实验概要:本实验通过摇瓶培养和发酵罐培养分别小量和大量诱导菌种表达,获得了目的蛋白的粗提物,通过Amylose亲和层析获得纯化蛋白。
主要试剂:LB培养基,2-YT培养基,诱导剂IPTG,5N氢氧化钠,2N盐酸,葡萄糖
主要设备:恒温振荡器,离心机,发酵罐
实验材料:重组菌
实验步骤
1. 摇瓶培养
1) 取出4℃下平板保藏的菌种,挑取单菌落,接种于5ml LB培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中,37℃,300r/min,恒温振荡培养,过夜活化;
2) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含100m1 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的500mI摇瓶中,37℃, 300 r/min,恒温振荡培养,作为2L摇瓶培养的菌种。
3) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含400m1 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的2L的摇瓶中,37℃, 300 r/min,恒温振荡培养。
起始诱导时机为菌体OD600=4,诱导剂IPTG (IPTG贮液:浓度为20%, 0.22um膜过滤除菌,分装后-20℃冻存。)浓度为0.03 mmol/L,诱导表达的时间控制在4h左右。
2. 5L发酵罐培养
1) 取出4℃下平板保藏的菌种,挑取单菌落,接种于5ml LB培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中,37℃, 300 r/min,恒温振荡培养。过夜活化;
2) 然后按5%的接种量将活化菌种接入到含100ml 2-YT培养基(含有Amp 100ug/ml)的500mI摇瓶中,37℃, 300r/min,恒温振荡培养,作为5L发酵罐的菌种。
在基因工程菌株5L高密度发酵过程中,温度由系统自动控制在37℃,通过自动流加5N氢氧化钠和2N的盐酸使pH保持在7左右,葡萄糖的流加采用恒速流加,即培养5h后开时流加补料,以0.042g. (L. min)-1葡萄糖的的速率进行补料。发酵的IPTG诱导时机均为OD600约为3时进行诱导,IPTG的浓度为0.1 mg/ml。
3. 目的蛋白粗提物的获得
1) 试剂配制
CB(Column Buffer)缓冲液:
Tris-HCl 20mmol/L(pH 7.4)
NaCI 200mmol/L
ED TA 1 mmol/L
PH 7.4
称11.7g NaCI, 0.37g EDTA,取20ml Tris-HCl,用NaOH调至PH7.4,加超纯水至1L,用0.22um滤膜滤菌。
2) 提取方法
发酵液以8 000r/min离心30min收集菌体。菌体收集后用无菌水洗二遍,以洗去表面残留的培养基。按1:10的比例(W/V)把菌体悬浮在CB溶液中,超声波破碎细胞,功率40W,每破碎l0s后间隔2s,每5min取样,用Bradford法测定可溶性蛋白总量,确定最佳破碎时间。破碎过程中保持低温(0℃),完全破碎后于4℃以10 000 r/min离心30min,上清液用于上柱纯化。
4. Amylose亲和层析
1) 试剂配制
a. CB(Column Buffer)缓冲液同上
b. CB加麦芽糖(10mmol/L ):称取3.6g麦芽糖,用CB配成1L溶液,用0.22um滤膜滤菌;
c. 0.1%SDS:称1g SDS,加超纯水至1L,用0.22um滤膜滤菌。
2) 层析步骤
a.柱子的清洗:先用20%酒精润洗柱子2次,装柱;
b.柱子的平衡:新柱料用5倍体积的CB洗柱,再生柱料用3倍体积的CB平衡,流速为2m1/min;
c. 上样:流速为0.5ml/min;
d. 洗杂:用CB洗柱至流出液的A值与空白(即CB)相同,流速为2ml/min;
e. 洗脱:用CB加麦芽糖洗脱,流速为0.5ml/min,分步收集产品进行SDS-PAGE分析,确定最佳洗脱条件;将接下的样品取一小样,留做检;
f. 柱料的再生:依次用3倍柱体积的无菌水、3倍柱体积的0.lmmol/L SDS溶液、1倍柱体积的无菌水洗柱,各步均须洗至基线;再用3倍柱体积的CB平衡柱料;
g. 纯化后样品,用去离子水透析脱盐或Sephadex G-25脱盐柱脱盐,经低温真空离心浓缩机抽干成粉状,低温干燥保存。
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