多培养者感兴趣的话题，价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50℃以上的温度长达30分钟是完全没有必要的。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，多数实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子，氨基酸等成分带来的负面影响，在我们的技术热线中最常被提到的就是否该对血清进行热灭活，下面我们就对胎牛血清的热灭活进行一些探讨和解释。根据调查，至少70％的研究者对血清的灭活仅仅是因为遵照常规操作，或者说认为是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等.其中最chang用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。有科研人员曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定，他们发现胎牛血清中含有的C1，C6仅达成年动物血清的1-3%，而其它补体成分仅有成年动物的5-50％，至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验，我们也在多个不同批次的胎牛血清中获得了相似的结果。即使是在未稀释的血清中，也未发现有明显的溶血现象。另外，多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程，也对热敏的补体有灭活的作用。在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。多年以前，450纳米孔径的滤膜被用于加工血清时，血清中支原体的污染时有发生。针对这个问题，HyClone使用100纳米三层滤膜连续滤过技术，自从采用这项技术以及后来的40纳米滤过技术之后，我们的血清产品中没有再发现有支原体的污染，也是使得热灭活成为不必要的另外一个原因。Pinyopummintr等证明血清去除灭活步骤不影响牛胚胎的发育分化，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用，在用SV-BHK、BALB-3T3、CV－1、FS-4细胞对细胞粘附实验中，热灭活对胎牛血清的影响小于对小牛血清的影响。

在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为实验人提供些参考。材料1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。操作程序1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。7.记录复苏日期。注意事项1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

　　牛血清是细胞培养中最常用的天然培养基，与合成的基础培养基配合使用，一般添加使用量在10~20%，主要作用是提供细胞生长所需的营养物质、激素和生长因子等。　　养过细胞的小伙伴们应该都知道：血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的必备营养，也是细胞死亡的“致命毒药”，当我们废寝忘食的，呕心沥血的，鞠躬尽瘁的养着细胞同时，也极有可能因为一时的疏忽和大意选择了品质不好的血清，导致珍贵的细胞意外身外，一切归零，不得不重头开始!　　血清质量的差异性大　　市场上各种血清产品鱼龙混珠，一不小心，你可能就使用了品质不好的血清。　　血清按照采血时间可分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，三者的优劣顺序为：胎牛血清>新生牛血清>小牛血清。　　一般细胞建议使用胎牛血清培养，部分细胞可使用新生牛血清培养，小牛血清则不建议用于细胞培养。　　血清在生产中受采血来源，条件和生产工艺等的影响，质量差异较大，即使相同厂家不同批次的血清都会有差异;另外不同种类的细胞对血清的适应也有不同，这可能与血清中所含的生长因子有关，所以血清在使用之前应提前验证一下对所培养的细胞生长的促进作用。　　血清的正确保存及使用指南　　1）保存：胎牛血清一般在-20℃以下冷冻保存，使用之前应先放到2~8℃冰箱过夜溶解，不建议直接放到室温或37℃水浴溶解(升温过快会导致血清中蛋白质大量沉淀，影响血清质量);若一次使用量不多，可溶解后分装至小包装冻存，避免反复冻融。血清解冻后在2~8℃保存时间一般不超过一个月。　　2）灭活：一般血清使用时不需要灭活。灭活的作用是消除血清中的各种补体成分，但事实证明血清灭活之后会产生大量的沉淀，会对血清的营养物质造成较大破坏，对细胞的生长不利。　　3）沉淀：血清中的沉淀一般为析出的纤维蛋白，另外新生牛血清中各种蛋白含量明显偏高，溶解时较易产生大量沉淀。血清中出现沉淀一般不会影响血清质量，并且升温至37℃时会溶解(不建议加热血清);若沉淀量较多，可在400×g离心3min，取上清使用。血清和添加了血清的培养基在使用时不需要过滤。　　血清使用中的一些问题　　1）如何更换使用血清？　　需要更换使用不同品牌或批次的血清之前，需提前对要使用的血清进行验证，可使用自己经常培养的细胞进行，保证该血清对细胞生长的促进作用。在更换使用时可以将要更换的血清和原本使用的血清1:1混合使用1~2代，待细胞完全适应后进行更换。　　2） 血清颜色的问题　　血清颜色主要是黄色或红色，一般淡黄色或微红色为正常。这个主要受血红蛋白含量的影响，若颜色太深(接近培养基的颜色)，则有可能是采血过程中出现溶血导致的。　　3）血清沉淀的问题　　血清中的沉淀主要是纤维蛋白凝集产生的，一般来说每次冻融都会产生一部分的沉淀，但不影响血清质量和使用。另外，血清在加入到培养基中后也是有可能会产生沉淀的，特别是灭活后的血清，会持续产生黑色颗粒，这可能会被错误判断为污染。一般血清产生的沉淀在显微镜下观察为微小的不规则絮状或者颗粒物质，排查是否为污染最好的办法是用琼脂板检测。

　　在国ji标准术语中，校准与检定的定义是不同的。简单地说，校准是把被测仪器或测量系统与已知参考标准的比较过程，并报告比较的结果。而检定属于法制计量范畴，除与校准一样的比较过程外，检定还要对照技术规范——通常是计量器具厂家给定的技术指标，给出合格与否的结论。校准与检定的对象都是测量仪器、测量系统或计量器具。　　校准和检定有本质区别，两者不能混淆，更不能等同。现就两者之间的主要区别做如下讨论。　　检定过程必须严格执行国家计量技术规范，带有强制性;检定结果要给出计量器具是否合格、能否投入使用的结论。而校准过程，用户可根据需要自主选择校准项目、校准单位和校准时间间隔。校准后只需给出初校准计量器具的示值与标准值之间的关系及可信度，不需要做出讲师器具是否合格的结论。用户可自己选择计量器具能否投入使用。因此，计量校准比计量检定更灵活、应用也更广泛。　　校准是一组操作，检定是一个程序，它们本身并无强制性与非强制性之分。检定可以有强制性的，非强制性的。校准同样可以有强制性的和非强制性的。看它们用于哪些方面，看政府对它们的管理采取什么方式。强制性检定、强制性校准是法制管理范畴。例如对用于贸易结算等涉及公平、安全等方面的计量器具需要实行强制检定，对用于保证整个社会各领域量值统一的计量标准则可实行强制校准。非强制性的检定和校准是市场行为。自愿寻求溯源的计量器具用户根据自身需要，可以要求技术机构给以校准，取得校准证书，也可以要求检定，获得检定证书。可以说，检定的程序中是包含了校准操作的。但校准操作中却不包含检定的全部程序。　　校准　　(1)在规定条件下，用参考测量标准给包括实物量具(或参考物质)在内的测量仪器的特性赋值，并确定其示值误差;　　(2)将测量仪器所指示或代表的量值，按照比较链或校准链，将其溯源到测量标准所复现的量值上。　　校准的目的及步骤　　(1)确定示值误差，判定是否在允差范围内;　　(2)得出标称值偏差的报告值，并调整测量仪器或对其示值加以修正;校准的依据是校准规范或校准方法。　　检定：查明和确认测量仪器是否符合法定要求的程序，它包括检查、加标记和(或)出具检定证书。　　区别点在于　　(1)校准不具有强制性，是企业自愿溯源行为;　　检定则具有法制性，属计量管理范畴的执法行为。　　(2)校准主要确定测量仪器的示值误差;　　检定则是对其计量特性及技术要求的全面评定。　　(3)校准的依据是校准规范、校准方法，通常应做统一规定，有时也可以自行制定;　　检定的依据则是按法定程序审批公布的计量检定规程。　　(4)校准通常不判断测量仪器合格与否，必要时可以确定其某项性能是否符合预期要求;　　检定则必须作出合格与否的结论。　　(5)校准结果通常要求出具校准证书和校准报告;　　检定结果则是合格的发检定证书，不合格的发不合格通知书。　　此外，需要注意，校准和检定法律效力也不同。校准的结论不具备法律效力，给出的《校准证书》只是标明量值误差，属于一种技术文件。检定的结论具有法律效力，可作为计量器具或测量装置检定的法定依据检定合格证书」属于具有法律效力的技术文件。

一、如何搭配流式抗体荧光标记流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪的通道越多，那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多A、 如何根据流式细胞仪搭配流式抗体1） BD流式细胞仪流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的，所以首先需要注意两点：流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三个荧光通道/三个颜色，而选配的Calibur (FACSCalibur的简称)配有488nm和635nm两根激光，可以检测FL1-FL4四个通道/4个颜色。不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的，比如Calibur的FL3（第3通道）能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能检测PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能检测的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道检测。Calibur和LSR都能检测4个颜色，但是第4个通道检测荧光素是不一样的搭配荧光素原则搭配流式荧光素有2个原则：每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意1、每个通道只能选择1种荧光素。以Calibur为例说明，Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择AlexaFluro488，或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素，但是我们我们搭配的时候只能选择其中1个。2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配：如果客户的流式细胞仪能做4个通道，在第1个原则之下，那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2跟激光的Calibur为例，Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 这个搭配组合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。总之，在第1原则之下，我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度B、抗体有多少种荧光素1）供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的我们需要根据同时结合供应商能提供的每种抗体的荧光素进行搭配。原则上同一个标志的不同的克隆号带同1个荧光素在应用上没有区别的，但是有些不同克隆号的抗体之间可能会有一些稍微的差异，需要仔细看说明书。我们可以尽量选择在说明书上有流式图形的抗体，或者选择荧光素种类最多的克隆号的抗体2） 荧光素为什么要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对PH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。二、同型对照（Isotypy Control）1、为什么要用同型对照？同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前，染色方式如下：样本管：一抗＋样本同型对照管：同型对照＋样本2、如何选择同型对照？一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56 APC标记的抗体,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,&kappa。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体，货号是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1。那么染色方式如下：样本管：纯化的CDw25＋PE标记的抗Mouse IgG1＋样本同型对照管：纯化的同型对照＋PE标记的抗Mouse IgG1＋样本如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类别。比如，某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。3、如何查找同型对照？同型对照在BD英文目录中或者BD网站上跟它对照的抗体的位置是一致的。BD目录中，抗人的抗体的同型对照都在HUMAN章节后面。抗小鼠的抗体的同型对照在MOUSE章节后面，非人类灵长类的抗体同型对照在NON HUMAN PRIMATE章节后面。由于抗大鼠的抗体非常少，大部分抗体都是小鼠来源的，所以它的同型对照跟小鼠的一样，放在MOUSE章节后面。胞内细胞因子、趋化因子、补体、炎症介质及其受体的同型对照放在其章节的后面（注意：人的胞内细胞因子的同型对照跟人的表面标志的同型对照是不在一起的）。Phosflow的同型对照在Phosflow的介绍后面。比如，比如抗人的CD56 APC标记的抗体，成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是在HUMAN章节中Mouse，APC标记的Mouse IgG1,&kappa。4、哪些客户需要使用同型对照？A 对流式不是非常熟悉的客户。B 做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户一般可以不使用同型对照。5、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象，在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。三、补偿微球流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握，同时，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时，需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿，才可以得到比较好的数据和图片。那么，现在不需要这么麻烦。因为补偿微球让一切变得更简单。BD CompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节）的缺点。它本身不携带任何荧光，借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等，操作起来很简单，灵敏度高，一致性好，使补偿更轻松更准确，而且最难得的是它最适合于多色分析（如五色、六色、七色等）和复合荧光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存，方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。

　　同标准品一样，对照品也是实验室中的“常客”，有人说标准品和对照品就如同双胞兄弟，这话其实真没错，虽然两者间是有必然区别，但关系却是密不可分，既然是实验室常客，其用途主要也是用于生化研究，含量测定等，据不完全统计，对照品的品种已经高达几百甚至于上千种，这么多的对照品，我们应该如何正确去使用呢?其标定方法的注意细节你都知道吗?　　鉴于对照品的品种众多，对于它的保存方法我们也是一定的要求，一般来说应将对照品置于干燥阴凉处，大家都知道对照品是实验室常客，所以如果保存不当，会直接影响到它的实验精准性，但是对于不同的对照品，保存方法也是不同，建议开瓶后的对照品尽快使用完，避免对照品的分解、污染或吸潮。本文重点为您讲述对照品的正确使用方法_对照品标定方法注意细节。　　对照品网浅谈对照品的正确使用方法：　　对于对照品的使用方法，我们一般分为四个步骤，比如开启进行时，开启后等，具体的正确使用方法请往下看：　　1.正确开启(对照品开启进行时)　　很多对照品是置玻璃安瓿中保存，启开时必须严格防止玻璃屑掉入瓶中。具体可按如下操作：轻微震敲安瓿，尽量使内容物聚集于底部，砂轮切割几圈后，平置或头部略向下斜置安瓿，带好防护手套，双手拇指顶住颈部发力，注意拇指与食指不要捏得过紧，以免捏碎头部。启开安瓿后，将安瓿稍许向下倾斜，轻微振敲，因玻璃屑较重，若混入内容物中，此法可将其振出。　　2.对照品开启后　　应严格密封，或转移至经100℃以上烘干后并置干燥器中冷却至室温的西林瓶中，密封，置干燥器中，某些品种应按使用说明再置冰箱中冷藏；对于易吸潮的对照品，如奥美拉la唑等，若用于含量测定，应启开后立即使用，剩余部分日后可用于鉴别，但建议不要再用于含量测定；对于引湿性较弱、稳定性良好的品种，如氯mei素等，启开后若保存得当，亦可用于含量测定，使用时间视储存条件而定，必要时做期间检查。　　3.过期对照品　　对于过期的对照品，如果继续保存，则需单独放置，以免混淆；必要时(如中检所缺货)，亦可应急使用，可用于鉴别；如用于定量，则需有溯源核查数据保证。　　4.对照品保存要求　　4.1.对照品溶液贮存条件一般是在2～8℃冰箱中贮存，其间隔时限可根据对照品溶液的具体特性来确定；按照药品质量标准，配制对照品溶液，计算该对照品溶液含量，用此对照品溶液按质量标准进行正常产品检验。　　4.2.待对照品溶液放置到个期限(通常3天、7天、1个月等，根据对照品的稳定性确定)，按照药品质量标准，配制新的对照品溶液(按药品质量标准进行检测)计算含量。　　4.3.同时将*初的对照品溶液(当做产品)按药品质量标准进行检测，并计算含量；将所得到的含量求相对偏差，若不大于1.0%(有的规定不大于2.0%，个人觉得偏差有点大),则说明对照品溶液或标准品溶液是稳定的，在个期限内可以用于检验；依此继续重复确定对照品的具体贮存时间。　　同时将*初的对照品溶液(当做产品)按药品质量标准进行检测，并计算含量；将所得到的含量求相对偏差，若不大于1.0%(有的规定不大于2.0%，个人觉得偏差有点大),则说明对照品溶液或标准品溶液是稳定的，在个期限内可以用于检验；依此继续重复确定对照品的具体贮存时间。　　对照品标定方法时需注意的细节要点　　1.供试品的取用量应满足滴定精度的要求(消耗滴定液约20ml)。　　2.滴定终点的判断要明确，提供滴定曲线；如选用指示剂法，应考虑其变色敏锐，并用电位法校准其终点颜色。　　3.为排除因加入其它试剂而混入杂质对测定结果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法。　　4.要给出滴定度(采用四位有效数字)的推导过程；标定结果要根据3个以上实验室各不少于15组测定结果经统计分析，去除离群值和可疑值后的结果，并报告可信限。　　目前，很多的企业其实对于对照品的管理并不是十分到位，特别是那些对照品本身就不是很了解的企业而言，经常会将对照品配制成浓度较高的储备液，但未能对其稳定性和储存期限进行考查，有些将开启后和开启前的对照品放一起，包装上也没有特别说明。这也让某些对照品失去了原本的实验精准性。

在我国标准物质领域，标准物质是一个通用术语，有多种形式：国家标准物质、国家标准样品、参考品、国内外厂家生产的标准样品。国家标准物质经过全国标准物质管理委员会审查，由国家质检总局计量行政部门批准发布;国家标准样品由全国标准样品技术委员会实施、监督和管理，经过国家标准化管理委员会评审、审批和发布，标准物质和标准样品都是有证标准物质。研制标准物质、标准样品的定值方法：标准物质、标准样品的定值方法分为基准测量方法、参考方法和国内外公认的有效方法3种。基准测量方法是具有最高计量学特性的方法，其操作可以被完整地描述和理解，可以用SI单位对不确定度进行完整表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准方法有：同位素稀释质谱法、库仑法、重量法、滴定定法、凝固点下降测定法。参考方法是经过系统地研究，确切而清晰地描述了准确测量特定化学成分量所必需的条件和过程的方法，其准确度和精密度能满足评价其他方法准确度和给一级标准物质赋值的要求。国内外公认的有效方法是已被证明技术性能可以满足其应用目的的方法。标准样品的定值模式有4种，标准物质的定值模式有5种，分别是：(1)在单个实验室中用单个(基准)方法测量;(2)由一个或几个实验室用两种或多种独立的参考方法定值;(3)使用一种或者多种已证明准确性的方法，由多个实验室合作定值;(4)利用特定的方法定值;(5)与一级标准物质进行比较测量定值(仅对二级标准物质)。对于国家一级标准物质，由于其准确度要求具有国内最gao水平，大多数采用基准方法或参考方法测量定值。用基准方法测量可以在单个实验室中完成，当定值结果基于制备数据(如重量法配制值)得到时，还应采用一种独立、准确的测量方法核对定值结果。

标准溶液的提取有两种方法，一种是直接制备对照品，另一种是已知准确浓度的标准溶液的校准和提取。标准溶液浓度的准确与否直接关系到检测结果的精密度和准确度，其制备条件有非常严格的要求。下面小编跟大家分享一下~自配标准溶液须具备的基本要求：1. 应采用洁净的优质硬玻璃容量瓶作最终体积的容器。2、为保证标准溶液配制的可靠性和准确性，实验室设备和环境设施应符合其要求,(应有监测、控制和记录环境条件。特别对灰尘、电磁干扰、放射、温度、湿度、供电等)。3.高纯度的溶质或对照物(如金属、金属氧化物或金属化合物;酸、碱、金属有机化合物、适宜的盐类、有机溶剂等)4、要有配制标准溶液的纯度高的溶剂（去离子水的双重蒸馏，高纯度浓度的酸、碱或有机溶液)。5. 根据所配标准溶液对盛放容器的要求,标准溶液必须储存在干净的容器中存放，并按规定要求(如避光、通风、阴凉、冷藏等条件)放置配制好的标准溶液。6. 具有符合称量要求器具、应有正确称量的电子分析天平,并通过周期性的检定,有质检部门检定的证书。7、配制所用的器皿用具，必须按检验项目的要求，对器皿进行分类清洁处理，并满足具体的清洁要求，确保标准溶液无污染，对检测不产生不良影响。8. 必须登记标准液配制的原始记录，必须完整填写标准液标签(如标准溶液名称、浓度mg/ml或mol/ml,配制人,配制日期、有效期等),并将标签贴在试剂瓶上。自备标准溶液作为工作标准溶液，一般用于日常检验分析，不用于其他具有法律效力的检测结果。除非能够证明其作为测量参考标准的性质不会失效；有机溶液的标准物质储存时应避免标准溶液与塑料胶木瓶盖直接接触。

自制标准品需求进行的操作规程是什么?企业如需克己作业规范品或对照品，应当树立作业规范品或对照品的质量规范以及制备、辨别、查验、批准和贮存的操作规程，每批作业规范品或对照品应当用法定规范品或对照品进行标化，并确认有效期，还应当通过定时标化证明作业规范品或对照品的效价或含量在有效期内保持稳定。标化的进程和成果应当有相应的记录。1.企业对克己作业规范品或对照品的管理应满意以上条件，不需送样到药检所查验。2.对作业规范品非常全面的规则了，关键是企业的标定流程和成果一定要符合要求。法定标准品及标定查验办法：法定规范品是指USP、EP、CP等规范品的现行批号。要挑选药典的查验办法。不同的规范选用不同的药典查验办法。规范品质量规范的树立 要首先树立作业规范品的质量规范，总的原则是在原法定规范的基础上树立，该规范要严于药典规范。标准品的标定进程a 若需求，应对规范品进行预处理(如枯燥);b 选用两个熟练的人员进行标定;c 各称取一份法定规范品，三份样品;d 系统适应性试验应合格;e 同一化验员含量成果的RSD应不大于0.5%，不同化验员含量成果均匀值的相对偏差应不大于0.3%;f 均匀后作为标定成果。

 支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。支原体是在1898年发现的，是一种简单的原核生物。其大小介于细菌和病毒之间。支原体结构也比较简单，多数成球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。支原体可以在特殊的培养基上接种生长，用此法配合临床进行诊断。一、性状形态与结构支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。支原体结构支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。 肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。培养特性营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲脲原体最适pH6.0～6.5。大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径10～16um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式，盖因缺乏细胞壁造成分裂时二个子细胞大小均所致。同时，支原体分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。生化反应与分型一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类。解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。各种支原体都有特异的表面抗原结构，很少有交叉反应，具有型特异性。应用生长抑制试验（Growth inhibition test,GIT）、代谢抑制试验(Metabolic inhibition test,MIT)等可鉴定支原抗原，进行分型。抵抗力支原体对热的抵抗力与细菌相似。对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂。对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大。对影响壁合成的抗生素如青霉素不敏感，但红霉素、四环素、链霉素及氯霉素等作用于支原体核蛋白体的抗生素，可抑制或影响蛋白质合成，有杀灭支原体的作用。致病性与免疫性支原体不侵入机体组织与血液，而是在呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞粘附并定居后，通过不同机制引起细胞损伤，如获取细胞膜上的脂质与胆固醇造成膜的损伤，释放神经（外）毒素、磷酸酶及过氧化氢等。巨噬细胞、lgG 及 lgM 对支原体均有一定的杀伤作用。呼吸道粘膜产生的SlgA抗体已证明有阻止支原体吸附的作用。在儿童中，致敏淋巴细胞可增强机体对肺炎支原体的抵抗力。二、特点支原体是目前所能发现的能在无生命培基中生长繁殖的最小的微生物。支原体体形多样，基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，其菌落呈针尖大小，故又称之为微小支原体。能引起人类泌尿系感染的是解脲支原体和人型支原体。主要通过性接触传染，少数也可间接传染。泌尿系统是它的易感细胞。由于它没有细胞壁，因此对影响细胞壁合成的抗生素，如青霉素等不敏感，红霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素，可抑制或影响支原体的蛋白质合成，有抑制支原体作用，但不能根治，不能使机体对其产生免疫抗体，容易反复，目前采用中药治疗可弥补这方面的缺陷。支原体是最小最简单的独立生活的原核生物。它没有固定形态，形态随环境而变化，在液体中可呈球形、环形和丝状；它没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜。解脲支原体（惟一确认的一种)具有尿素酶活性，能分解尿素。感染人体后，通过黏附于宿主细胞的受体上，引起细胞膜损伤，其代谢产物产生毒性作用。衣原体除可引起尿道炎、眼结膜炎外，还可引起附睾炎、前列腺炎、宫颈炎、阴道炎、输卵管炎及盆腔炎等。新生儿通过产道可被感染发生眼结膜炎、肺炎。男性同性恋者，可患直肠炎及咽炎。三、支原体标本采集：1．标本采集：男性：用无菌棉拭子插入尿道约2cm处旋转，静止数秒钟后取材。女性：支原体标本抹去宫颈口粘液，用无菌拭子插入宫颈管l－2cm旋转取材。尚可用前列腺液、精液、尿液离心沉淀物作标本。支原体标本2．接种：将标本洗入Uu或Mh液体培养基，或用滤菌器过滤接种。3. 培养：置370C恒温箱孵育1～3天，每日观察培养基颜色变化。培养结果：液体培养基由黄色变红色，清亮透明可初步判断为Uu或Mh阳性。

任何微生物只能在一定的温度范围内生存，在适宜的温度范围内微生物能大量生长繁殖。根据微生物对温度的不同反应可分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热（或极端嗜热）5种类型。它们都有各自的最低、最适和最高生长温度范围。原生动物的最适温度一般为16～25℃，工业废水生物处理过程中的原生动物的最适温度为30℃左右，其最高温度在37～43℃，少数可在60℃中生存。大多数放线菌的最适温度为23～27℃，其高温类型在50～65℃生长良好，有的放线菌在20℃以下的温度中也可生长。霉菌生长与温度的关系和放线菌差不多。在实验室培养放线菌、霉菌和酵母菌多采用的温度为28～32℃。藻类的最适温度多数在28～30℃不同微生物生长温度的一些典型例子。温度的变化都会对每种类型微生物的代谢过程产生影响，微生物的生长速率会发生改变，以适应温度的变化。微生物能够最快生长的温度叫作最适温度，能够生长的最低或最高温度，分别叫作最低温度和最高温度。低于最低温度微生物停止生长，超过最高温度微生物则会死亡，超过最高温度基点愈高，微生物死亡愈快。一般无芽孢杆菌在60℃时30min致死，70℃时10～15min死亡，在80～100℃情况下，几分钟全部无芽孢微生物都会死亡。芽孢较耐高温，但各种微生物产生的芽孢耐高温的程度不同。在100℃情况下，有的几分钟内死亡，有的能在沸水内2h也不致死。芽孢比菌体耐高温的原因可能是芽孢内结合水含量较高。微生物对低温抗力较强。低于生长最低温度一般只能抑制其生长，很少有杀死作用。如酵母菌细胞可在-130℃下经24h不死亡，细菌芽孢和霉菌孢子可在-190℃下存活半年。因此，根据微生物对低温的抵抗能力，在实践中常用低温保存菌种。

说到实验室的维护及保养，我们想到的更多的是实验室内的各种仪器和实验设备的维护和保养，但其实，我们实验室内的家具及通排风设备也是需要日常的维护和保养，恰当的操作方式和适当的维护保养不但可以有效的延长实验室家具及通排风设备的使用寿命，还可以在一定程度上降低实验室的能耗。一、恰当的操作方式通风柜玻璃视窗全开状态仅在组装、调试内部仪器或清洁柜内空间时方允许出现。使用通风柜时，将玻璃视窗拉至半开状态，使操作人员胸部以上受到玻璃视窗的保护。通风柜使用完毕后将调节门关闭到最小开度，并开启节能模式。通风柜使用时，避免过多的走动干扰通风柜的面风速稳定。操作人员不使用通风柜时，通风柜操作空间内避免存放过多实验器材或化学物质，不要长-期堆放。经常使用的器具或试剂可以暂时存放在通风柜下柜中，长时间保存时应将试剂放于专用的试剂柜中。在做实验时，若不慎打翻有毒有害挥发性物质，请操作通风柜控制面板上的一键紧急排放按钮，使排风开到最-大，保-证有害物质尽快被排出。通风柜工作时，请勿将轻薄物体放到通风柜内部，以免柜内排风导致轻薄物体被吸至管道内造成堵塞故障。二、通风柜及实验室家具的日常保养◆通风柜定期使用中性清洁剂清洁刷洗柜内各部，包含玻璃视窗、内衬板及导流板内外。定期润滑调节门之滑轨、拉索及平衡滑轮。定期测试各遥控装罝（水龙头，气体拷克）是否可正常运作。定期检视排气出口管路，特别是排气罩与管路连接部份是否有泄漏现象。定期检查排气罩内部，特别是弯管部是否有杂质堆积。通风柜台面虽可耐高温，但不建议长时间与明火、高温直接接触。使用电炉时，需加石棉垫板或三角支架隔热；如瓦数大的电炉应垫垫板，并且不宜长时间存放，以免影响通风柜的使用。通风柜台面虽对各种化学品均具有良好的抗蚀性，但长时间浸泽接触，仍然可能产生影响，故建议若有化学品滴落台面时，应尽快清除。◆实验室家具实验室家具是不能长时间在阳关下曝晒的，会伤害其表面的涂层，导致黯淡无光。实验室家具若不小心出现了刮痕，可用颜色相近的颜料涂色，再进行打蜡处理，使刮痕不那么显眼。不要用碱性过强，或者是过烫的开水洗刷实验室家具，防止破坏实验室家具的漆面。木质的实验室家具不宜放在潮湿不通风的地方，容易发霉。办公桌和文件柜要注意其承重性，防止因受压而变形。实验室家具最-好定期进行维护和保养，比如定期打蜡，保持其表面的光泽。◆不同台面的清洁理化板：理化板表面建议采用温水、丙西酮或性质温和的清洁剂清洗，可选用用来洗手或洗碗的清洁剂，不要选用有磨料、强酸成份的清洁剂以免损伤表面，对于顽固的污渍，可将次氧酸滴于污染的理化板表面后用清水洗净。陶瓷板：氢氟酸对台面有不同程度的影响，需谨慎使用，使用时需加一层塑料垫板或橡胶垫板加以保护。常规台面只需日常清洁，与吸附性强的液体，需使用牙膏或草酸稀释剂擦拭。不要使用坚硬物刮刻台面，桌面仪器移动时尽量轻抬轻放，避免拖拽。环氧树脂板：由金属、橡胶及类似物体导致的油渍划痕可用蘸满石脑油或溶剂的布来擦拭。定期用纸巾或干净的抹布进行清洁、擦亮，也可使用光亮油进行清洁与光亮。如果想恢复台面板原有的光泽，可用蘸满油的布擦拭表面，再用干布擦干。实验室定期进行维护和保养可以有效延长实验室家具及设备的使用寿命，同时可以及时查出实验室内的一些安全隐患，从而避免一些因设备老化或使用不当而造成的安全事故。但是，目前国内对于实验室的定期维护和保养的重视程度不足，且没有专门负责维护的人员及定时的维护，从而导致很多实验室建成没多久就会显得很老旧，一些设备还未达到设计寿命就老化严重甚至破损。

告诉你一个不幸的消息，你所在的实验室普遍存在这七大类风险，一定要多加注意，才能够确保实验数据结果的可靠性!实验室仪器设备的风险 ：1.相互有影响的仪器设备放置在一起，相互干扰，数据不准;2.仪器设备长-期不校准/检定，准确性无保障;3.仪器设备不做期间核査，性能不撑控;4.仪器设备无状态标识或标识混乱，容易错用;5.仪器设备无安全保护装备，对操作员有安全风险;6.气瓶没有分类贮存，无固定和防漏设施，有爆燃隐患;7.仪器设备气路交叉杂乱，有火灾安全隐患;8.仪器设备使用无记录，出现异常无法追溯;9.仪器设备档案信息不全，对维护造成困扰;10.仪器设备无强排风装置，对操作人员有伤害。实验室环境控制存在风险 ：1.操作间与仪器间无温湿度仪，实验环境条件不清楚;2.无“三废”收集处理装置，对环境造成威胁;3.房间墙壁脱落，地面粗糙不，杂物乱放，台面凌乱，环境感官不佳，有粉尘污染实验的危险;4.实验室无强制通风设备，无防火、防水、防腐和急救设施，有人身安全感风险;5.废旧和长-期停用设备未清出检测现场，有误用风险;6.检测工作时无环境条件记录，检测结果无法复现;7.微生物学实验室物流与人流未分开，一更、二更和三更不规范，有交叉污染风险;8.致病性微生物实验室无生物安全装置，对操作人员有bin菌感染风险;9.相互有影的工作空间没有有效隔离，影响检测结果准确性;10.办公室、检测室、仪器室混用，相互交叉污染，存在安全隐患和结果准确性风险。实验室标准和标准物质存在风险 ：1.标准无受控编号，标准变更后无法全部追溯变更，有错用废旧标准的风险;2.标准长时间无查新，标准废替新发不掌握，有错用废旧标准的风险;3.废旧标准无收回或无加盖“作费” 章，有误用可能;4.现行有效标准没有购买正式板本，有文本错误的可能;5.新标准无宣贯记录，无法保-证所有相关人员准确掌握;6.新标准启用无审批程序和记录，技术负责人责任不到位;7.标准物质与其它试剂混存，有交叉污染的风险;8.标准物质无期间核查记录，标准质量不掌控，对检测结果有影响;9.标准物质无法定证书，标准质量不保-证，有结果失真风险;10.用容量瓶贮存标准物质，有测量准确性下降的风险。实验室化学药品及耗材存在问题 ：1.没有合格供应商名录，耗品质量无保障;2.剧du药品未实现双人双锁和使用跟踪监督制度，有judu药品外泄风险;3.易制du药品未实现双人双锁，有易制du药品外泄风险;4.试剂药品无领用登陆记录，试剂药品管理不到位;5.试剂贮存与操作间同室，对检验员健康有害;6.试剂瓶标识信息不足，试剂过期失效不掌控;7.标准试剂配制时未在恒温恒湿条件下进行，量具热涨冷缩，标准溶液无法配准;8.批量采购或用量大试剂未再检验验证，试剂不合格会造成巨大损失;9.耗材质量无风险分析评估，耗材质量不合格会造成巨大损失;10.试剂没分类贮存，有交叉污染风险，试剂室或试剂柜无强排设施，对操作员健康有害。实验室样品管理存在十da问题 ：1.样品编号混乱，无统一唯1性编号，易混淆;2.收样时无进样品状态描述和风险评价，出现结果异常无法追溯;3.样品没有流转卡，样品责任不明确;4.样品无待检、在检、己检和留样状态标识，有漏检和重检的可能;5.样品和留样无分类贮存和监控，存在交叉污染和霉变风险;6.检毕样品回收和处置不规范，技术负责人责任不到位;7.样品室与办公室混用，有安全风险;8.样品处理室与检测室混用，有交叉污染风险;9.样品贮存无环境监控记录，有样品损毁风险;10.样品采集过程中代表性不强，抽样记录不祥，影响检测结果。实验室人员管理存在 的 十da问题 ：1.关键岗位人员无任命文件，职权不明确;2.检验项目无人员上岗证，能力不确认;3.各类人员岗位交叉，岗位职责不明确;4.关键人员无监督计划或记录，监控不到位;5.技术和管理人员无培训计划或记录，技能不能持续提高;6.人员技术档案与人事档案混淆，对准则理解不准确;7.授权鉴字人职称和学历达不到要求，不能担任该职;8.技术负责人职称学历达不到要求，不能担任该职;9.检测人员无大型设备操作证，对设备和结果度不利;10.人员的所学专业与从事专业跨度太大，必须继续教育和考核。实验室检测报告中存在十da问题 ：1.报告信息量不足，不符合《准则》要求;2.报告结论不正确，授权签字人责任不到位;3.报告数据与原始记录不一致，报告审核人责任不到位;4.报告无三级审批签字，报告管理混乱;5.报告格式多变，不严肃谨慎;6.报告中加盖的“检验检测专用章”不符合《准则》要求，必须更换;7.报告无骑缝章，有报告调换内页的风险;8.报告或原始记录有不规范的涂改，由作-假的可能;9.分不清检验报告、检测报告、鉴定报告的区别;10.报告的发送程序执行不严，有涉密风险。

滴定分析法，作为一种简便、快速和应用广泛的定量分析方法，在常量分析中有较高的准确度，滴定分析可算是实验室中最最chang用的定量方法啦！滴定分析法的优点：1、操作简单；2、对仪器要求不高；3、有足够高的准确度误差不高于0.2%；4、方便，快捷；5、便于普及与推广。适合滴定分析的化学反应应该具备以下几个条件（1）反应必须按方程式定量地完成，通常要求在99.9%以上，这是定量计算的基础。（2）反应能够迅速地完成（有时可加热或用催化剂以加速反应）。（3）共存物质不干扰主要反应，或用适当的方法消除其干扰。（4）有比较简便的方法确定计量点（指示滴定终点）。常见滴定分析法有哪几类？1.酸碱滴定法滴定分析法中，酸碱滴定最基本。中心问题：“酸碱平衡”，本质是酸碱之间的质子传递。2.配位滴定法主要是：EDTA的结构、性质、配位平衡、稳定常数、滴定曲线、指示剂的选择及消除干扰的方法。重点：配位平衡。在配位滴定中, 除主反应外, 还有各种副反应干扰主反应的进行, 反应条件对配位平衡有很大的影响。3.氧化还原滴定法氧化还原滴定法的核心仍然是平衡，是以电子转移为依据的平衡，反应条件对平衡的影响很大。4.沉淀滴定法沉淀滴定法的核心是沉淀平衡。重点是银量法, 根据确定终点的方法不同, 可分为摩尔法、福尔哈德法、吸附指示剂法。酸碱、配位、氧化还原、沉淀滴定之联系与区别滴定分析的共同特点是在滴定过程中，被测离子浓度呈现出规律性变化。只要重点掌握酸碱滴定过程中pH值计算，其它几种滴定方法可依相同的思路加以解决。通常把滴定过程分成四个阶段，即：(1)滴定开始前；(2)滴定开始至计量点前；(3)计量点时；(4)计量点后。要了解滴定过程被测离子浓度的变化情况，shou先必须弄清滴定各阶段溶液组成的变化情况，然后根据相应组成的计算公式计算。特别应注意的是：滴定过程中达到计量点时滴定剂由不足99.9%到过量0.1%之间pH(PM，PE)的变化范围，即滴定突跃，这是选择指示剂的重要依据。酸碱指示剂变色范围？影响因素？酸碱指示剂的颜色随溶液PH的改变而变化，其变色范围越窄越好，在化学计量点附近，PH稍有改变，指示剂立即由一种颜色变为另一种颜色，指示剂变色敏锐。表：常用的酸碱指示剂及其变色范围～影响指示剂变色范围的因素1、温度：温度改变，指示剂的变色范围也随之改变。例如：18℃时，甲基橙的变色范围为3.1-4.4,100℃时，则为2.5-3.7。2、溶剂：指示剂在不同溶剂中变色范围不同3、指示剂用量：浓度小：颜色变化灵敏；浓度大：终点颜色变化不敏锐；指示剂用量少一点为佳。滴定分析操作注意事项仪器的检漏（滴定管、容量瓶）、洗涤滴定管和容量瓶使用之前应当先检漏。具体检漏方法想必你早就知道，只说说注意事项哈：1、凡士林不应涂太多，否则会堵塞小孔；2、旋动旋塞时应有一定的向旋塞小头部分方向挤的力，以免来回移动旋塞，使塞孔受堵；3、滴定管、容量瓶、移液管（吸量管）、锥形瓶都需洗涤。

1.化学实验室里，护目镜是必须有的。就算是最常用的石油醚丙酮这样的溶剂，进了眼睛都足够难受，更别说那些有机实验室里各种有毒和腐蚀性的物质，会对眼睛造成损害。以及乌鸦嘴一点，说不好哪个反应突然爆炸了，护目镜能保住你的双眼。即使危险只有千万分之一的可能性会发生，只要发生在你身上，对你而言就是百分之百的。事实上实验室里很多的注意事项和规定都是为这个而设的。不光是降低意外发生的可能性，同时也是降低意外真的来临时，你所受到的伤害。2.甲醇本身在有机实验室里毒性算是可以被忽略不计的选项了，但是再低毒的溶剂，长期吸肯定要出问题。尽可能减少你自己吸收甲醇的量，挥发性的东西尽可能在通风橱当中处理。如果没有通风系统，就尽量开门窗保持通风，以及尽可能减少在实验室里的时间，赶紧做完毕设赶紧走人吧。3.洗眼器保持清洁。结合第一条看，把他清理干净了。毕设在实验室，做这种大家都不愿意做的事情，大家对你的印象会好些，而且这个洗眼器在关键时刻说不定能救你的双眼。4.一旦入眼，大量清水冲洗，必要时去医院检查。这又回到护目镜和洗眼器很重要这事来了，别人不惜命你管不了，起码管好自己啊。5.题外话，空气中有机溶剂量大的话，一旦静电或失火，在有机实验室这种地方，搞不好一炸大家一起死。6.再一句题外话，手套不能完全防止各类有机溶剂，哪怕隔着手套碰到甲醇，请及时清洗。最好带两双手套，加一分保护的。7.口罩对防甲醇没啥用，这货没那么厉害……主要防的是实验室的固体粉末和硅胶粉之类的。在这种环境下，记得穿好长袖实验服。甲醇蒸汽的吸收不光通过呼吸道，还有皮肤。

　　细胞增殖检测的应用相当广泛，不论是测试药物试剂还是生长因子的效果，不论是评估细胞毒性还是分析细胞活性状态，您都可能会用到它。细胞增殖检测一般是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。细胞增殖检测主要分为四类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于您所研究的细胞类型和研究方案。　　DNA合成检测　　DNA合成检测是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。传统方法是，将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育几小时或者孵育过夜。这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器SC检测。该方法时间耗时长而且还有个明显的弊端，那就是使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，您还可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。不过这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的好处就是让您不需要再和放射性物质打交道。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。　　代谢活性检测　　检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，因此四唑盐或者Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。您可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。　　四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒的。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子。而WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色。Alamar Blue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞它就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。　　增殖标志检测　　有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。　　ATP检测　　细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。　　适合才是最hao的　　怎样选择最shi合自己的检测方法，这依赖于您的细胞类型和研究方案，当然还取决于您在细胞增殖中期望得到的信息。举例来讲，假如您已经有了待测细胞(不论是在培养板还是在溶液中)，希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，那您可以使用四唑盐和比色法检测。相应的，如果您对DNA合成的改变更感兴趣，可以选择用BrdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。若您研究的是单个细胞，也可以用BrdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，您就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。本文介绍的四种方案都是久经考验的可靠方法，选择最shi合自己的检测方式，好结果自然水到渠成。

没有ct值检测结果遇到没有Ct值情况，排查是否有以下问题：1、循环数不够（一般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准）；2、PCR程序设置错误，检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中；3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；4、模板量可能降解或上样量不足（不超过500ng，根据试剂盒说明书即可），对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起；如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融；5、引物探针是否合适（尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增）。标准曲线不佳标准曲线线性关系不佳R21、标准品稀释或者加样误差，使得标准品不呈梯度；2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装，保存于-20℃或-80℃，现配现用；3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；4、模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以50—500ng为宜。ct值过晚在相对定量中，Ct值一般控制在15—25之间比较好，如果在绝对定量中，对低拷贝数的样品，Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计和目的进行。1、 扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适，需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；2、PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短（可以在推荐的时间条件下延长10s）；3、MgCl2 浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。熔解曲线峰不特异熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题：1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳，尤其是涉及二聚体存在时，适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度比例；2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒，不同试剂盒在该方面的优化能力不适合，有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果；阴性对照扩增有信号照扩增有信号排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。4、模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。扩增曲线异常遇到扩增曲线异常，比如“S”型曲线等等情况，有可能是以下环节存在问题：1、模板的浓度太高或者降解；2、荧光染料的降解；3、在操作荧光定量PCR时，带上新的一次性手套，盖上避免任何指纹或者字迹等；4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发，没有很好的聚集在管子里；5、气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。扩增效率低该情况适用于针对所有的基因，特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时，应考虑如下情况：1、反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解；2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法，适当延长变性退火时间；3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的，应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。

一、试剂有效期的参考因素试剂的有效日期是影响实验结果准确性的重要因素。在实际使用过程中，人们总是习惯于用生产日期来判断化学试剂的有效性，其实这是不对的。化学试剂不像食品和药品有严格的保质期， 化学试剂一般没有保质期的具体要求和界限， 这与化学试剂的保质期受多方面因素影响有关；要根据化学性质、保存条件等， 再结合工作的实际情况判断试剂是否出现变质、 能否继续使用。试剂的性质对有效期的影响化学试剂一般没有注明保质期， 确定试剂是否变质主要是凭经验和做新旧试剂对比试验。化学试剂的有效期随着化学品的化学性质的改变，有着很大的区别。一般情况下，化学性质稳定的物质，保存有效期就越长，保存条件也简单。一般遵循以下几个原则（一般原则，不是绝对原则）：1、无机化合物，只要妥善保管，包装完好无损，理论上可以长-期使用。但是容易氧化（如亚硫酸盐、ben酚、亚铁盐、碘化物、硫化物等应将其固体或晶体密封保存，不宜长-期存放；水溶液亚硫酸、 氢硫酸溶液要密封存放；钾、钠、白磷更要采用液封形式） 、容易潮解的物质，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5 年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。2、有机小分子量化合物一般挥发性较强， 包装的密闭性要好，可以长时间保存（3～5 年） 。但容易氧化、受热分解、容易聚合、光敏性物质等，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5 年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。3、有机高分子，尤其是油脂、多糖、蛋白、酶、多肽等生命材料，极易受到微生物、温度、光照的影响，而失去活性，或变质fu败，故此，要冷藏（冻）保存，而且时间也较短。4、基准物质、标准物质和高纯物质，原则上要严格按照保存规定来保存，确保包装完好无损，避免受到化学环境的影响，而且保存时间不宜过长。一般情况下，基准物质必须在有效期内使用。在常温（15℃~25℃）下保存时间一般不超过 2个月。超过两个月要重新标定或检查之后再用。5、培养基：按规定配制并消毒好培养基，冷至室温，保存在阴暗处（尽可能贮藏在冰箱内） ，配制好的培养基应在1个月内用完。6、除另有规定外、试液、缓冲液、指示剂（液）的有效期均为半年。液相用的流动相、纯化水有效期为 15 天。7、除另有规定外，液体试剂开启后一年内有效，固体试剂开启后三年内有效。二、环境条件对有效期影响1、空气的影响：空气中的氧气易使还原性试剂氧化而破坏。强碱性试剂易吸收二氧化碳而变成碳酸盐，水分可以使某些试剂潮解、结块；纤维、灰尘能使某些试剂还原、变色等。2、温度的影响：试剂变质的速度与温度有关。夏季高温会加快不稳定试剂的分解；冬季严寒则促使甲醛聚合而沉淀变质。3、光的影响：日光中的紫外线能加速某些试剂的化学反应而使其变质（例如银盐、汞盐、溴和碘的钾、钠、铵盐和某些酚类试剂） 。4、杂质的影响。不稳定试剂的纯净与否、对其变质情况的影响不容忽视。例如纯净的溴-化汞实际上不受光的影响，而含有微量溴化亚汞或有机物杂质的溴-化汞遇光易变黑。5、贮存期的影响。不稳定试剂在长-期贮存后可能发生歧化聚合，分解或沉淀等变化。在贮存期和有效期内液体如发现有分层、浑浊、变色、发霉等异常现象，流动相用于样品检测时，样品的保留时间或相对保留时间发生明显变化，固体如发现吸潮、变色等异常现象则应停止使用。三、使用对有效期影响依据使用的要求对化学试剂的有效期做出判断，最重要的一点是判断试剂对结果是否有影响，有影响需要缩短有效期，甚至是报废。

提高抗体纯化效率一方面可以通过优化现有纯化工艺设备、方法和工艺，挖掘现有纯化技术的潜力。另一方面则可以通过开发创新性的介质和工艺，从根本上突破现有技术障碍。抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体，并利用了至少1个离子交换层析作为精纯步骤，仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。图1中显示了一个常见的抗体纯化工艺。反应器收获液首先经过离心和过滤，去除细胞和细胞碎片，然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后，通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤，最后换液并调整抗体浓度，得到抗体原液。工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。 第一话 离心、过滤抗体为胞外分泌型表达，纯化的第一步是将培养液上清与细胞及细胞碎片分离开来。在实验室规模，分离可通过简单批次离心完成，但大规模抗体生产主要采用连续分离的方法，主要包括深层过滤、切向流过滤和连续流离心。深层过滤的优点是简单易用，前期投入低。深层过滤介质的孔径分布较广，内表面积大，可依靠孔径截留和内表面吸附双重作用去除固体颗粒，比单一孔径滤器能处理更大量的固体杂质，且流速更快。深层过滤系统由一系列的滤器组成，介质的孔径从上游到下游递减（见图2）。深层过滤本身不能达到无菌过滤，所以过滤系统的最后一级通常需要一个无菌滤器。深层过滤介质中含有硅藻土，硅藻土在抗体纯化条件下带正电荷，在去除细胞和细胞碎片的情况下，还可以去除部分带负电荷的宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质，起到初步纯化的作用。深层过滤的缺陷是一次性滤芯使用费用高和处理量有限，在处理大体积培养液时需并联多个滤器，费用和占地面积显着增加，所以深层过滤的试用范围限于100-2000L的中试规模的抗体纯化。切向流滤器在灌流反应器部分较为常用（见图3），其高切向的流速可减少细胞在膜表面的沉积，从而可以处理大体积细胞培养液而不造成膜的堵塞。切向流的流速越高，细胞沉积越少，但同时带来的剪切力越高，细胞破碎风险越大。细胞破碎形成的细胞碎片更容易阻塞滤芯，并且细胞破碎释放的胞内蛋白和核酸将大大增加后续纯化步骤的压力。切向流滤器的使用以中空纤维最为普遍，其表面积大，又可以在孔腔内形成高剪切力。中空纤维滤器的工艺放大可通过增加纤维数目完成，简单易行。在切向流过滤工艺开发和优化方面，需要考虑的包括滤芯化学成分、滤芯表面积、孔径、切向流流速、跨膜压力。切向流过滤存在死体积，可在过滤后期加人少量缓冲液，降低死体积中的抗体含量，减少抗体损失。切向流过滤处理量大，可用于超过10000L细胞培养的分离，达到每小时近5000L的液体处理量。其局限在于滤器费用较高，过滤时间较长，并且过滤速度的可控性低。连续流离心，尤其是采用碟片式离心机进行的连续流离心，是大规模抗体生产中主要采用的分离模式。碟片式离心机腔体为锥形，细胞培养收获液在靠近轴部加入，离心后上清液从轴部附近排出，细胞在离心力作用下，在锥形的底部边线附近聚集结块。腔体定期在细胞聚集处轻微开启，利用腔体内的压力将细胞排出。细胞排出夹带的液体损失可通过离心力（转速）、腔体开启频率和开启时间的优化，控制在5%以下。连续流离心能够去除绝大部分细胞和细胞碎片。残留的少量细胞碎片可用深层过滤去除。碟片式离心机的优点是体积小，多层碟片形成的沉降面积大，液体处理量大，操作简单、可靠，使用费用低。其缺点是前期设备投资髙，清洗较复杂，并缺少合适的小试模型。连续流离心机与沉降器一样利用细胞与培养基的密度差实现固液分离。图4显示的是一个商业化的碟片式连续流离心机。细胞培养液自离心机底部进料，在离心力的作用下，细胞在腔体的最外围富集。上下腔体周期性地短暂打开，释放清除腔体内积累的细胞，这部分细胞返回反应器。细胞培养液上清自离心机顶端收获。连续流离心分离速度快，液体处理量大，可实现高达3600L/d的灌流速度，细胞分离效果高于90%，有很好的应用前景。连续流离心机的弱点是设备和操作相对复杂，机械和操作故障风险相对较高。同时离心时形成的细胞团有可能造成局部营养缺失或副产物积累，其程度和影响需进一步考察。连续流离心机在操作时还需考虑细胞的剪切力耐受性，避免细胞损伤。

PCR是从转录水平上检测目的基因,而非蛋白，从转录到翻译还有复杂的过程，因此基因的表达量与蛋白的表达量不一定是正相关的。WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白，这点ELISA做不到，ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说你可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响。基因翻译蛋白质，PCR可以检测基因的表达量，绝对定量和相对定量。但基因翻译表达蛋白质是个复杂的过程，有可能出现基因量大而蛋白质少，或者相反，甚至其他情况。所以，PCR是从基因层面DNA或mRNA进行的检测， 而Western Blot是目前一种结合内参对蛋白质进行半定量的方法，Elisa可以定量检测某些蛋白、激素等。一、目的虽然两者都是通过抗原抗体反应对蛋白质进行检测，WB主要还是定性，Elisa可以定性，也可以定量。WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。二、模式WB是（抗原-抗体-二抗酶）模式进行检测；Elisa模式有多种，如（抗原-抗体-二抗酶）、（抗原-抗体-抗原酶）、（抗抗体-抗体-抗原酶）、（抗体-抗原-抗体酶）、（抗抗体-抗体-抗原-抗体酶）等等很多很多。三、抗体的适用性WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而Elisa不行。四、灵敏度一般Elisa的灵敏度要远高于WB，这从一般酶标记物的使用浓度或待检样品的稀释度上就可以看出。五、可操作性WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。Elisa一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。WB操作常见的非特异性条带，膜本底差，显色不好等等缺点在Elisa上表现得要好得多。六、商品化度WB不管怎样，都要自己先做电泳。而Elisa有很多成熟的商品化试剂盒了，只要不怕花钱，检测要方便快捷得多。

多抗是多个B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的多种抗体混合物，单抗是一个B细胞克隆产生的针对一种抗原表位的的单一抗体。对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多。例如，WB/IP/IF/ICC等，一般选择单抗。对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测，一般选择多抗。单克隆抗体优点特异性强背景噪音低几乎不存在交叉反应批次间差异小缺点制备周期长费用高难以识别与免疫原蛋白具有高度同源性的蛋白应用检测特定抗原免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫荧光实验检测分子构象或磷酸化状态的变化免疫治疗多克隆抗体优点由于识别多个表位，对抗原的亲和力更高稳定性好易于生产，价格便宜，时间短缺点存在批次间差异存在交叉反应背景噪音高应用检测具有高抗原同源性的抗原的亚型检测可能具有遗传多态性、糖基化或构象改变的靶点在具有不同PH和盐浓度的溶液中检测目标抗原

涂片及染色是微生物学的基本技术，也是观察细菌最简单且行之有效的方法。通常情况下，由于细菌个体较小，较透明或半透明，如未经染色往往不以观察识别。因此借助于染色法可以使细菌着色，与视野背景形成鲜明对比，从而易于在显微镜下进行观察。常见的染色方法包括简单染色、负染色、革兰氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、荚膜染色、死活染色。制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤，然后用显微镜甚至油镜观察。简单染色：不同细菌或者由于观察者所侧重观察的内容不同，所以使用的染料也有差异，但是简单染色的方法是一样的。先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上的菌膜区域，以覆盖菌膜为准。按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤。最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。负染色：制备观察图片是非常容易的，但是对初学者来说想要在玻片中找到目标菌还是有一定难度的，因为细菌常常无色透明且比较小，所以对初学者来说除非对光圈等进行很精细的调节，否则很难观察到目标菌，因此进行负染色就十分重要。该方法是将微生物与苯胺黑或者india墨水混合，再将混合物覆盖于载玻片表面，由于这两种天然黑色染料不能渗入微生物细胞，所以使得透明的微生物个体在黑色的背景下很容易观察。负染色法常见有两种操作方法。第一种发个方法比较常见，在一个载玻片上将微生物与异地苯胺黑混合，用另外的载玻片将混合物均匀的覆盖于原来的载玻片上。该方法的目的是使混合物在在玻片上一边厚一边薄，在厚与薄中间的额区域就是最佳观察区域。如图所示：第二种方法是用一接种环苯胺黑与微生物混合，用接种针在载玻片的中央将混合物延伸很小的区域。具体操作如图所示：革兰氏染色：革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不会脱去，有的可以被脱去，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为方便进一步观察，脱色后再用碱性蕃红进行复染，阳性菌仍为紫色，阴性菌染成红色，这就是革兰氏染色的原理。其步骤包括初染、媒染、脱色、复染四个步骤，主要步骤如图所示：芽孢染色法：部分细菌能产生内孢子，这些孢子能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。虽然芽孢在革兰氏染色片中可以看到，但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，便于观察。主要的芽孢染色法有孔雀绿染色法和石碳酸复红染色法。孔雀绿染色法的具体步骤：首先将生有芽孢的斜面菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液染色10min，然后用自来水冲洗，冲洗完后用0.5%蕃红液复染30s，用水洗，吸干，即可镜检，镜检时芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。石碳酸蕃红染色法具体步骤：首先按常规涂片，然后滴加石碳酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5min。带涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色指无红色染剂洗脱为止，接着彻底水洗，洗后用吕氏美蓝复染2-3min，水洗吸干后即可进行镜检，镜检时菌体计孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。鞭毛染色法：鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，超出了光学显微镜观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到。通过特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能在光学显微镜下观察到鞭毛。鞭毛染色一般分银盐法和复红沉淀法两种。这里介绍一下银盐沉淀法。用作鞭毛染色的载玻片必须是绝对干净无油脂的，将载玻片在火焰上快速灼烧5s，放在染色架上冷却，用蜡笔分成两个区域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL无菌水加入到幼龄生长活跃的斜面菌株中，慢慢震荡并旋转试管使菌株悬浮，尽量避免使用接种环，将悬液转移到干净的试管中，通过悬滴试验检查菌体的运动型，用无菌水将悬浮液稀释至略有浑浊为止，放入20-30℃培养箱中培养30min，然后移取一满环悬浮液加在已冷却的载玻片一端，倾斜载玻片让液滴流到蜡笔画的中心线，在空气中自然干燥。然后用媒染色剂媒染5min之后，慢慢用蒸馏水充分漂洗掉所有的媒染液，用热的Fontana银盐覆盖，染色5min，每隔1min更换一次染色液（Fontana银液在沸水浴中加热），细菌涂层的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水冲洗，自然晾干即可进行镜检。应当注意一点，染色法的燃料须当日配制，4h内使用，最好是现配现用。荚膜染色：一般细菌的荚膜与染色剂的亲和性低，但荚膜通透性高，因此染料可以透过荚膜使菌体着色。一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨。荚膜染色的步骤：加一滴6%葡萄糖水溶液在载玻片的一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养72h左右的胶质芽孢杆菌与其混合，加1滴墨汁充分混匀，用推片法制片将菌液铺成薄层，自然干燥，滴加1-2滴无水乙醇覆盖涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗一次，使用擦镜纸擦干后即可镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。具体操作过程见下图：死活染色：死活染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法，是利用死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的，常用的染色剂有台盼蓝和美蓝，前者使用范围较广，后者一般在酵母菌细胞死活鉴定上使用较多。以上介绍的染色法，基本上涵盖传统微生物实验室能用到的所有的染色法。染色法在细菌的观察、分类、鉴定中经常用到，因此是微生物检测人员不可或缺的基本技能之一。