流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质,并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学,免疫学,遗传学,基础医学等领域。接下来的 Protocol 中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。
一. 试剂准备
Wash Buffer:PBS+1% FBS
破膜剂(ICS):用双蒸水配置 10 % Saponin(Sigma)。
破膜固定剂:将配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀释 100 倍
ICS Wash Buffer:将配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀释 100 倍。
二. 细胞表面染色
收集各组细胞,进行细胞计数,加入适量 Wash Buffer 液洗涤,1500 rpm 离心 5 min,去上清,加入 50 μl Wash Buffer 重悬。
(可选)Live dead 染色,每管加 0.1 μL Zombie GreenTM Dye(样品多时使用时可先稀释),震荡混匀,室温避光孵育 10~15 min。Wash Buffer 液洗涤,1 500 rpm 离心 5 min,弃上清。
封闭 Fc 受体:每管中加入 1 μg/106 细胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗体封闭荧光抗体 Fc 受体引起的非特异性染色。震荡混匀,4℃ 孵育 30 min(或室温避光 15 min)。Wash Buffer 液洗涤,1 500 rpm,离心 5 min,弃上清。
用适量体积 Wash Buffer 液重悬每个样本,将各组细胞等细胞数混合后分装到单染管和不染抗体管,作为流式检测时调节电压。
单染管中加入相应表面染色抗体,同时在每个样本中加入 1 μL percp CD3/106 细胞和 0.5 μL PE CD4/106 细胞,震荡混匀,4℃ 避光孵育 30 min(或室温避光 15 min)。
用 Wash Buffer 液洗涤,1500 rpm 离心 5 min,弃上清。
打孔或者加入 200 μL 1% PFA(多聚甲醛)固定过夜。
三. 胞内染色
将全部管细胞固定打孔。每管加入 150 μL 固定破膜剂,震荡混匀,4℃ 避光孵育 20 min。
ICS Wash Buffer 液洗涤,用法同 Wash Buffer 液。
在相应的需要进行胞内染色的样本中加入适当量胞内染色抗体(如 APC IFN-γ抗体),4℃ 孵育 30 min 或室温避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗涤,1 500 rpm 离心 5 min。
弃离心上清液,根据实际情况加入 200 μL 或者 300 μL Wash Buffer 液重悬。
震荡混匀,流式上机。
四. 注意事项
每一步离心倒掉上清时可以先在实验台上铺几层平板纸,倾倒上清后可吸掉管口的液体。
为了避免打孔剂对细胞形态的影响从而影响后续圈门影响实验结果,所以不管是否需要胞内染色,每个样本都需要打孔。
染色时抗体的加入量可根据实际情况调整,为避免抗体浓度对染色的影响,样品染色体系不得大于 100 μL。为减少染色时加样的误差,可配置表面染色抗体稀释液,双染或多色染色可把多种抗体稀释到一管中。按 10 μL 或 5 μL 体系,用 Wash Buffer 液稀释。
为了避免游离抗体的结合出现假阳性,可洗涤两次。
检测的细胞量不能过少也不能过多,细胞太少检测时样本流量会增大影响变异系数,细胞过多,可能会导致抗体或染料相对不足,影响实验结果。
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