生化试剂常见问题的解决办法1 .样品信息样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定成果发生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测形式，并在成果核算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。2 .试剂空白试剂空白吸光度是反映试剂质量的目标。每种试剂都有必定的空白吸光度规模，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；有些试剂久置后变浑浊。这些状况均可使空白吸光度升高。往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，将就过试剂空白核对的“关”，其成果为如下状况：①线性规模变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量缺乏；试剂成份稳定性较差。② 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定成果有严峻系统误差。原因：试剂底物浓度缺乏。③低值偏高 现象：试剂空白的改变曲线（吸光度VS时刻）显着动摇。原因：试剂自身不稳定，自行分解；东西酶纯度不够，杂酶含量超限，导致干扰效果。3 .测定规模每种待测物都有一个可测定的浓度或活性规模，样品成果若超越此规模，分析仪将显示成果超越规模的提示。表明试剂现已变质，应更换合格试剂。4 .底物耗尽使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性十分高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超越某一吸光度改变规模，监测期的吸光度将偏离线性，使测定成果不可靠。5 .酶的预活化测定血清中的某些酶，如CK，离体（采血）后很简单失活。只有通过适当的还原效果才能重新激活。在AST，ALT采用IFCC推荐办法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的成果要高些。6 .校准与成果溯源性酶的校对：要满足在同一办法学、同一测定条件、与理论核算的FACTOR值差异不大，没有发现有显着影响因素，方可进行校对。

化学试剂是符合一定质量要求标准的纯度较高的化学物质，它是分析工作的物质基础。试剂的纯度对分析检验很重要，它会影响到结果的准确性，试剂的纯度达不到分析检验的要求就不能得到准确的分析结果。能否正确选择、使用化学试剂，将直接影响到分析实验的成败、准确度的高低及实验的成本，因此，仪器使用人员必须充分了解化学试剂的性质、类别、用途与使用方面的知识。根据质量标准及用途的不同，化学试剂可大体分为标准试剂、普通试剂、高纯度试剂与专用试剂四类。①标准试剂标准试剂是用于衡量其他物质化学量的标准物质，通常由大型试剂厂生产，并严格按照国家标准进行检验，其特点是主体成分含量高而且准确可靠。滴定分析用标准试剂，我国习惯称为基准试剂(PT)，分为C级(第一基准)与D级(工作基准)两个级别，主体成分体积分数分别为99.98~100.02%和99.95~100.05%，D级基准试剂是滴定分析中的标准物质，基准试剂规定采用浅绿色标签。②普通试剂普通试剂是实验室广泛使用的通用试剂，一般可分为三个级别：（1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度zui高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。（2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。（3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。（4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。③高纯试剂高纯试剂主体成分含量通常与优级纯试剂相当，但杂质含量很低，而且杂质检测项目比优级纯或基准试剂多1~2倍。高纯试剂主要用于微量分析中试样的分解及溶液的制备。④专用试剂专用试剂是一类具有专门用途的试剂。其主体成分含量高，杂质含量很低。它与高纯试剂的区别是：在特定的用途中干扰杂质成分只需控制在不致产生明显干扰的限度以下。专用试剂种类很多，如光谱纯试剂(SP)、色谱纯试剂(GC)、生物试剂(BR)等。各种试剂要根据检验项目的要求和检验方法的规定，合理、正确的选择使用，不要盲目的追求纯度高。例如：配制铬酸洗液时，仅需工业用的K2CrO7和工业H2SO4即可，若用AR级的K2CrO7，必定造成浪费。食品检验使用分析纯试剂(AR)。对于滴定分析常用的标准溶液，应采用分析纯试剂配制，再用D级基准试剂标定;对于酶试剂应根据其纯度、活力和保存的条件及有效期限正确地选择使用。

　　革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，属于复染法。这种染色法是由丹麦医生革兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难区别。经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。　　革兰氏染色液用水：培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，不使用离子交换器生产的去离子水。　　称量：称量时需用多功能的角匙，预防交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如有条件，尽量在湿度较低的房间称取培养基。　　复水：复水时不可用铜锅或铁锅，防止有离子渗入培养基中，影响微生物的生长；容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基。　　为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基使用沸水浴进行加热。烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。　　灭菌：通常培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌，预防微生物生长繁殖而耗费养分，改变培养基的酸碱度。　　高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。　　pH测定：细菌必须在适宜的pH范围内能够正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH 值，即培养基使用前的pH，并应在25℃温度下选用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。应用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/L Na0H或 lmol/L HCL调整，留意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。　　配置好的培养基保存：灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，导致过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。所配制的培养基的量，应该是在最长保存期限内正好使用完。含染料的培养基应闭光保存；倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完，应当冷藏保存，如果保存时间超过2天，应将其放入密封的塑料袋中保存。

一、物理性状的质量控制应包括20℃ -25 ℃时的pH,并应观察以下内容：加入培养基的量和(或)琼脂层的厚度、颜色、透明度、是否存在肉眼可见的杂质、凝胶稳定性/黏稠度(一致性)、湿度。灭菌前后都应测定pH,采用连接可渗透陶器型液体接头的电极测定液体培养基的pH，固体培养基可用平头电极或者连接微型探头的电极测定pH,测量时尽量使培养基温度降到20℃-25 ℃，校正通常用接近40 g/L的氢氧-化钠或者1 mol/L的盐酸。二、微生物的质量控制1.污染检测在每批制备好的培养基中应当选取部分样品进行污染测试。2.质控菌株质控菌种应具有稳定特性，能代表其种并能有效地证明实验室特定培养基的最佳性能。测试菌种应可溯源至国家或国际公认的菌种收藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌种，但必须对照标准菌株进行鉴定。实验室应检测和记录储存菌株(stock culture)的相关特性，新复苏的菌种可能会有非特异性反应。最好使用从食品中分离的菌种。培养基的质控菌种应具备以下性能：具典型反应的强阳性菌种；弱生长的阳性菌种(选择更敏感的菌种);无生化反应的菌种；完全抑制菌种。3.质控方法国际食品微生物委员会和培养基菌种卫生工作组(WPCM)介绍了培养基评估用测试菌种的有效收集方法。(1)即用培养基和试剂商品化即用培养基的生产厂家如果经过IS0 9001和ISO 9002体系认证或满足相应质量要求，应向使用方提供资质证明。这时，使用者就不必对培养基进行大量的测试工作，但必须保证其储存条件。(2)采用商品化合成脱水培养基制备的培养基按ISO/TS 11133-1: 2009 《食品和动物饲料的微生物学 培养基制备和生产指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则》的要求，除了对每批制备好的培养基用标准菌株进行测试外，还应用实际样品进行检测，以更好地保证培养基的质量。对于不含指示剂或选择剂的培养基，只需用阳性测试菌种进行测试。对于含有指示剂或选择剂的培养基，必须使用能证明其指示或选择作用的菌种进行试验。对于复合培养基，即需要加入添加成分的培养基，要用具备上述性能的菌种逐批进行检验。对实验室制备的需加入添加成分的制成培养基同样适用。(3)按照培养基配方制备的培养基建议除了按照上述方法进行培养基品质测试外，还要用改良的Miles-Misra技术、螺旋平板技术或菌落总数技术进行测试，以监控基础材料的质量、培养基性能和实验室内部的配制规范。实际上，食品中包含有应激反应的微生物，还应考虑到培养基在应激细菌恢复方面的适用性。三、培养基性能测试方法实验室可采用半定量和定量技术对固体、液体培养基的性能进行测试，在多数情况下能满足对培养基性能测试的要求。对于特殊情况，如评价一种新的培养基或一个新的生产商的产品等，应采用定量测试法。1.固体培养基应用于固体培养基质控程序的技术大都依靠菌落计数。主要应用的技术有：倾注法、涂布法、旋转涂布法、改良的Miles-Misra方法、半定量划线法和定性划线法。这些方法作为食品实验室的日常方法得到了国/际公认。由于倾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中经常使用，这里不再介绍，着重介绍一下改良的Miles -Misra方法、半定量划线法和定性划线法。(1)改良的Miles-Misra方法改良的Miles-Misra方法是通过测试培养基的生长率(productivity ratio, PR)来检查培养基的性能，通常与对照培养基相比。对照培养基应当是富含营养物质的培养基，如：胰酪胨大豆琼脂。该方法步骤如下：①将试验菌株的过夜培养物用缓冲蛋白胨水10倍梯度稀释。②将试验和对照培养基做成4 mm厚的平板，并使平板表面干燥。③从最高稀释度(如10-5)开始，分别滴1滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域。④每个稀释度各取4滴分别加入4个试验和对照培养基，每1滴的涂布超过四分之一平板，并用涂布器从高稀释度开始涂布， 37 ℃培养18h。⑤对数量和菌落形态进行评价。评价方法，即按下列方式计算：PR=Ns/No式中：PR--生长率；Ns-试验培养基的菌落数；No-对照培养基的菌落数。示例：在10-3稀释度，试验培养基上为20个菌落，对照培养基上为25个菌落，则PR=0.80。(2)半定量划线法使用本方法时，所有测试培养基应干燥到相同程度，且整个步骤应标注化，以便于比较同批次培养基的测试结果。用1 uL接种环划线平板。在A区用接种环按0.5 cm的间隔划4条平行线，按同样的方法：B区和C区划线，最后在D区内划一条线。按标准方法所规定的培养时间和温度进行培养。通常情况下用同一接种环对A区~D区进行划线，在不同区域划线时不需对接种环灭菌。但为了得到低生长指数G1, ,在A区和B区接种应更换接种环或对其进行灭菌。评价方法：培养后，评估菌落的形状、大小和密度，并计算生长指数G1。每条有菌落生长的划线记作1分，每个培养皿上最多为16分。如果仅一半的线有菌落生长，记作0.5分。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线一半，则记作0分。记录每个平板的得分总和便得到G1。例如：菌落在A区和B区全部生长，而在C区有一半线生长，则G1为10。目标菌的生长指数G1大于6时，则判定培养基可接受。非选择性培养基的G1值通常更高。目标菌应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制。(3)定性划线法该方法只是定性测试，划线培养后，按照要求进行打分，得分是指示性的，可用作固体培养基性能测试的补充。取1uL测试菌株培养物在测试培养基表面划平行直线，可同时在一个平板上接种多个菌株，但划线不能交叉，然后按标准方法中的培养时间和温度进行培养。评价方法：培养后按以下方法进行平板生长评估： 0表示无生长， 1表示生长， 2表示良好生长。目标菌得分应为2,并且有典型的菌落外观、大小和形态。非目标菌的生长应该部分或全部被抑制。2.液体培养基为确定液体培养基的生长率，应接种适当的培养物。下面介绍的是用定量、半定量和定性方法评估生长率和选择性的方法。所推荐的这些方法都是通过将液体培养基以倾注或划线方式接种到琼脂平板上培养后，计数或计算液体培养基分数而得出其生长数量的。对于液体培养基定性测试方法，则通过肉眼观察来实现。目标菌和非目标菌的定量稀释法步骤如下：选择液体培养基10 mL/管待检。接种目标菌：将少量测试菌株培养物(每管10 CFU~100 CFU)接种测试肉汤和标准肉汤，混匀。接种非目标菌：将大量测试菌株培养物(每管大于1000 CFU)接种测试肉汤和标准肉汤，混匀。接种目标菌和非目标菌的混合培养物：用少量目标菌(每管10 CFU ~100 CFU)测试肉汤和标准肉汤。同时每管接种大量非目标菌(每管大于1000 CFU),混匀。稀释剂和运输培养基中目标菌和非目标菌的接种：接种测试菌于稀释剂中(每管100 CFU~ 1000 CFU),混匀。按标准方法中的培养时间和温度进行培养。结果的计算和解释：(1)计算目标和非目标微生物的菌落数，用生长率(PR)和选择因子(SF)进行结果的解释。目标微生物的PR不应小于0.1 (因生长的不同不能超过1个数值)，非目标微生物的SF至少应达到2。SF的计算见式 :SF=Do-Ds式中：Do-在参考培养基上能生长至少10个菌落的最高稀释度；Ds-在测试培养基上显示相应生长的最高稀释度；SF、Do和Ds用Ig表示。例如：Do=lg104=4.0, Ds=lg103=3.0,选择因子SF=1.0。混合菌株中， 目标菌的生长不应受到非目标菌的抑制，即目标菌始终应为优势菌群。(2)在混合菌株中目标菌数量的最低值及非目标菌数量的最高值应符合以下要求：目标菌的最低浓度应达到10CFU/mL ~10CFU/mL;在选择性肉汤培养物中非目标菌的最高浓度不应超过104 CFU/mL.(3)稀释和运输培养基不应引起目标菌和非目标菌数量的减少或增加。菌株在这些培养基中培养后的数量变化应在最初计数的±50%的范围内。

［原理］在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。激活后的酶溶液再进一步分离纯化。［试剂和器材］1、试剂（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液（2）10%（体积分数）乙酸（3）2mol/L硫酸（4）固体硫酸铵（5）无水CaCl2（6）结晶胰蛋白酶（7）25%乙醇溶液(含 0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)（8）95%（体积分数）乙醇（9）5mol/Ｌ NaOH（10）丙/酮2、器材（1）胰脏（2）组织捣碎机（3）离心机（4）磁力搅拌器（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等［方法和步骤］方法一1、 胰蛋白酶原的提取取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。浆液倒入500mL烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4层纱布过滤。合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h（pH始终保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达 0.75饱和度（每升滤液加492g，5℃）。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。2、 胰蛋白酶原的激活将胰蛋白酶原粗品称重（湿重），分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）。用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）。取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。一般比活可达到3 500～4 000 BAEE单位/mg。留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至 2.5～3.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4℃保存备用。方法二称取冷冻猪胰脏100g，在2～5℃下解冻，切成小块，用组织捣碎机中绞碎成胰浆，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加 0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2），捣碎机中捣碎1min。胰浆倒入500mL烧杯中，间隙搅拌，温度20℃左右，活化5～6h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。活化反应结束后，胰浆 3 500 r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布过滤。滤液置250mL烧杯中，以过滤清液的体积为准，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。放置 6h后，3 500 r/min离心20min，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤，再用丙酮洗涤，过滤。最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。在上述离心上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55% 硫酸铵饱和度，放置 6h后，3 500 r/min离心30min，取离心沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。

不规则抗体是指抗-A、抗-B以外的其他血型抗体。目前不规则抗体的筛查方法是采用瑞士达亚美的标准系列红细胞检测被检者的血清中的不规则抗体。　　人的血型抗体有IgG和IgM两类。现在所知ABO血型系统的抗-A，抗-B是IgM型，其它血型系统的抗体都是IgG型。IgM型抗体在盐水介质中能与含相应抗原的红细胞发生肉眼可见的凝结（传统ABO血型鉴定）；而IgG型抗体在盐水介质中只能使相应抗原的红细胞致敏，不能使红细胞凝结。IgG型抗体与相应的红细胞反应必须借助酶学试验或抗人球蛋白试验才能发生肉眼可见的凝结。也就是说传统的盐水血型鉴定和交叉配血试验只对ABO血型系统有效，而对其它多种血型系统无效。　　由于其它血型系统的不规则抗体会导致输血反应：轻者引起寒战、发热，影响治疗效果；重者破坏输入的不配合的红细胞或缩短其寿命，产生溶血性输血反应，危机病人生命；此外，对孕妇而言，不规则抗体会引起新生儿溶血病，影响新生儿脏器的发育，并使其智力发育受到伤害，严重者则会危及新生儿的生命安全。因此，抗筛选是很必要而且必须的。其筛选的意义主要在于三个方面：　　一、献血者的血清或血浆进行抗体筛查，可以防止含有不规则抗体的血液输注给病人，避免由于献血者血液中的不规则抗体引起病人红细胞的破坏而引起的溶血性输血反应，同时可以减少血液浪费，可将有不规则抗体的血液制备成抗体血清，用于稀有血型的检测。　　二、对需要输血治疗的患者，进行不规则抗体筛查，可以有肋于血液选择，从而有充分的时间来选择不含有针对某抗体的响应抗原的血液，从而防止因为输注含有某抗体相应抗原的血液而引起溶血性输血反应，保证输血安全。　　三、孕妇进行不规则抗体筛查，可以尽早发现不规则抗体，可以在孕期进行新生儿溶血病的预防和治疗，减少不规则抗体对胎儿或新生儿带来的伤害，减轻新生儿溶血病的性病程度，提高胎儿或新生儿的身体素质。　　美国、日本、澳大利亚等国家和我国的香港地区均已将不规则抗体筛查列入常规检测，而我国卫生行政部门目前尚未要求对献血者和受血者进行抗体筛查，在临床也只有少数医院对患者进行抗体筛查。我国目前大多数临床医院输血科（或血库）的配血水平比较落后，一直沿用室温盐水方法配血，此方法只能检出不配合的IgM类抗体，不能检出不配合的IgG抗体，而ABO血型系统以外的其他血型系统的绝大多数抗体是IgG性质的抗体，因此，含有不规则抗体（抗-A、抗-B或抗-AB以外的其他抗体，如抗-D）的血液给病人输用后，此不规则抗体会引起急或迟发性输血反应，往往给病人生命带来危险。为提高血液质量，保证输血患者的输血安全，提高输血治疗效果，避免患者输用含有不规则抗体引起的输血反应，使我国输血事业与世界接轨，应该对献血者或输血者进行不规则抗体筛选。　　以下血型鉴定卡是美国等国家常用卡，前两孔是ABO血型鉴定，第三孔是Rh血型鉴定，后面三孔是抗体筛查孔。也就是说每个人的血型鉴定是和抗体筛查一起做的。　　抗体筛查的操作也较为简单：选择达亚美的抗人球卡（合血卡）；三管中分别加入抗体筛查Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号细胞各50?l； 三管中均加入25ul待检样本血浆或血清；37℃孵育15分钟；专用离心机离心后判断结果。　　这里要强调的是，37℃孵育15分钟是必要的。因37℃才能反映临床意义的活性抗体，即体内抗原抗体反应的真实体现，并能排除冷凝集、缗钱状凝集等非特异凝集的干扰。　　附：美国输血技术指南（American Association ofBlood Banks，aaBB）的相关摘要：　　受血者检查：　　F3．300不规则抗体筛查检验单与要求输血的申请单一起送来，每一份血样应在作交叉配血前或同时检测不规则抗体。检测血清或血浆中不规则抗体的方法，应能显示37℃活性的临床意义抗体，并要求有一项为抗球蛋白测试。　　I4．000 受血者血液的检测　　每份血样都包含了同时采集的一个或多个试管血样，并附输全血或红细胞成份的申请单一起提交上来。这些血样都必须检测ABO血型、RH血型和针对红细胞抗原的不规则抗体。　　I4．010 当检测出来不规则抗体时，应用其它检测方法来确认其临床意义。　　献血员检查：　　B5．400用于检测不规则抗体的测试。　　B5．410对以前有输血或妊娠史的献血员的血清或血浆，应在交叉配血前检测不规则抗体。　　B5．420用于检测不规则抗体的方法，应能检查出37℃活性抗体。对于含有这些抗体的血液，应将其分离处理为仅含最少量血浆的成份血。　　I4．300红细胞抗原的不规则抗体　　检测方法应能显示红细胞抗原的临床意义抗体。应在用试剂红细胞进行抗球蛋白的测试前，进行37℃温育。如果有记录证实有同等的敏感性，也可用其它测试方法代替。　　I4．310在以前已鉴定有临床意义抗体的患者中，如有新抗体的临床或血清学证据，应进行抗体鉴定。　　I4．320解释为“阴性”的每一抗球蛋白测试，都应采用IgG致敏的红细胞质控系统。　　I4．321当采用FDA批准的检测系统，而该系统又不允许将IgG致敏红细胞加入解释为“阴性”的抗球蛋白测试中时，应根据厂家的说明采用相应的质控系统。　　I5．000交叉配血　　除非紧急用血，在给受血者输入全血和红细胞成份之前，一定要将受血者的血清或血浆与献血员的红细胞进行交叉配血。交叉配血应采用能显示ABO不相容性及红细胞抗原的临床意义抗体的方法，且应包括I4．300中所描述的一项抗球蛋白测试。　　I5．100可以用不同于I4．300的检测方法来作交叉配血。　　I5．200如果在I4．300测试中未检测出有临床意义的抗体，而以前又无检测到这些抗体的记录，那么仅需检测ABO相容性即可。

免疫学检测即根据抗原、抗体反应的原理,利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答,在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增,并分泌特异性的免疫球蛋白(抗体)。由于抗体-抗原的结合具有特异性和专一性的特点,这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白(抗原或抗体)。免疫学检测技术的用途非常广泛,它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散,通过观察抗原-抗体相遇时产生的沉淀反应,检测抗原或抗体,最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散,例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验。(1)单向免疫扩散试验(single immunodiffusion test):就是在凝胶中混入抗体,制成含有抗体的凝胶板,将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内,让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散,当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物,出现以小孔为中心的圆形沉淀圈,沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。(2)双向免疫扩散试验(double immunodiffusion test):一种分析鉴定抗原、抗体纯度和抗原特异性的试验。即抗原和抗体分子在凝胶板上扩散,二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线。利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性,可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散。例如:免疫电泳试验和双向凝胶电泳。

实验概要：本实验通过摇瓶培养和发酵罐培养分别小量和大量诱导菌种表达，获得了目的蛋白的粗提物，通过Amylose亲和层析获得纯化蛋白。主要试剂：LB培养基，2-YT培养基，诱导剂IPTG，5N氢氧化钠，2N盐酸，葡萄糖主要设备：恒温振荡器，离心机，发酵罐实验材料：重组菌实验步骤1. 摇瓶培养  1) 取出4℃下平板保藏的菌种，挑取单菌落，接种于5ml LB培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中，37℃,300r/min,恒温振荡培养,过夜活化;  2) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含100m1 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的500mI摇瓶中，37℃, 300 r/min,恒温振荡培养，作为2L摇瓶培养的菌种。  3) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含400m1 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的2L的摇瓶中，37℃, 300 r/min,恒温振荡培养。起始诱导时机为菌体OD600=4，诱导剂IPTG (IPTG贮液:浓度为20%, 0.22um膜过滤除菌，分装后-20℃冻存。)浓度为0.03 mmol/L，诱导表达的时间控制在4h左右。 2. 5L发酵罐培养  1) 取出4℃下平板保藏的菌种，挑取单菌落，接种于5ml LB培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中，37℃, 300 r/min,恒温振荡培养。过夜活化;  2) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含100ml 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的500mI摇瓶中，37℃, 300r/min,恒温振荡培养，作为5L发酵罐的菌种。在基因工程菌株5L高密度发酵过程中，温度由系统自动控制在37℃，通过自动流加5N氢氧化钠和2N的盐酸使pH保持在7左右，葡萄糖的流加采用恒速流加，即培养5h后开时流加补料，以0.042g. (L. min)-1葡萄糖的的速率进行补料。发酵的IPTG诱导时机均为OD600约为3时进行诱导，IPTG的浓度为0.1 mg/ml。3. 目的蛋白粗提物的获得 1) 试剂配制  CB(Column Buffer)缓冲液:  Tris-HCl    20mmol/L(pH 7.4)  NaCI    200mmol/L  ED TA    1 mmol/L  PH    7.4称11.7g NaCI, 0.37g EDTA,取20ml Tris-HCl，用NaOH调至PH7.4，加超纯水至1L，用0.22um滤膜滤菌。  2) 提取方法发酵液以8 000r/min离心30min收集菌体。菌体收集后用无菌水洗二遍，以洗去表面残留的培养基。按1:10的比例(W/V)把菌体悬浮在CB溶液中，超声波破碎细胞，功率40W，每破碎l0s后间隔2s，每5min取样，用Bradford法测定可溶性蛋白总量，确定最佳破碎时间。破碎过程中保持低温(0℃)，完全破碎后于4℃以10 000 r/min离心30min，上清液用于上柱纯化。 4. Amylose亲和层析  1) 试剂配制    a. CB(Column Buffer)缓冲液同上    b. CB加麦芽糖(10mmol/L ):称取3.6g麦芽糖，用CB配成1L溶液，用0.22um滤膜滤菌;    c. 0.1%SDS:称1g SDS，加超纯水至1L，用0.22um滤膜滤菌。  2) 层析步骤    a.柱子的清洗:先用20%酒精润洗柱子2次，装柱;    b.柱子的平衡:新柱料用5倍体积的CB洗柱，再生柱料用3倍体积的CB平衡，流速为2m1/min;    c. 上样:流速为0.5ml/min;    d. 洗杂:用CB洗柱至流出液的A值与空白(即CB)相同，流速为2ml/min;    e. 洗脱:用CB加麦芽糖洗脱，流速为0.5ml/min，分步收集产品进行SDS-PAGE分析，确定最佳洗脱条件;将接下的样品取一小样，留做检；    f. 柱料的再生:依次用3倍柱体积的无菌水、3倍柱体积的0.lmmol/L SDS溶液、1倍柱体积的无菌水洗柱，各步均须洗至基线;再用3倍柱体积的CB平衡柱料;    g. 纯化后样品，用去离子水透析脱盐或Sephadex G-25脱盐柱脱盐，经低温真空离心浓缩机抽干成粉状，低温干燥保存。

　　冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。生物菌种冻干保存步骤，其操作流程如下：　　1、安瓿管准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。　　2、保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。　　3、冻干样品的准备　　在适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行))，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。　　4、预冻　　一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。　　5、冷冻干燥　　采用冻干机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。　　终止干燥时间应根据下列情况判断：　　安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；　　真空度接近空载时的最-高值；　　样品温度与管外温度接近；　　选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结；　　选用一个安瓿管，装1-2%氯-化钴，如变深兰色，可视为干燥完结；　　冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。　　6、真空封口及真空检验　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。　　7、保藏　　安瓿管应低温避光保藏。　　8、质量检查　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

　　国家卫健委网站3月11日消息，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组印发通知，决定在核酸检测基础上，增加抗原检测作为补充，并组织制定了《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》。　　到底什么是抗原检测？与核酸检测有何区别？为何国家要采取抗原检测作为补充？　　上海新冠肺炎临床救治专家组组长、复旦大学附属华山医院感染科主任张文宏在接受媒体采访时指出，抗原就像是病毒外面穿的“衣服”，核酸就是病毒里面的基因。　　这两个检测略有不同，抗原的检测方法，是从抗体出发去测衣服，综合特异性之后，就可以让病毒显示出来；而核酸检测更为复杂，需要通过扩增来完成，因为有了扩增的环节，核酸检测的敏感性会更高，但相应的获得结果需要的时间就更长。　　张文宏表示，在我们中国抗疫的第一阶段，我们通过核酸检测快速战斗实现“清零”，但最近大家也发现了，奥密克戎变异株出来后，整体上病毒传播速度在加快，不仅仅在上海，包括全国其他地方，不同地区出现比较多的病人，而且在短时间内病毒传播的速度很快。　　“这时候我们就会发现，检测速度如果仅仅依靠核酸，就会有一定困难。”张文宏说，因为核酸需要借用机器，而且采样的要求、机器的扩增都有非常专业的一套体系，如果这个地方采样不便或没有合适的条件来做扩增，有没有更简单的方法？　　他表示，就像在家用验孕棒检测是否怀孕一样，抗原检测能居家进行检测，而且速度很快，在条件比较差的医院也能检测，费用也比较低。　　为何这种检测办法那么好，但以前大家都用核酸检测呢？张文宏解释说，任何事情都有它的两面性，抗原检测因为没有扩增，敏感性要略微低一点，但一旦检测出阳性，就会具有很强的价值。此次香港抗疫中就采取了抗原检测，参与抗疫的机构也都认可这种检测方式，通过抗原检测能直接来申报是否感染新冠，进而采取一系列措施。　　张文宏进一步表示，未来，我们如果要面对更大规模的国际开放以后带来的输入性病例，始终要把这一病毒控制到非常低的传播水平，也就是我们跟病毒在比时间，病例发现得越早，传播得越少，我们隔离的速度越快，那我们最终就可以用更快的速度实现社会面的“清零”。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。接下来的 Protocol 中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。一. 试剂准备Wash Buffer：PBS+1% FBS破膜剂（ICS）：用双蒸水配置 10 % Saponin（Sigma）。破膜固定剂：将配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀释 100 倍ICS Wash Buffer：将配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀释 100 倍。二. 细胞表面染色收集各组细胞，进行细胞计数，加入适量 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，去上清，加入 50 μl Wash Buffer 重悬。（可选）Live dead 染色，每管加 0.1 μL Zombie GreenTM Dye（样品多时使用时可先稀释），震荡混匀，室温避光孵育 10～15 min。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min，弃上清。封闭 Fc 受体：每管中加入 1 μg/106 细胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗体封闭荧光抗体 Fc 受体引起的非特异性染色。震荡混匀，4℃ 孵育 30 min（或室温避光 15 min）。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm，离心 5 min，弃上清。用适量体积 Wash Buffer 液重悬每个样本，将各组细胞等细胞数混合后分装到单染管和不染抗体管，作为流式检测时调节电压。单染管中加入相应表面染色抗体，同时在每个样本中加入 1 μL percp CD3/106 细胞和 0.5 μL PE CD4/106 细胞，震荡混匀，4℃ 避光孵育 30 min（或室温避光 15 min）。用 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，弃上清。打孔或者加入 200 μL 1% PFA（多聚甲醛）固定过夜。三. 胞内染色将全部管细胞固定打孔。每管加入 150 μL 固定破膜剂，震荡混匀，4℃ 避光孵育 20 min。ICS Wash Buffer 液洗涤，用法同 Wash Buffer 液。在相应的需要进行胞内染色的样本中加入适当量胞内染色抗体（如 APC IFN-γ抗体），4℃ 孵育 30 min 或室温避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min。弃离心上清液，根据实际情况加入 200 μL 或者 300 μL Wash Buffer 液重悬。震荡混匀，流式上机。四. 注意事项每一步离心倒掉上清时可以先在实验台上铺几层平板纸，倾倒上清后可吸掉管口的液体。为了避免打孔剂对细胞形态的影响从而影响后续圈门影响实验结果，所以不管是否需要胞内染色，每个样本都需要打孔。染色时抗体的加入量可根据实际情况调整，为避免抗体浓度对染色的影响，样品染色体系不得大于 100 μL。为减少染色时加样的误差，可配置表面染色抗体稀释液，双染或多色染色可把多种抗体稀释到一管中。按 10 μL 或 5 μL 体系，用 Wash Buffer 液稀释。为了避免游离抗体的结合出现假阳性，可洗涤两次。检测的细胞量不能过少也不能过多，细胞太少检测时样本流量会增大影响变异系数，细胞过多，可能会导致抗体或染料相对不足，影响实验结果。

1、概念（1）细胞焦亡（Pyroptosis）细胞焦亡是一种炎症程序性细胞死亡，由各种病理刺激引发，如中风、心脏病发作、癌症、微生物感染等。其它已知类型的程序性细胞死亡包括凋亡和坏死。研究发现，细胞焦亡依赖于caspase-1，这从根本上将细胞焦亡与其它细胞死亡途径区分开来。由于caspase-1是细胞焦亡途径中的主要效应蛋白酶，因此caspase-1的活化是细胞发生焦亡的重要指标。细菌的多糖结构也会刺激caspase-4活化，发生细胞焦亡。（2）细胞凋亡（apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。2、异同点相同点：都是程序性细胞死亡过程不同点：     细胞凋亡：内源性途径（又称线粒体途径）基于caspase9细胞焦亡：经典通路：基于caspase1 非经典通路：基于caspase4，5，11细胞凋亡的检测指标：早期凋亡检测指标：Annexin V、JC-1中期凋亡检测指标：Caspase晚期凋亡检测指标：TUNEL

为了做实验，细胞铺匀是常见的一种。然而，有许多人不是很成功，分布也不均匀:要么中间密集，周围稀疏，要么周围密集，中间秃顶。以下是利用96孔板把细胞铺匀，希望对大家有用!　　方法/步骤　　1、通常，在96孔板的每个孔中加入100微升细胞悬浮液。 从底部附近的井的左侧添加细胞悬浮液。 加入一半平板后，混合细胞悬液，不要再加入，继续加入剩余的一半平板。 添加完所有板后，盖上板，用左手轻轻握住板的左侧，用右手轻轻轻敲板的右边缘，注意抓力(我通常轻敲三次)。 如果它太强或太多次，细胞就会被浓缩和堆积。 顺时针旋转盘子(逆时针效果不好)，依次敲击剩余的三面，静置约5分钟，放入37度培养箱中。　　对于6孔板、12孔板或24孔板，我在第一个孔中加入少量无血清培养基，摇动并渗透到整个孔的底部，然后用移液管枪将整个孔的底部吸到第二个孔中。用同样的方法渗透到井底，同时模拟其它井，这样整个井底都是湿的，细胞悬浮液将平放在整个井底。 加入细胞悬液时，可以避免中间加入更多细胞，中间加入更少细胞的现象，细胞分散更均匀。 注意，加入细胞悬液后，细胞悬液应放在工作台上静置。这个方法有点慢，但是当你熟练的时候它并不慢。也可以涂抹，但强度不如96孔板，效果不如96孔板，所以我放弃了渗透井底的方法。　　2、加入细胞悬液后，抬起细胞培养板，从底部向上观察光线，看细胞是否聚集。然后从底部敲击以分散它。　　3、如果实验室有平板振荡器，建议用这个仪器轻微振荡。 效果好，即振幅小、频率高。　　4、细胞应该尽可能分散，大多数细胞处于单一状态。离心后，完全悬浮!有转移到六孔板上的，就是震动!摇晃时，不要让细胞液转向，否则细胞会全部被带到中间而不均匀!　　5、当一瓶细胞装满后，进行正常处理。 将它均匀地吹进培养瓶中，然后铺上6孔板，每孔2ml。 涂抹后，不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放入培养箱中。 稍微向左三圈，向右三圈，先三圈，然后三圈。基本上，24小时后，每个孔中的细胞将非常均匀。　　6、计算所有所需的液体和细胞数量，混合均匀，并将其添加到六孔板中。 六孔板呈水平8字形波动。 在显微镜下观察。 如果不均匀，按照上述方法再次摇动。如果细胞没有计数并直接种植，在种植六孔板的过程中随时摇动混合瓶。 我通常顺时针或逆时针转动瓶子。　　7、先上下移动，然后在水平板上左右移动，每个方向移动5-6次，但关键是摇动后直接放入培养箱，不要做太多的运动，如照镜子，否则很容易在中间再次聚在一起。

 　　区别一：定义不同　　原代细胞培养：原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。　　传代细胞培养：传代培养是指需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。　　区别二：特点不同　　原代细胞培养：与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。　　传代细胞培养：当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。　　区别三：生存率不同　　原代细胞培养：过程相对复杂，培养条件要求也更高。　　传代细胞培养：一般普通培养条件下都容易生存，传代细胞容易增殖。　　区别四：原理不同　　原代细胞培养：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。　　传代细胞培养：当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。 

 　　PCR扩增后一般进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后一般有以下几种条带：　　1、引物带。引物浓度过高或是扩增效率不是特别高时都会有，一般不呈现为细带，为发散状；如果目的扩增产物带和引物带都很亮，可以考虑适当降低引物量。　　2、引物二聚体带。比引物跑得慢一点，条带清晰，但如果扩增产物小于100bp时，产物与引物二聚体就不好分别了，建议采用DNA聚丙烯/酰胺电泳（不是蛋白质的SDS聚丙烯/酰胺电泳）；如果引物二聚体在优化复性温度后仍然严重影响目的产物的扩增，优先考虑更换引物设计（因为引物合成的成本比反复优化条件的成本低）　　3、目的扩增产物带。其大小与设计大小相同，条带清晰。　　4、非特异扩增产物带。其大小与设计大小不相同，条带清晰。一般考虑通过提高复性温度来减少或消除（也可用温度梯度功能来寻找zui佳的复性温度，东胜龙811型PCR仪就有此功能）。如果其片段大小比目的片段大较多，可以通过减少延伸时间来减少或消除（即不给它足够的延伸时间）。还有一种非特异扩增产物带是来自于逆转录PCR实验时的基因组DNA的污染，如果目的扩增产物中有内含子，扩增产物很可能大于目的基因。这种条带通过优化复性温度是不能消除的，可以在逆转录前用无RNA酶的DNA酶进行样本处理。　　5、模板DNA带。模板浓度过高时可能出现。如果是基因组DNA为模板，条带可能会很乱且较大。一般进行PCR扩增时，模板浓度都不要太大，否则会产生一些比目的基因长一点的杂质DNA（可能不成条带，也看不到），这是由PCR扩增原理造成的。　　那么我们该如何判断是否扩增成功呢？　　首先要点Marker的,对照Marker的条带,看你扩增出的条带的大小,是否跟你预计的条带大小一致,以此来判断你的PCR反应是否成功。 

　　一、基本知识和种类　　电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动，只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。　　电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素。1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂，价格昂贵难于普及。1940年左右，以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。　　电泳技术以支持物分，可分为：纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。　　各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；用高压电泳和层析结合研究核酸的一级结构。凝胶龟泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。　　二、影响电泳的因素　　不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。　　影响泳动度的主要因素有：　　1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状　　一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。　　2、电场强度　　电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特，则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。　　一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳，前者的电压在100-500伏特，电场强度一般是2-10伏特/厘米；后者电压可高达500-1000伏特，电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。　　3、溶液的pH值　　溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电泳速度越快；反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋 白β球蛋白>γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。同 时，为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。　　4、溶液的离子强度　　溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散，高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄细的电泳区带。离子强度很高时要用低电压，避免过多产热，这样又导致长的电泳时间，以致增加变性和区带分离困难。　　5、电渗作用　　在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在pH8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时，γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用 小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。

标准物质证书中有时会规定“一次性使用”，这些标准物质一般不稳定或具有较高的量值准确度，如安瓿瓶分装的国家一级溶液标准物质，在打开包装后量值易发生超出不确定度范围的变化，应按照要求尽快移取，不能留存后反复使用。可一次性制备成中间标准储备溶液保存、使用。对于可多次使用的有证标准物质，确保标准物质包装单元开封后的恰当保存和包装、证书的完整性非常重要，某些情况下，有必要根据证书要求，对剩余的物质进行重新密封包装。取样时应采取防止沾污的措施。如何做好标准物质使用环节中的维护常常是用户困惑的问题。国际通用计量学基本术语(VIM)中规定:测量标准的维护是为使测量标准的计量特性能保持在规定极限内所必需的一组操作。通常包括对预先规定的计量特性的周期验证或校准，在合适条件下的储存以及精心维护和使用。标准物质作为一种测量标准，也应进行定期的维护、核查，以确保其量值的可靠性。一般来讲，可分以下情况制定具体措施：(1)对于有证标准物质，只要按照标准物质证书上所规定的条件和方法保存，并在有效期内使用，量值是有保障的，这类标准物质的维护应简化为检查包装、标签及证书的完好性、有效期、保存条件等；如果是开封后可多次使用的有证标准物质，除上述检查外，实验室应制定相应的文件规范其后续使用和管理，定期核查其使用情况，必要时与另一未开封单元或批次的标准物质通过比对进行量值核验；(2)对于内部标准物质或实验室由有证标准物质制备的校准溶液等，由于没有充分的均匀性和稳定性数据，严格的量值核查是非常必要的，可采取的方式视实验室的经济和技术条件灵活掌握，如利用质量控制图进行趋势检查、通过上下批标准物质量值比对或实验室间比对验证量值的准确性等。此外核查的频次要根据标准物质的特点制定，稳定性预期良好的标准物质可相对放宽核查的时间间隔。

在选择、购买标准物质时，应考虑以下要素：（1）特性量的种类及定值方法：某些标准物质可能只适用某一特定方法或专属领域的应用，某些标准物质的值有特殊规定，如含结晶水的值，应对证书中该类说明加以注意，防止误选误用；（2）特性量水平：标准物质的特性量水平应与日常测量样品的水平匹配；（3）可接受的不确定度水平：标准物质特性量的相关不确定度水平应与日常测量中的精密度和正确度限度要求匹配；（4）基体及可能的干扰：标准物质用于开展方法确认、质量控制以及一些基体效应较为严重的测量方法的校准时，基体应与日常测量样品基体尽可能接近；（5）形式：标准物质可制备成不同的形式，如冻干与冰冻样品，制备方式的不同可能会导致相同特性在标准物质与真实样品中的行为差异，从而产生互换性问题，选购前应充分调研；（6）最小取样量：只要标准物质证书中规定了最小取样量，用于测量的取样量应不小于该最小取样量，因此选购时应考虑最小取样量是否能满足测量方法要求；（7）用量：标准物质的购买用量应足以满足整个实验计划中的应用，包括根据需要考虑的备样；（8）稳定性：选购前应确认所购买批次标准物质的有效期限，避免使用时发生过期的情况。

　　确定期间核查的标准物质　　根据实验室使用标准物质的具体情况和影响因素来确定期间核查的标准物质。标准物质在使用过程中影响稳定性和准确性的因素很多, 它受化学、物理和生物等因素的影响。　　溶液标准物质移入储备瓶后, 就受储备瓶、储存条件、标准物质本身的浓度和生物因素等的影响。储备瓶不洁净、标准物质会被污染变性。瓶塞不密封溶剂挥发, 标准物质浓度就会改变。有机标准物质储存时间长有时会受霉菌污染, 从而影响标准物质的稳定性和准确性。反复使用时操作不严谨吸管会带入污染物, 也会影响标准物质的稳定性和准确性。　　固体标准物质稳定性能好, 使用时间长, 保存条件和操作者的严谨性对保持标准物质稳定性和准确性起着重要的作用。保存环境的湿度大, 保存不当和操作者使用后不及时盖好瓶盖, 标准物质表面会吸潮、风化而变性。操作者使用的小药勺不清洁会带进污染物, 而影响标准物质的稳定性和准确性。　　期间核查时间间隔的确定　　期间核查时间间隔可根据实验室对标准物的使用频次和实验室储存条件来决定。有良好的实验环境和储存条件, 又有一整套规范的标准物质的管理程序和专人专柜保存, 期间核查测量间隔可适当延长。实验室首次使用的溶液标准物质, 期间核查时间间隔可以按先密后疏的原则安排。找出此标准物质期间核查的间隔点, 来确定核查间隔。　　固体标准物质的稳定性非常好, 有效期长。只要按要求保存, 一般期间核查时间间隔定在半年一次。但固体标准物质中一些不稳定的成分可根据情况缩短核查间隔时间。　　标准物质特征量值的核查方法　　在化学测量领域, 基准方法是一种具有最高计量特征的方法, 基准直接法测量未知样的值不需要用同量的标准作参照。经典且准确度较高的基准方法有:重量法、滴定法、库仑法、凝固点降低法以及同位素稀释质谱法等。最常用的是重量法和滴定法。这两种方法要求的设备简单, 而且一般化学分析人员均能掌握, 测量的不确定度一般能达到0.2%, 能够满足检测实验室的要求。凝固点降低法用作直接法测定材料的纯度 (物质的量的分数) , 同位素稀释质谱法广泛用于材料定值及其它高质量的测定。 

（一）DNA的凝胶电泳：凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段;操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高。2.聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA ，用于核苷酸多态性的分析。琼脂糖凝胶电泳的基本过程材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。基本过程：制胶→放入电泳槽中并加入电泳缓冲液→取出梳子→将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中→一定电压条件下电泳→合适的时间后停止电泳→取出凝胶进行溴化乙锭染色→凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套；不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围；影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：1、DNA分子的大小；2、构象；3、凝胶浓度；4、电压；5、缓冲液特殊的凝胶电泳1、倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分离分子量10～2000kb的DNA分子；2、钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可分离大于107bp的DNA分子。（二）RNA 电 泳基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。

微生物实验室如果从事致病菌检测、培养基质控验收、方法验证等相关工作，就应该备有质控菌株。实验室需对使用的质控菌株进行规范性管理，以便有效地、安全地使用，保证实验结果的准确性。首先、实验室应制定菌种管理制度内容包括菌种申购、保管、领用、使用、传代、存储等方面的内容，质控菌种申购应由专人申购，保管由专人双人双锁管理，领用及使用应填写记录，使用时应对菌种进行纯度及生化特性进行菌种核查验证并记录，存储应有专门的冰箱、超低温冰箱进行存储，使用完的菌株应按要求销毁处理。第二、实验室可根据需求购买相应的标准菌株或商业派生菌株作为质控菌株实验室用质控菌种一般来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准质控菌株，或与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。因此，需选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准质控菌株必须附带有供应商的菌种质量证明证、检测报告、说明书等，来证明所采购的标准质控菌株是合格的。收到菌种时应仔细阅读菌种证明，核实到货的菌种与申购的是否一致，包装是否完整，注意保存条件及有效期，并将菌种放置相应的条件下进行储存（一般在活化前储存于4℃冰箱中）。核实后及时填写菌种清单，菌种清单应包括菌种名称、菌种编号、到货日期、储存条件、购买数量、领用日期、领用人、销毁日期等。第三、实验室需对标准菌种活化、确认、传代保藏、使用、销毁进行记录。记录内容包括质控菌种名称、菌种编号、到货日期、菌种完整性、菌种活化日期、活化方法（主要包括活化使用的培养基及培养温度）、活化数量、确认方法结果、保藏条件，保存数量、领用人、传代日期、传代数量、菌种用途、销毁日期等。菌种确认是在活化后对菌株纯度、菌落形态（在选择培养基上的典型菌落）、生化特性（如氧化酶试验、三糖铁试验等）、表型分析（生化鉴定）进行核查并记录，以保证菌种使用的有效性。菌种保藏方法可依据标准SN/T2660-2010《食品微生物实验室菌种保藏方法》进行保存。建议实验室购买-80℃超低温冰箱，选择甘油保存法或瓷珠菌种保存管，瓷珠菌种保存管方法操作方便，保存时间较长。菌株使用过程中应在生物安全柜中进行，遵循无菌操作以防质控菌种污染。使用完的菌种应按生物安全要求，在121℃高压灭菌30min，并做好菌种销毁记录。

菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境。要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。对于不同的保存方式活化的方式也不同：1.定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；2.液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；3.沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；4.真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；5.-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养；6.液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一、配置菌种适宜生长的培养基。第二、将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻。第三、将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮。第四、挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落。经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的。

微生物EM（环境监测）检测中最常遇到的问题之一与培养策略和培养基的选择有关。使用一种培养基（TSA）或者两种培养基（TSA和SDA），使用单个温度、两个温度，是否从低温到高温，还是高温到低温。影响微生物回收率的因素有：结果观察时间(单一温度通常比两个温度早)、成本(只用TSA比使用TSA+SDA便宜)以及微生物回收率的高低。很少有研究报告回收率相关的培养条件选择，但是，已有报告单一温度条件30-35℃培养对于霉菌回收的不如两个温度培养的好。下面的数据总结了在我们实验室进行的一项小研究。采用标准TSA LP80培养基、分别使用30-35℃@5天、25-30℃@5天、20-25℃@72小时+30-35℃@48小时3种方案进行评价。以SDA培养基20-25℃@5天条件为对照，对霉菌的回收情况进行评价。这些样本是从生产车间入口附近的非受控区域采集的，以确保足够高的计数以获得合适的数据大小。在每个地点取3个表面接触皿和1个浮游菌(1立方SAS180)，每天取12个点。每个点取3组重复样本，每个培养温度测试1组样品。实验2中还收集了SDA样本。样本分别在12月至1月，以及9个月后的8月至9月采集，以覆盖季节变化。培养后对每组样品进行计数，以确定菌落计数。在实验2中，三位分析员还计算了每个组的霉菌菌落数，并计算了每个样本的平均值。图1、在试验1的3天内，在每种培养策略下检测到的细菌菌落总数图2、在试验2的8月至9月的3天内，在每种培养策略下检测到的细菌菌落总数总的来说，25-30℃的单一温度日变化最小，可能比其他2种方法回收了更多的菌落。这种类型的测试存在相当大的差异，因此需要研究更大的面以获得更可靠的数据集。霉菌检测在整个试验过程中，每个试验点霉菌菌落的发生频率都被记录下来。结果如图3所示。正如我们所看到的那样，SDA（22.5℃）回收了大部分的菌落，组合温度（25-30℃+30-35℃）次之，然后是25-30℃，最后是30-35℃。在30-35℃条件下，回收率小于SDA（22.5℃）的1%。图3.在3天的试验中，每种培养策略检测到的霉菌菌落总数总结如果成本是驱动因素，那么单一培养基，组合温度培养(从低到高)的TSA是最佳选择。如果速度是主要的要求，那么25-30℃的单一温度是最好的。如果需要全部回收，那么优选2种培养基，TSA和SDA。

液体培养基接种是用接种环、移液器或吸管等工具，将菌体或菌液移至试管、三角瓶等容器中的液体培养基中的一种接种方法。其操作与前面斜面接种基本相同，但应注意：液体培养基试管管口或三角瓶瓶口略向上以免培养液流出；加入菌体时，应使接种环与管内壁轻轻研磨，使菌体擦下，塞好棉塞后，将试管在手掌心中轻轻敲打或轻轻摇晃三角瓶，使菌体混合均匀。试管液体接种试管液体接种是将一定体积的样品混悬液加入到盛有指定液体培养基的试管内，或将一定体积、按标准规定条件下培养过的培养液接入盛有指定液体培养基的试管内（有时是指接种环取一环，或移液管移液器移取一定的体积，例如0.1ml、1ml等）。涉及试管液体接种的操作有MPN法检测大肠菌群/大肠杆菌，以及沙门氏菌、单增李斯特氏菌的二次增菌转接操作等。此处以用移液器将一定体积的样品混悬液接入到盛有指定液体培养基的试管内为例，①用酒精棉消毒操作台面。将移液器吸头盒放入酒精灯右侧，靠近酒精灯放置。将需要进行液体转接的试管插在试管架上，置于酒精灯左边左手附近。将移液器调至合适的刻度放于右手附近的架子上。废物缸放于右手能触及的范围内。②点燃酒精灯，左手于酒精灯火焰附近打开移液器吸头盒，右手持移液器用力插取吸头两下以防吸头松动脱落，拔出移液器并盖上移液器吸头盒盒盖。左手取待转接液体试管，试管底部位于左手手心，移液器吸头和试管口应在酒精灯火焰周围的无菌区域之内。③将试管伸向右手。右手食指，中指，无名指握住移液器，拇指靠在移液器按钮上，小指和掌心下缘合围夹住试管帽并用力拔出。如果操作者的手比较小，可以靠食指无名指和小指握住移液器，拇指仍靠在液体按钮上。而中指向外伸，靠中指内侧和食指、无名指外侧夹住试管帽。将试管口和移液器吸头靠近火焰，试管口灼烧一周，在火焰附近将吸头刚好伸入试管口，抵住试管内壁下侧，同时按住移液器按钮至一档（轻微推不动）。不要将移液器吸头伸到试管底部，而应倾斜试管使液面倾斜至试管口附近并没过吸头尖端。右手拇指缓慢松开，使液体缓缓吸入洗头，注意不要吸入空气。如果有空气吸入，必须将液体压回试管重新吸取。当右手拇指完全松开时，撤离移液器，注意吸头需尽量一直围绕在在酒精灯火焰附近，并且吸头务必保持向下姿势以防止液体倒流入移液器内部引起污染。④吸完液体后，将移液器撤离试管，移液器吸头移到酒精灯火焰的远离操作者的一侧，将试管口在火焰上灼烧灭菌。⑤灭菌后，右手小指迅速将试管帽盖上，此时移液器吸头仍然要在火焰形成的无菌区域内，不可离酒精灯火焰太远。盖上试管帽将试管归位。⑥左手取待转接入液体的试管，右手保持移液器吸头在酒精灯火焰附近。⑦右手保持握移液器姿势取下试管帽并灼烧管口。将吸头抵靠在试管口的内壁上，缓缓推动移液器按钮至底（完全推至第二档，使残存在吸头尖端的液体也流出）。推出液体时注意不要将吸头深入试管底部，也不要用力推导致液体飞溅。⑧左手将试管口靠近火焰灭菌，移液器吸头移到酒精灯火焰的另一侧。再次灼烧试管口⑨右手保持握移液器姿势将试管帽盖上，将试管归位。移取液体完毕后，按压移液器滑动杆使吸头脱落至废物缸，移液器放回架子。熄灭酒精灯，将台面消毒并收拾干净。三角瓶液体接种相对于试管的液体接种培养，三角瓶接种培养的优势在于通气效果好。多见于霉菌或一些细菌的复壮培养或者摇床培养等。操作与前面提到的液体试管接种操作基本相同，最后将液体加入三角瓶的时候，三角瓶倾斜，移液器吸头抵在三角瓶的内壁，缓缓将液体加入，避免喷溅和气泡

1、无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成。大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA（螯合剂）的混合。2、碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。3、维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。4、有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。5、生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)、植物生长素类。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。(2)、细胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt）。(3)、赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。

1 ) 新鲜细胞：裂解液的量不足，使得裂解不充分。2 ) 新鲜组织：某些含有内源性核酸酶的样品，很难避免RNA酶的降解，建议采用的方法为在液氮条件下将组织研碎，并且，匀浆时采用更多的裂解液。3 ) 冷冻样品：样品取材后应该迅速置于液氮中冷冻存放，然后转移到-70℃冰箱存放。如果未经液氮速冷直接转移到-70℃冰箱存放，会造成RNA缓慢降解。样品研磨后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。4 ) 外源 RNA 酶的污染：试剂、器械等实验用品应该采用DEPC 水灭菌处理。5 ) 内源 RNA 酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多或者匀浆温度过高。

1、定磷法核糖核酸（RNA）含磷量约为9.5%，脱氧核糖核酸（DNA）含磷量约为9.2%，采用定磷法可准确测出磷含量，进而折算出样品中核酸含量。原理：在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当还原剂存在时磷钼酸立即转变为蓝色的还原产物——钼蓝；钼蓝最大的刚吸收在650-660nm波长处，根据吸光值制作标准曲线，从而确定核酸的浓度。测定范围在1-10μg优缺点：简单、快速；但易受蛋白与核苷酸的影响。2、 定糖法原理：核糖中的戊糖可在浓盐酸或者浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或者分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定的浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。RNA浓度的测试：RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（苔黑酚）反应形成绿色复合物，生成的绿色化合物在670nm处有最大的吸收值。测定范围在20~250μgDNA浓度的测定：脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，生成的蓝色的化合物在595nm处有最大吸收值。测定范围在20~250 μg优缺点：较灵敏，但特异性较差3、 紫外吸收法（分光光度法、Nanodrop）组成核酸分子的碱基，由于含有芳香环结构，具有紫外吸收的特性。吸收值在波长250-270nm之间，最大吸收波长是260nm。一般1μg/mlRNA溶液在1cm光径比色皿中的光吸收峰值约为0.022，1μg/mlDNA溶液的光吸收值为0.020。因此测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。4、 荧光光度法专门配套的荧光检测技术，只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的染料。这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时才能发出荧光信号，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，可以对DNA和RNA进行精准定量。优缺点：灵敏，简便；价格昂贵5、 qPCR法使用荧光定量方法中的绝对定量，配套标准品，制作对应的标准曲线，使用荧光定量仪，计算对应的荧光值并转换对应的核酸浓度。优缺点：灵敏度高，误差小；操作时间长

磁珠提核酸磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤、磁珠法纯化DNA原理。核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。1. 细胞裂解：核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。(1)机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。(2)化学作用：在一定pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液 (TE、STE等) 提供。在一定的pH环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA等）可螯合维持核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。(3)酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65℃及有EDTA、尿素(1～4mol/L) 和去污剂(0.5%SDS或 1%Triton X-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。2.酶处理：在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶（DNase和RNase），DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。3.核酸的分离与纯化：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。(1)酚提取/沉淀法：核酸分离的一个经典方法是酚∶lv仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶lv仿∶异/戊醇(25∶24∶1体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀（适用于分离小分子量核酸）或简单颠倒混匀（适用于分离高分子量核酸）后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。lv仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异/戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、lv仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5.0～5.5，终浓度为0.3M的NaOAc或KOAc后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2.5倍体积的乙醇，经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇(等）和盐类（10.0mol/L醋酸铵、8.0mol/L的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯/化锌等）。不同的离子对一些酶有抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解，在实际使用时应予以选择。经离心收集，核酸沉淀用70%的乙醇漂洗以除去多余的盐分，即可获得纯化的核酸。(2)层析法：层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应，而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。(3)吸附法：玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯/酸钠可促进DNA与玻璃基质的结合。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA结合至玻璃珠,用80%乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase的TE缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA，获得的DNA可直接用于测序。磁珠法纯化DNA原理磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。使用羧化磁珠同样可以分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后，离心分离含质粒的水相，再加入羧化的磁粒，然后用PEG/NaCl沉淀，使目的DNA吸附至磁珠,最后磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤，用TE洗脱，可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA

1．细菌的营养物质及作用细菌的营养物质是指能满足细菌生命活动所需的物质，一般包括水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子，它参与细菌的细胞组成、构成酶的活性成分和提供细菌各种生命活动所需的能量。（1）碳源和氮源  是常量营养物，细菌需求量大。不同营养类型细菌利用不同碳源，大多数细菌利用它们组建新的细胞组分并提供了细胞的能量。氮源作为菌体的成分如蛋白质、核酸等合成的主要原料，一般不作为能源。（2）无机盐  作为各种酶的激活因子或辅助因子维持酶的活性，构成菌体成分，参与细胞膜的物质运输和蛋白质合成与菌体内外的渗透压调节，和细菌的生理功能密切相关。（3）生长因子  指细菌生长繁殖需要，但自身不能合成的营养物质。一般包括维生素、氨基酸和嘌呤（或嘧啶）。维生素是酶活性重要组成部分；某些细菌不能合成的氨基酸必须在培养基中加入后才能满足其生长繁殖；嘌呤和嘧啶是构成细胞核酸的组成成分，也是构成某些酶的辅酶或辅基的组成成分。（4）水  保证细菌代谢活动的正常进行。同时营养物质吸收、生长繁殖等生命活动都离不开水。2．细菌的营养类型（1）异养型① 异养菌：以有机化合物作为能源的细菌。② 腐生菌：利用无生命活动的有机物为生长的碳源的细菌。③ 寄生菌：寄生于活细胞内并从细胞中获得所需营养的细菌。所有的病原菌都是异养菌，大部分属寄生菌。（2）自养型  以简单无机物为营养物质的细菌称自养菌。其中以无机物的氧化分解释放能量，以CO2或碳酸盐作为唯1碳源或主要碳源合成菌体成分的细菌称化能自养菌；通过光合作用获得能量称光能自养菌。3.营养物质的吸收营养物质进入菌体的方式有被动扩散和主动转运系统。（1）被动转运  营养物质从浓度高的向浓度低的一侧扩散的非耗能转运方式称被动转运。包括扩散、渗透和需要特异蛋白载体吸附，帮助跨膜转运的易化扩散。（2）主动转运  是细菌吸收营养物质的主要方式，包括分子泵和基因转位二种方式。其特点是：① 扩散方向逆浓度梯度或扩散方向相同但扩散速度快；② 细胞膜上存在特殊的膜蛋白；③需要提供能量。

核酸染料是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂，是生物实验中不可或缺的一分子，尤其是在核酸检测相关试验中，所以核酸染料对于分子生物学相关专业的学生来说并不陌生，该如何选择适合自己使用的核酸染料呢？以下从几个方面来说明：  1、安全性：如果选择EB替代染料，那么染料的安全性就是一个非常重要的指标。安全性评估主要的检测有Ames测试、细胞渗透性实验、染色体畸变和正向突变分析、口服毒性分析等。在安全性方面，具有较多检测项目和机构出具检测报告的核酸染料，安全性可能会更高；另外在一些报道或对比数据中，我们也可根据它们可能的原料来判断它们的安全性。  2、 稳定性：核酸染料的稳定性和在各种条件下的染色效果，会直接影响观察到的染色结果。  3、灵敏度：几乎所有的EB替代染料都其染料的灵敏度至少不低于EB，甚至高于EB，具体到试验内容上，只要不是有特殊的需求，一般都能满足。  4、迁移率：由于核酸染料最终都会结合到DNA上，才能通过染料从而对DNA进行分析，这也就意味着如果采用点染法或胶染法进行核酸检测时，根据使用的染料不同，核酸染料或多或少会对核酸的迁移率甚至带型产生影响。