(一)DNA的凝胶电泳:凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。
琼脂糖凝胶用于分离大于200~1000bp的片段;操作简单、快速,且分离范围广,分辨率高。
2.聚丙烯酰胺凝胶用于分离5-500bp的片段; 效果好、分辨率极高,相差1bp的DNA片断就能分开,能容纳相对大量的DNA ,用于核苷酸多态性的分析。
琼脂糖凝胶电泳的基本过程
材料:电泳缓冲液(常用TAE或TBE)、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液(核酸显示剂)、加样缓冲液(保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统)、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。
基本过程:制胶→放入电泳槽中并加入电泳缓冲液→取出梳子→将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中→一定电压条件下电泳→合适的时间后停止电泳→取出凝胶进行溴化乙锭染色→凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果
注意:溴化乙锭具有致癌性,操作时要带手套;不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围;影响DNA在凝胶中迁移速率的因素:1、DNA分子的大小;2、构象;3、凝胶浓度;4、电压;5、缓冲液
特殊的凝胶电泳
1、倒转电场凝胶电泳(FIGE):用于分离分子量10~2000kb的DNA分子;
2、钳位均匀电场电泳(CHEF电泳):可分离大于107bp的DNA分子。
(二)RNA 电 泳
基本过程同DNA电泳一样,但应明确一点的是,因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感,因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液,所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解;另外,因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的变性剂为甲醛和戊二醛。
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