慢病毒(Lentivirus)是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体,它可以感染分裂细胞和非分裂细胞,可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。此外,慢病毒具有嗜核性,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而可以在体内较长期表达。慢病毒的多种优点,使它成为基因传递的强大而有效的工具,获得了广泛的应用。因此,慢病毒成为了实验室的一大常客。在使用慢病毒的过程中,我们会遇到一些问题,比如细胞转染效率低,细胞状态差等等。为了在实验过程中更好地使用慢病毒,我们应该注意哪些问题呢?
慢病毒载体是经过处理的HIV,理论上对人体是无害的,但病毒仍然具有潜在的生物学危险,慢病毒相关实验需要在生物安全柜(BL-2级别)内进行操作。因此在进行操作的时候,我们要按照如下基础规范进行实验:
1、在进入实验室工作时,穿着实验服或隔离服,戴上手套和口罩;
2、操作病毒时请尽量使用生物安全柜,小心不要产生气雾或液体飞溅;
3、如果使用普通超净工作台操作病毒,请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机(由于超净台风向外排,有可能将病毒吹向操作者),并尽快操作;尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间,封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后,再打开超净台风机;
4、如果操作时台面有病毒污染,请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去;
5、如需离心,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后离心;
6、实验结束,脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂洗手。
慢病毒的储存与稀释
1、病毒长期储存于-80℃冰箱,-20℃保存不要超过1周,4℃保存不要超过3天;
2、病毒的运输采用干冰,收到病毒液后若几天内用于实验,可于4℃保存(于3天内用完)。若短时间内不用,收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融,否则会降低病毒滴度;
3、一般病毒可在-80℃存放1年,但存放时间超过6个月后使用,需重新检测病毒滴度;
4、需要稀释病毒时,将病毒从-80℃冰箱中取出,置于冰上溶解,然后用PBS或培养基(不含血清)稀释到所需浓度后轻柔混匀,尽快使用;
慢病毒的使用
预实验摸索慢病毒的最佳MOI
每种细胞对慢病毒的敏感性不同,有些容易感染,有些不容易感染,不同慢病毒的荧光强度也有差异,所以进行慢病毒操作实验之前,首先要了解MOI的概念,MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指病毒感染细胞的比例。
选择合适的MOI值,病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高,相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞,比如293细胞MOI=1时,95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低,MOI值可能达到200-300。我们建议通过比较不同MOI(比如0、1、5、10、50、100等)感染细胞MOI值的摸索。
1、感染前一天,一般用24孔板接种2×10?个细胞,第二天病毒感染时的细胞汇合度达到40-50%左右;
2、MOI值的设置若有文献参考,可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值,举例:文献中某细胞系慢病毒MOI值为10,则设置MOI梯度为2.5,5,10,20,40等;若无文献参考可按10倍梯度稀释进行设置,每个梯度3次重复;
注:(1)每孔加病毒量(μL)=MOI*细胞数/滴度(TU/mL)*10?
一般第二天按照细胞数倍增计算;如果病毒滴度很高,每孔加病毒量过少,可进行稀释后再加;Polybrene(常用浓度为5-10μg/mL)是否添加根据细胞种类及具体实验决定;
3、第三天(加病毒后12h-24h左右),弃去含病毒就培养基,更换新鲜培养基继续培养;
4、第五天,观察荧光情况,并进行拍照,确定最适合MOI值;
5、对于生长缓慢代谢慢的细胞,可以适当延长病毒感染时间,根据细胞状态决定何时更换培养基,保持细胞的活性。
慢病毒感染目的细胞
1、通过感染预实验,确定细胞接种密度、最佳MOI等条件。正式实验前,调整并保持良好的细胞状态;
2、按实验需要将细胞铺板(qPCR检测用12孔板,WB检测用6孔板或更大面积的培养皿),细胞数以第2天密度约40-50%为宜,37℃ 培养过夜;
3、感染前,从-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化,用PBS稀释成所需浓度,用移液器吹打均匀;
4、感染前给细胞换液,然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液,轻轻摇匀,37℃培养过夜;
5、感染后根据细胞状态决定,更换新鲜的完全培养液,继续37℃培养。若病毒对细胞无毒性也可不换液。感染后48-72h观测荧光,拍照记录;
6、根据需要,或收细胞抽提RNA检测目的基因在mRNA水平的表达,或收细胞抽提蛋白检测目的蛋白的表达,或收细胞进行细胞功能检测;
7、在培养过程中,需要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒,则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜完全培养液。
慢病毒在使用过程中可能遇到的其他问题
如何使用慢病毒感染细胞?
使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类,因此首先要了解细胞的来源和背景。通常来讲首先要根据MOI和需要感染细胞量计算所需要的病毒量,然后将所需病毒液加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。
慢病毒染后为什么细胞中出现大量黑点,并影响细胞生长?
在排除细菌及真菌污染后,细胞中的黑点通常为细胞碎片,导致细胞破碎的原因有很多,但在慢病毒感染后,细胞破碎通常有两个原因:
a. 慢病毒使用量过多,或细胞数量过少;
b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖,故支原体污染被许多实验室所忽略。
但支原体易在病毒感染细胞后爆发,故会出现大量细胞碎片。建议在使用病毒制品时,应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染,以节约时间。
病毒感染目的细胞感染不上或效率低?
和以下几个因素有关:
1、病毒活性:解冻病毒一定要在冰上进行,尽量避免反复冻融, -80 ℃ 保存半年以上需要重新测滴度;
2、目的细胞:最好预实验测试过,看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞,如悬浮细胞,原代细胞等,或者动物实验适合用腺病毒或AAV;
3、MOI值:一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的,同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样,如果感染细胞所用的病毒量不够的话,感染效率肯定不好;需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。
4、感染时间:慢病毒一般在感染后24h换液,感染后换液太早会导致感染效率下降;感染后换液太晚,则对细胞的损伤太大,效率也不高。感染后48h开始观察荧光,由于慢病毒的表达时间较长,有的72h,120h才能看到荧光。
5、其他:是否加入 polybrene 以及荧光显微镜的使用等因素有关
要曝光很长时间才能观察到荧光?
要曝光很长时间才能观察到的荧光,说明荧光比较弱,可能的原因有:
1、显微镜汞灯使用时间长,这个可以通过对照排除,看是否有比较亮的对照,或者如果有其他比较亮的样品,证明不是汞灯的问题。
2、PH值低,看培养基是否发黄导致绿色荧光猝灭。
3、目的病毒光不亮,插入目的基因后的病毒荧光强度与对照相比弱一些,这个属于正常现象,增加曝光时间,看感染上的阳性细胞比例如何,看看目的和对照的荧光的差异,如果感染比例尚可,差异不是很大,用Puromycin筛选有大量细胞存活,则病毒也可以使用。
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