一、DNA 的片段化典型的细胞凋亡以细胞核固缩、染色质DNA的特征性片段化为主要特征。细胞凋亡发生时，内源性核酸内切酶被激活DNA双链被切成特征性的片段。二、内源性核酸内切酶激活及其作用早在20世纪70年代就已经发现在正常细胞中存在对Ca2+和 Mg2+依赖的内源性核酸内切酶，这种Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶是一种双链 DNA内切酶，这是一类与凋亡有关的核酸内切酶（deoxyribonuclease，DNase），统称为凋亡性核酸内切酶（apoptotic endonuclease）。在细胞凋亡过程中，染色质DNA切割的任务由内源性核酸内切酶来完成。正常条件下，该酶可能以无活性的形式存在细胞核内，Ca2+、Mg2+可以增强其活性，Zn2+能抑制其活性。常见的有核酸内切酶Ⅰ（DNaseⅠ）、核酸内切酶Ⅰ（DNase Ⅱ）、Nuc-18等。经过这类酶切割后所产生的DNA最小单位为185bp，其余DNA片段为185bp的倍数（即185bp的寡聚体）。细胞内的 DNA经过此酶的消化，可以产生类似凋亡细胞的DNA降解现象。对DNA 的切割动力学分析表明，这种DNA降解片段可以在1~～2h内检测到。DNA降解过程从细胞死亡前5h开始，到第24h，绝大多数凋亡细胞降解达到高峰。1、DNaseⅠDNaseⅠ的相对分子质量为32000~37000，对Ca2+和 Mg2+具有依赖性，并且可能需要其他辅助因子的参与，因为纯化的DNase Ⅰ不能产生DNA梯形条带，但和核基质或血清孵育后，可以恢复其能促使DNA发生断裂的生物学活性。DNaseⅠ的最适pH值为7.5（5.5～9.0）。其抑制剂有Zn2+、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、二乙基焦磷酸盐（diethylpyrocarbonate，DEPC）及肌动蛋白。DNase Ⅰ分布在细胞的内质网和核周的高尔基体内，对其如何进入细胞核内发挥作用目前未完全阐明。2、DNaseⅡDNaseⅡ的相对分子质量为29000，在细胞的溶酶体和细胞核内均发现有DNaseⅡ。DNaseⅡ为对Ca2+和Mg2+非依赖性的，纯化的DNaseⅡ能够使CHO细胞核出现 DNA梯形条带。DNaseⅡ的最适pH值为5.5（3.0～7.0），需要在低pH值条件下激活。胞质酸化足以激活DNaseⅡ。DNaseⅡ的抑制剂有N-溴琥珀酰胺（N-bromosuccinamide，NBC）和金精三羧酸（aurintricarboxylic acid，ATA）。Zn2+不能够抑制其活性，但Zn2+可以抑制胞质酸化，从而影响DNaseⅡ裂解DNA。3、NUC18NUC18是在地塞米松诱导的大鼠凋亡胸腺细胞核中发现的，对Ca2+和Mg2+具有依赖性，是相对分子质量为18000的中性核酸内切酶，为环孢素A受体（cyclophilin）相关蛋白，此外，Ribeiro报道了一种取自脾脏细胞核，相对分子质量为27000的核酸酶，其最适pH值为8.0，对Ca2+和 Mg2+具有依赖性，可以被Zn2+和ATA所抑制。NUC18对糖皮质激素受体具有依赖性，其活性可被糖皮质激素受体拮抗剂RU486所抑制；其蛋白质的序列与环孢素A受体相关蛋白具有显著类似性；在凋亡细胞中其酶解DNA时所产生的片段大于180bp，其在细胞凋亡中的作用有待进一步研究。研究还发现，内源性核酸内切酶的活性可能与拓扑异构酶有关。目前已知细胞内有两类拓扑异构酶，即TopoⅠ和TopoⅡ，其功能是在DNA上产生单链和双链缺口，消除染色体 DNA 的阻力，但均不具有内切酶的活性。目前对TopoⅡ更加重视，因为有人提出它可能起着使染色体解旋的作用，这样内切酶可以更加容易接近切割点。

发生凋亡的细胞，其表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接触。形态上，凋亡细胞首先变圆，与邻近细胞脱离，失去微绒毛，胞质脱水浓缩，胞膜迅速发生空泡化（bleb-bing），细胞体积逐渐缩小，出现固缩（condensation），内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称为出芽（buding）。晚期，核染色质高度浓缩融合成团状，核染色质密度增高呈半月形或马蹄形分布，并凝集在核膜周边，称为染色质边集（margination）。核仁裂解，进而胞膜皱缩内陷，自行分割为多个外部有膜包裹的、内含物不外泄的泡状小体，称为凋亡小体（apoptosis body），最终被邻近细胞所识别、吞噬消化，或自然脱落而离开生物体。其DNA迅速被核酶所降解，产生若干个大小不同的寡核苷酸碎片，在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状核蛋白区带图谱。由于酶切的位点在核小体处，而核小体的核苷酸为180bp，所以产生不同倍数的180~200个碱基对的核酸片段电泳区带。但在整个过程中，线粒体内的 DNA并不发生断裂。由于这种死亡过程没有溶酶体酶及胞膜破裂，所以，细胞内涵物不外泄。近年来的研究发现，凋亡细胞表面有糖蛋白的末端唾液酸残基发生丢失，膜磷脂层不对称性被破坏﹑磷脂酰丝氨酸暴露等改变，均可以促使吞噬细胞对凋亡细胞的识别，凋亡时常常无炎症反应也正是因为这个缘故，因此长期以来凋亡一直未引起人们的重视。通过流式细胞仪等方法观察发现，凋亡与死亡有明显的差异（表21-1），凋亡细胞具有以下特征：①由于细胞核酸内切酶激活，使DNA特征性荧光染色减少。②细胞质膜保持一定的完整性。③线粒体跨膜电位下降。④保留ATP依赖的溶酶体质子泵。⑤细胞蛋白含量明显减少，系由内源性蛋白酶被激活，蛋白质酶解增加所致.⑥在胸腺细胞，凋亡发生在G。期。⑦光吸收减少，直角散射不变（HL-60细胞）或增加（胸腺细胞）。细胞凋亡的发展包括两个不同时期：（1）致死前期（prelethal stage）：是凋亡时细胞损伤的早期，具有可逆性，此时出现细胞皱缩、核染色质固缩、胞质中含空泡等变化，最后出现线粒体肿胀。（2）致死期（lethal stage）：凋亡细胞进入死亡阶段，此时变化不可逆，出现质膜连续性破坏和染色质严重固缩、融化及肿胀的线粒体中絮状集结和（或）钙化。这常常见于脱落的凋亡细胞中，或吞噬了致死前期空泡片段的邻近细胞的溶酶体中。

细胞凋亡的生物学意义主要表现在：①细胞凋亡在生物界中普遍存在。②细胞凋亡是多细胞生物体的生命活动中不可缺少的组成部分，是其自身借以存活的需要，因而贯穿于全部生命周期中，无论是低等动物还是高等动物均是如此。③细胞凋亡是生物在进化过程中所形成的细胞主动死亡的一种主要方式。细胞凋亡有重要的生理和病理意义，其作用主要表现在三个方面：①确保正常发育、生长。机体的发育、生长过程不仅仅需要细胞的增殖与细胞分化，也需要细胞凋亡参与组织器官的形成和成熟，一旦细胞凋亡发生缺陷，如使促进细胞凋亡基因敲除（knockout），可以出现器官发育障碍。细胞凋亡可清除多余的失去功能价值的细胞，这种细胞大多数在发育早期阶段死亡。②维持内环境稳定。突变、受损或衰老的细胞如果继续存留在机体内会有负面效应，如诱发肿瘤。目前认为，肿瘤的发生是因为细胞凋亡存在缺陷，使突变、受损或衰老的细胞能够持续增殖。为了维持内环境的稳定，机体必须及时清除这些细胞，让新生细胞取代其功能，清除的主要途径是细胞凋亡。如子宫内膜在周期性的增生之后由于激素撤退而发生细胞凋亡，然后脱落。实际上，通过细胞凋亡被机体清除的细胞数量相当惊人，每秒钟可以达到数百万个细胞。③发挥积极的防御功能。细胞凋亡参与了机体的防御反应，例如，当机体受到病毒或细菌感染后，受到感染的细胞即出现凋亡，使细胞内整合或未整合的病毒 DNA 或RNA同感染细胞一起死亡，也能够使细胞内的细菌同感染的细胞同归于尽，阻止病原体继续感染其他细胞和病原体的复制。深化对细胞凋亡的认识，也促使人们对疾病的发生、发展和治疗开阔了新的视野，即从细胞死亡的角度看待生物体的命运，该“死亡”的细胞，如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞、发育早期幼稚细胞出现死亡缺陷，是导致肿瘤、自身免疫性疾病和发育障碍的主要发病机制之一。有许多学者试图通过诱导肿瘤细胞凋亡阻止其细胞继续增殖，以治疗癌症。不应该“死亡”的细胞，如神经元、心肌细胞、肝实质细胞的过多死亡，与老年性痴呆，心肌缺血-再灌注损伤、肝硬化的发病有关。在这些疾病中，如果减少细胞凋亡，可缓解疾病的进程。Feng等运用秋水仙碱能够拮抗“死亡配体”诱导的肝细胞死亡，避免肝细胞大量凋亡，保存肝细胞，有利于肝脏发挥其功能。目前已证实，既往所提及的细胞坏死中也存在大量的细胞凋亡现象。因此，可以说凋亡现象广泛存在于生物体中，是对机体的生长发育有利的生物学现象，但某些重要器官发生过量的凋亡，必然使其实质细胞大量减少，降低其生物学功能，也影响机体的功能。在多器官功能衰竭中，部分原因是大量器官实质细胞凋亡和坏死，导致器官功能显著下降，而出现功能衰竭。

夏日炎炎，暑气正盛，在微漾的夏风中，为期两天的科德角国际细菌内毒素检测技术应用及PKF细菌内毒素定量检测系统实操培训（第二期）在科德角国际生物医学科技（北京）有限公司圆满落幕。本次实操培训由科德角国际生物医学科技（北京）有限公司主办，北京阿克庇斯医药有限公司协办。参与本次实操培训交流合作伙伴：北京生物制品研究所有限公司、上海生物制品研究所有限公司、北京科兴中维生物技术有限公司、北京民海生物科技有限公司、康龙化成（北京）新药技术股份有限公司。感谢以上公司对本次实操培训的支持！一起来回顾这两天的精彩瞬间吧~一、细菌内毒素知识专题讲座，好评如潮7月19日，科德角国际资深技术主管尹雪雁和科德角国际高级应用工程师秦焕甲为大家带来细菌内毒素知识专题讲座。科德角国际资深技术主管 尹雪雁科德角国际高级应用工程师 秦焕甲会上，科德角国际资深技术主管尹雪雁和科德角国际高级应用工程师秦焕甲结合细菌内毒素检测既往案例、Pyros® Kinetix Flex细菌内毒素定量检测系统和鲎试剂使用情况，深入浅出地为大家介绍了鲎反应干扰因素及方法选择、细菌内毒素光度检测开发实例及重组鲎试剂方法介绍以及Pyros® eXpress细菌内毒素定量检测软件的使用方法、优势、特点等内容。其中，重组鲎试剂出场便吸引了全场的目光，凭借其检测便利、快速高效、节约试剂、高灵敏度等优势获得了在场技术人员的高度关注。答疑环节，技术人员向科德角国际资深技术主管尹雪雁和科德角国际高级应用工程师秦焕甲提出一系列的细菌内毒素检测专业问题，尹雪雁和秦焕甲结合药典法规和应用经验，一一为大家解答，并通过一套《细菌内毒素检测技术培训考核题》检验大家的学习成效，在座的各位技术人员纷纷表示受益匪浅，收获颇丰！ 技术人员们正在答题二、参观细菌内毒素检测实验室，点赞连连茶歇期间，各位技术人员还在科德角国际健身房进行了Body Mass Index Test体质健康指数测试，增加了培训后的趣味性。随后，科德角国际高级应用工程师秦焕甲及科德角国际销售总监杨喆带领大家参观了我司细菌内毒素检测实验室等区域，并向大家详细介绍了各实验室功能区职能，各位技术人员对我司实验室完善的基础设施、先进的仪器设备、严谨客观的检测流程点赞连连，做出了高度评价。三、PKF细菌内毒素定量检测系统实操培训，简明高效7月20日，科德角国际高级应用工程师秦焕甲带领大家在科德角国际细菌内毒素检测实验室进行了细菌内毒素检测实操培训。各位技术人员对Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统已经不陌生了，优异的性能、高效简便的检测流程及强大的软件功能让人赞不绝口。科德角国际高级应用工程师秦焕甲通过Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统进行细菌内毒素检测实验，全程实操指导带教，讲解细致入微，向大家展示了完整的细菌内毒素检测流程，让大家能亲身感受细菌内毒素检测的实操规范过程。通过实验数据结果向客户展示了Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素检测设备和Pyros® eXpress软件的快速、高效、精准的优势特点，得到了各位技术人员的高度赞扬。科德角国际细菌内毒素检测技术应用及PKF细菌内毒素定量检测系统实操培训（第二期）圆满结束，期待下期再会！策划丨科德角国际·市场部编辑丨Carrie·Tse校对丨Zoe·Yin,Feng

内毒素进入机体后，99%很快被清除。内毒素在体内、体外均可引发免疫反应，使单核-巨噬细胞等细胞释出细胞因子，发挥内毒素的生物学作用，其中涉及诱导细胞死亡，包括细胞凋亡和细胞坏死。机体内细胞死亡通常可分为两类：一类是细胞的坏死，物理性、化学性、生物性等损害因子以及缺氧与营养不良等因素均可以导致细胞坏死。坏死细胞的细胞膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，细胞结构全面溶解、破坏。早期细胞核无明显形态学变化，最后细胞溶解破裂，溶酶体酶外漏，并常常引起炎症反应；在炎性愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。另一类为细胞凋亡，又称为程序性细胞死亡（programmedcell death，PCD），是由宿主内基因调控的主动而有序的进行性的细胞自我消亡过程，凋亡是通过细胞内固有的生理、生化反应或某种酶的活化导致细胞的死亡，因而具有生理性和选择性。细胞凋亡过程不出现溶酶体及胞膜中内涵物外泄，故不引起炎症反应。凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不留瘢痕。死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。严格来说，程序性细胞死亡与凋亡之间是有区别的，凋亡是形态学概念（如染色体边集以及DNA梯状条带等）；而程序性死亡是功能性概念（不一定存在上述形态学变化），一般情况下两者可以混用。“凋亡”一词由病理学者Curries等于1972年编撰出来，该词来源于一古希腊语，当时用来描述一种不同于细胞坏死的细胞死亡形态学特征。凋亡的原词apoptosis是由两个拉丁语组成，apo意指离开、分离，ptosis意指落下，类似于花瓣或树叶的脱落，因此细胞凋亡的原意是细胞凋亡时的形态类似花瓣或树叶的凋落﹐犹如秋天的落叶，它生长发育到一定阶段，就会失去生命力，从而脱落。凋亡是细胞死亡的一种主要形式，也可理解为细胞的主动“自杀"行为。它是一个与细胞增殖、分化一样的主动的细胞学过程，因此也可以将细胞凋亡看做一种特殊类型的细胞终末分化过程，是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定而由基因控制的细胞主动死亡过程。

天然BPI对各种光滑型革兰阴性菌外膜LPS的亲和力有很大差异，而对各种纯化的游离LPS的亲和力则基本相同。这表明细菌外膜上LPS分子的表型与游离LPS分子存在差异。前者通过脂质A区结合的长链脂肪酸﹐借疏水键与细菌外膜脂质双分子层的外侧紧密相连，因此位于菌体表面LPS最外层的长链特异性多糖可通过空间位阻作用，不同程度地干扰BPI及其rBPI23对LPS内核心和深部脂质A区的结合。鉴于各种革兰阴性菌LPS内核心和脂质A区的结构基本相同，所以上述两种抗菌蛋白对各种游离LPS的亲和力基本相同。这表明细菌外膜上LPS分子的表型构象与游离LPS分子有显著差异。前者通过脂质A区结合的长链脂肪酸，借助疏水键与细菌外膜脂质双层的外侧紧密相连，因此位于菌体表面LPS最外层的长链特异性多糖可以通过空间位阻作用，不同程度地阻碍BPI及rBPI23对LPS内核和深部脂质A区的结合。当细菌LPS从外膜脱落后，长链特异性多糖的空间位阻效应消失，原来靠近外膜脂质双层的内核和脂质A区得以暴露，因此 BPI及rBPI23可以不受任何阻碍而直接与之结合。以宿主BPI作为保护剂，促使LPS形成LPS 聚集体，通过内化活动转运到溶酶体内，在多种酶参与下将其降解，从而达到内毒素的解毒和清除效果，对于治疗内毒素血症具有重要意义。美国已经完成BPI的二期实验，效果确切，目前正在进行BPI三期临床试验，有可能成为一种有效的内毒素治疗手段，我们拭目以待。BPI属于宿主防御反应中的阳离子肽之一，利用其带正电荷与LPS的带负电荷的特点，可促使LPS间形成复合物，阻止LPS进行信号转导，这样即抑制了LPS的生物学效应。其实宿主中阳离子肽种类繁多，其氨基酸多半少于100个，典型的少于35个氨基酸，带净正电荷，通常为4个以上，这是因为存在过量的赖氨酸和精氨酸的缘故。阳离子肽能与抗生素发挥协同作用，具有显著抗内毒素作用。但因为许多阳离子肽对机体具有明显的毒性，因而限制了开发利用。

杀菌渗透增强蛋白对革兰阴性菌的毒性作用表现为两个阶段，即早期可逆性损伤阶段和晚期不可逆性损伤阶段。（1）杀菌渗透增强蛋白通过其口袋与革兰阴性菌膜上的LPS等磷脂成分结合，造成直接的细菌生长停滞；生长停滞与细胞外膜的改变有关，两者的效应起初为可逆性。当杀菌渗透增强蛋白或rBPI23与革兰阴性菌外膜LPS内核和脂质A区的相应部位结合后，1min之内即可使细菌停止分裂，此时细菌外膜上疏水性渗透屏障遭到破坏，可使菌体内某些降解外膜磷脂和肽聚糖的酶类激活，从而导致细胞外膜损伤。但是这种外膜损伤是可逆的，经过适当处理后外膜损伤可以修复﹐细菌继续生长。因此，杀菌渗透增强蛋白或rBPIzs对革兰阴性菌的早期仅仅表现为一种抑菌效应。（2）随着时间的延长和孵育条件的改变如pH值的变化，胞质膜上影响细菌能量代谢的部位发生结构和功能的改变，此时损伤不可修复，细菌不再能够存活，表现为杀菌效应。由此可见，早期的可逆性损伤效应仅仅局限于革兰阴性菌的外膜，而杀菌效应与胞质膜损坏相一致。BPI引起的杀菌效应伴随着细菌的细胞膜的破坏，革兰阴性菌被PMN或BPI处理后，其结局实质上完全相同。杀菌渗透增强蛋白介导PMN的吞噬过程，在防御素或p15存在条件下，杀菌渗透增强蛋白的效应明显增强。在其他宿主因子如补体的膜攻击复合物和某种宿主或细菌磷脂酶等的协调作用下杀菌渗透增强蛋白使细菌生长停滞到杀菌的进程会加速。杀菌渗透增强蛋白对许多革兰阴性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、志贺痢疾杆菌、变形杆菌，奈瑟杆菌等均有抑菌和杀菌作用。但是这些细菌对杀菌渗透增强蛋白的敏感性有显著差异。研究表明，革兰阴性菌对杀菌渗透增强蛋白的敏感性主要取决于细菌外膜LPS的一级结构，因为一级结构改变势必影响其空间构象的变化，特别是LPS的特异性多糖链的长度。通常外膜LPS特异性多糖链越长，其位阻效应越显著，杀菌渗透增强蛋白与细菌之间的亲和力就越低，细菌对杀菌渗透增强蛋白的敏感性也越差。反之亦然。细胞外膜的LPS的特异性多糖链越短，位阻效应越小，细菌对杀菌渗透增强蛋白作用的敏感性就越高；更易被BPI所识别。例如，杀菌渗透增强蛋白对具有完整外膜LPS结构的革兰阴性菌的光滑型大肠杆菌等，以及特异性多糖发生缺陷的突变株等粗糙型革兰阴性菌均有广谱抗菌作用，但抑制这些光滑型革兰阴性菌生长所需的杀菌渗透增强蛋白浓度为微摩尔每升水平，而抑制粗糙型革兰阴性菌生长所需的杀菌渗透增强蛋白的浓度仅为纳摩尔每升水平。这表明，细菌外膜LPS特异性多糖链的长度与细菌对杀菌渗透增强蛋白作用的敏感性密切相关。目前已证实，细菌LPS中携带大量阴离子基团的脂质A内核心区，以及脂质A的疏水部分是与杀菌渗透增强蛋白结合的部分。磷脂酰胆碱可能也是LPS结合的部位。由此可以推断，光滑型革兰阴性菌对杀菌渗透增强蛋白作用敏感性相对较差可能是由于细菌LPS特异性多糖能够通过空间位阻作用干扰杀菌渗透增强蛋白对细菌LPS脂质A内核心区靠近，从而使杀菌渗透增强蛋白与细菌的外膜LPS结合的亲和力降低所致。用完整杀菌渗透增强蛋白（nBPI55 、rBPI55）和功能性杀菌渗透增强蛋白的N端片断（nBPI25 ，rBPI23）对粗糙型和光滑型大肠杆菌所作的抗菌实验结果支持上述结论。完整杀菌渗透增强蛋白和功能性杀菌渗透增强蛋白的N端片断对缺少特异性多糖链空间位阻效应的粗糙型大肠杆菌的生长抑制作用完全相同，而对光滑型大肠杆菌的作用存在明显差异，其中小分子功能性杀菌渗透增强蛋白的N端片断对光滑型细菌的生长抑制作用比大分子完整杀菌渗透增强蛋白分子高50~100倍。这可能是由于，小分子杀菌渗透增强蛋白的N端片断能顺利克服细菌外膜LPS特异性多糖链的空间位阻干扰，易与细菌LPS的脂质A内核心区的相应部位结合。细菌荚膜不能干扰杀菌渗透增强蛋白或其rBPI23对革兰阴性菌外膜的LPS的结合。在全血实验中，纳摩尔每升浓度水平的nBPI55或rBPI55就可使血清中对吞噬作用抵抗的粗糙型大肠杆菌发生损伤，并可对该菌LPS介导的反应产生强大抑制作用。杀菌渗透增强蛋白及其功能性N端片段对少数革兰阴性菌，如肺炎克雷伯杆菌血清抵抗株的杀菌作用微弱，但对该菌诱导单核细胞产生释放细胞因子如TNF、IL-1等的能力具有强大抑制作用。这表明该阳离子抗菌蛋白对防止革兰阴性菌感染后引起的中毒反应也有重要意义。体内外实验表明，杀菌渗透增强蛋白可保护实验动物由静脉或腹腔注入的大肠杆菌或铜绿假单胞菌所产生的致死作用；实验动物的存活率与血液中细菌的清除率相一致。

1978年，Weiss等首次从人中性粒细胞中分离出并获得纯化的天然杀菌/渗透增强蛋白分子（natural bactericidal/permeability-increasing protein，nBPI）。nBPI的相对分子质量为55000，位于中性粒细胞溶酶体内，属于嗜天青颗粒中阳离子抗菌蛋白成分之一。只有多型核白细胞（PMN）的骨髓前体细胞才能分泌出具有抗菌活性的多肽产物，即“内源性抗菌肽”。通过体内外实验表明，在PMN细胞的诸多抗菌成分中，BPI是惟一能够直接对革兰阴性菌发挥毒性作用，以及对游离LPS具有中和、拮抗作用的抗菌物质。现已证实，杀菌/渗透增强蛋白也参与宿主抗菌的免疫反应，是基因组序列上高度保守的脂质反应蛋白家族成员之一，生物进化各个阶段的中性粒细胞中均表达杀菌/渗透增强蛋白成分。人类BPI基因位点在20号染色体上，与LBP蛋白在同一DNA区域内。在多型核白细胞中已知的抗生蛋白/肽（antibiotic proteins/peptides）中，BPI由于能够对革兰阴性菌发挥毒性作用而引人关注。天然杀菌/渗透增强蛋白分子由456个氨基酸残基所组成，近N端1/2处其氨基酸残基为富含阳离子的赖氨酸，C端1/2处的氨基酸残基高度疏水，带少量电荷，中间区为相对亲水、富含脯氨酸的蛋白酶敏感区，经蛋白酶进行有限水解后，天然杀菌/渗透增强蛋白可裂解为两个片段，即一个相对分子质量为25000的N端片段（nBPI25）和一个相对分子质量3 000的C端片段（nBPI30）。其中N端片段具有nBPI55的全部生物学活性，而C端片段未见任何抗菌活性。其化学晶体结构如图20-3所示。图20-3nBPI化学模拟结构1989~1990 年，Gray和Leong等先后从人和牛PMN中克隆出编码杀菌/渗透增强蛋白的cDNA，并成功地得到表达，从而获得相对分子质量为55 000的完整重组杀菌/渗透增强蛋白分子（rBPI55）。1992年，Weiss等获得相对分子质量为23000的重组杀菌渗透增强蛋白的N端片段（rBPI23）。体内外研究表明，无论是完整的杀菌渗透增强蛋白分子（nBPI55 ，rBPI23），还是蛋白酶水解片段及重组杀菌渗透增强蛋白的N端片段（nBPI55、rBPI23）均对革兰阴性菌及其裂解产物LPS具有高亲和力，他们可广谱抑制革兰阴性菌的生长，并对其产生细胞毒性作用，可阻断细菌LPS介导的一系列毒性反应，但对G+和真核细胞无毒性作用。

Hampton等用巨噬细胞系RAW264.7细胞株研究LPS的内化过程。他们先将LPS加入培养基，使培养基内毒素浓度在纳摩尔每升水平，然后加入RAW264.7细胞使其吸收4'-单磷酸脂质AⅣA。在细胞摄取脂质AⅣA的同时伴随着溶酶体发生去磷酸化反应，产生4'单磷酸脂质AⅣA。后者的生物学活性显著降低，该实验证实了LPS进行去磷酸化反应的分解代谢促使其毒性下降。可见，在溶酶体中发生LPS的解毒效应有两种：①发生脱酰基化。②发生去磷酸化。失去一定成分的LPS无法引出信号转导效应，所以机体通过对LPS进行酶解使其失去毒性。细菌LPS进入单核细胞可通过CD14依赖的途径，存在有两种方式，但大多数通过非网格蛋白参与的形式来完成。CD14结合LPS可以通过网格蛋白包被小窝（clathrin-coated pits）进入细胞内，也可以如同其他GPI锚定蛋白一样以非包被内陷（uncoatedinvagination）形式完成内化反应。进入酸性的细胞内腔室后，脂质A部分被分解，失去其生物学活性。用染色标记技术证实，LPS可以由吞噬细胞将其从细胞膜上转运到细胞内小泡内，表现出多种特性。在巨噬细胞中，LPS可以到达核周区域，该区为高尔基体停泊处。许多证据显示：内化的LPS需经历酶学分解和物理隔离（physical sequestration）两个处理过程，这些过程可以削弱LPS的信号转导作用。LPS诱导的信号转导效应本身可以调节其加工过程，例如LPS激活的巨噬细胞中LPS可以下调自身的去磷酸化反应。在LPS 反应低下的C3H/HeJ品系小鼠中，Thieblemont 等发现巨噬细胞对LPS和神经酰胺的内吞摄取能力存在缺陷。一些实验显示，在LPS信号转导之前，LPS必须存在于细胞内小泡中，而其他实验则认为LPS经历内化不涉及信号转导，这种分歧的产生可能是由于未充分考虑到所用的干扰细胞活动的试剂对细胞的其他生物学功能所带来的负面影响。如腺嘌呤受体2X7（purinergic receptor 2X7，2X7）在LPS的激活效应中起着基本的作用，不能排除上述实验中应用的试剂对2X7存在一定影响。

内化：受体内化是受体进行信号转导和物质摄取的重要方式。也涉及受体数目减少和调节机体应答等方面。利用配体标记技术进行的实验表明，许多多肽等信号分子进入靶细胞可能需要借助于细胞表面的受体介导的内吞作用。内化是一种特殊的胞吞作用，细胞对营养物质的摄取和对外来物质的内吞需要内化才能够完成其生物学功能。内化可通过两种方式进行：①需要网格蛋白（clathrin）或包被蛋白的参与，如图20-1所示。②无网格蛋白和包被蛋白的参与，需借助细胞膜的内陷发生内化。由网格蛋白参与的内化过程为：受体与相应的配体结合后，原先呈弥散分布的受体几分钟内就以受体配体复合物的形式成簇（clustering），聚集在细胞凹陷处，网格蛋白聚集到凹陷的胞质面上，形成包被小窝（coated pit）；在多种胞内成分Ⅰ型包被蛋白复合物（coat protein complexⅠ，COPⅠ）和COPⅡ参与下，包被小窝逐渐内陷，形成早期内体（early endosome），晚期内体（late endosome），随后与溶酶体融合，释放其配体，受体既可以在溶酶体中彻底分解，也可参与其自身的再循环（recycling）；在溶酶体内的配体可被分拣到高尔基复合体，使其在高尔基体被修饰。其中受体再循环的意义有人认为与配体调节功能有关，认为受体再循环有利于物质的转运，如LDL对血脂的运输作用；但也有人认为与配体功能无关，如胰岛素的抗体片段（Fab）也可引起胰岛素受体内化。非网格蛋白参与的内化，借助于一种称为caveolae 的小窝结构，其聚集了多种糖基肌醇磷脂（GPI）锚定蛋白，需许多受体介导，如 CD14、CD55、CD59、CD48等，一旦与配体结合后，随即就关闭掉其细胞膜外侧，形成与质膜相连的小泡，其中浓缩了多种信号分子进行跨膜转运，这一过程也称为胞饮作用（pitocytosis）。小泡内陷也形成内体，随后结合到溶酶体或高尔基体，再进一步分拣。内化过程中所形成的内体的去向也存在差异，有的与溶酶体融合，有的内化到高尔基复合体上。配体和受体内化到相应目的地后也会出现不同的结局，有些受体会返回到细胞膜参与再循环；有的受体和内化物质会在细胞器中被降解或被修饰，失去原来的生物学功能，如到达溶酶体后被溶酶体内酸性环境中的酶水解，或到达高尔基体发生磷酸化或去磷酸化、酰基化﹑糖基化、羟基化等修饰反应，使内吞物质的生物学活性发生改变，或再分拣到其他细胞器，如到溶酶体发生酶解。内毒素进入机体后，与血浆中有关的蛋白质如LBP和HDL等血浆脂蛋白结合，LBP和LPS形成LPS-LBP复合物，进而将LPS转运到中性粒细胞和巨噬细胞上的多种受体上，如与mCD14，CD11/CD18、清道夫受体、选择素样受体、衰变加速因子（CD55）等受体结合，甚至可以直接结合到TLR4 上，随后LBP与LPS发生分离。LPS通过这些受体发生内化活动，进入细胞膜内，如mCD14与单体LPS发生分离后，单体LPS内化到高尔基体内，并可能引发激活效应，而LPS的聚集体和mCD14则同时进入溶酶体。中性粒细胞、单核-巨噬细胞以及树突状细胞的溶酶体内存在酰基羧基水解酶（acyloxyacyl hydrolase，AOAH），能够将LPS中的3-羟基十四烷酸酰化基团水解，形成脱酰基脂质A（deacylationlipidA）。由于职业性吞噬细胞（中性粒细胞、巨噬细胞）吞噬能力强，易于观察；而且其溶酶体丰富，与解毒效应的关系极其密切，故实验多以巨噬细胞株为研究对象。在单核-巨噬细胞和中性粒细胞中，LPS中的脂质A可以在溶酶体发生脱酰基化deacylation，在脱酰基化的基础上还可以发生去磷酸化反应，使LPS形成单磷酸脂质A ⅣA（4' -monophosphoryllipid A ⅣA），后者的毒性较前者显著降低，表现出机体的解毒机制。

内毒素在细胞内的解毒和清除涉及内化过程，机体的信号转导也可能涉及内化活动，目前对内化和激活及其关系的看法尚存在争议，但多数学者倾向于内化与激活是分离的。LPS的生物学活性大部分是由脂质A产生。脂质A以糖胺双糖（glucosamine disaccharide）为骨架，共价连接着磷酸基团、脂肪酸、多糖链。典型的LPS分子为4个3-羟基十四烷酸（3-hydroxytetradecanoate，3-OH-14：O）直接连接在糖胺双糖上，如沙门菌（Salmonella）和大肠杆菌（E.coli）。3-OH-14：O上的—OH残基与非羟化的脂肪酸发生酯化反应，其中脂肪酸主要为十二烷酸和十四烷酸。因此，脂肪酸与糖胺共价连接就产生酰基酸基结构（acyloxyacyl structure）。连接到糖胺上的3-OH-14：O是LPS具有生物学活性所必需的，无3-OH-14：O结构的脂质A，其生物学活性会大大降低。脂质A活性与其空间构象关系密切，具有锥体（conical/concave shape）立体结构的LPS分子，即在其X线衍射图中疏水区的横切面大于亲水区的横切面，其毒性强；而具有圆柱形（cylindrical shape）或板层状（lamellar shape）立体构象的LPS 分子，即在X线衍射图中疏水区的横切面小于或等于亲水区，则可表现出部分拮抗剂的效应。原因可能为脂质A在插入单核细胞的胞膜时，其圆柱立体型结构阻止与信号蛋白质进行相互作用，但这种观点未达成共识。也有学者认为应该抛弃脂质A插入单核细胞膜上的观点，因为LPS只需直接与TLR4发生密切物理接触，诱使TLR4的胞质结构域发生构象改变，为其下游分子提供锚定位点，引出酶学级联反应，活化多个转录因子，如AP-1、NF-κB、Jun以及STAT等，促使多种炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、NO、环氧化酶等表达，而与LPS内化不存在必然的联系；同时，TLR4也能够自身激活，这可能与自身免疫性疾病的发生有关。在树突状细胞中也有酰基羧基水解酶（acyloxyacyl hydrolase，AOAH），同样可以发挥解毒效应。

在严重的炎症反应中，过度消耗抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）能进一步增加蛋白水解能力，而这一反应能通过加入外源性的、有效的凝血酶抑制剂而减轻。除了动物实验之外，临床研究也证实，对重症患者通过补充AT-Ⅲ凝血酶抑制剂有改善出凝血系统功能的作用。但只有在AT-Ⅲ水平明显高于正常水平时才能干扰巨噬细胞来源的炎症反应，即不仅改善血管内凝集反应，同时也改善器官功能。Inthorn等对败血症患者进行了前瞻性的随机研究，以期增加AT-Ⅲ抑制剂的活性至正常的120%以上。为达到此剂量，他们将AT-Ⅲ浓缩物每天2次给患者静脉注入，连续21天，在整个观察期内每天⒉次测血样。研究发现，在诊断为败血症后，早期给予足够剂量的AT-Ⅲ替代物能明显提高患者的存活率。在AT-Ⅲ治疗的存活患者，前血管舒缓素水平持续增高50%，而未存活患者其水平降低20%。凝血酶原也有类似表现，AT-Ⅲ治疗存活的败血症患者10天内凝血酶原为正常的80%，而濒死患者同期的血浆凝血酶原水平仅为正常的60%。循环中高浓度的AT-Ⅲ抑制剂的活性作用被Emerson等证实。只有在非常高的剂量情况下（正常的3倍）和预防性地给予AT-时能预防器官损伤并增加实验动物的存活率。联合给予AT-Ⅲ和aPI能协同提高肺功能，作用较单用任一药物为好。

既然多形核白细胞（PMN）弹性硬蛋白酶在休克相关的器官和止血功能衰竭中起重要作用，因此，许多研究者认为弹性硬蛋白酶抑制剂可作为针对急性炎症时蛋白水解诱导的发病机制的有效治疗手段。1、FR134043Fujie等研究了弹性硬蛋白酶抑制剂FR134043对PMN弹性硬蛋白酶的释放及其在急性炎症过程中的组织损伤的作用。PMN弹性硬蛋白酶降解细胞外基质成分并与炎症状态下的组织损伤有关。FR134043能明显抑制弹性硬蛋白酶的活性。气管内给予FR134043能抑制内毒素诱导的酶，但仅能抑制52%的酶。2、ONO-5046Haga等研究发现，PMN弹性硬蛋白酶抑制剂ONO-5046.Na能减少内毒素刺激下人类单核细胞产生的前炎症介质。他们研究了体外无PMN的系统中ONO-5046.Na对前炎症介质的作用。实验中前炎症介质产生的测定是通过测量培养上清液中细胞因子的水平进行的。研究发现，ONO-5046.Na 在10-9至10-7mol/L水平之间能显著抑制IL-1β和IL-6的产生，10-9至10-4mol/L水平之间的ONO-5046.Na能显著抑制TNF-α的产生。这些结果提示，临床可达到浓度的ONO-5046.Na能抑制单核细胞产生细胞因子，此药物可作为炎症组织破坏时PMN和单核细胞的双重抑制剂。Kudoh等发现，ONO-5046能减弱内毒素血症时肝脏线粒体的功能障碍。ONO-5046与肝脏线粒体氧化磷酸化的作用有剂量相关性。用30mg/（kg·h）剂量的ONO-5046能使内毒素引起的下降的平均动脉压提高。他们认为，ONO-5046能减轻内毒素引起的肝脏线粒体功能障碍可能与增加肝脏血流有关。3、弹性硬蛋白酶抑制剂作为败血症及MOF的治疗手段Yamano等研究了PAF受体拮抗剂和PMN弹性硬蛋白酶抑制剂对蛙皮缩胆囊肽（cerulein）和内毒素引起的鼠的MOF的保护作用。他们在蛙皮缩胆囊肽诱导的胰腺炎鼠的腹腔内注射30mg/kg的内毒素，制造MOF模型，发现：有或无胰腺炎的鼠内毒素的量和死亡率之间呈正相关;无胰腺炎鼠的内毒素致死剂量是30mg/kg。PAF受体拮抗剂和PMN弹性硬蛋白酶抑制剂能降低MOF鼠的死亡率，提示PAF和弹性硬蛋白酶在MOF的发生中起重要作用。实验鼠的研究结果与MOF患者一致，因此，PAF受体拮抗剂和PMN弹性蛋白酶抑制剂可能可作为一种治疗手段应用于临床。4、在实验性败血症/内毒素休克中抑制PMN弹性硬蛋白酶对于幼猪大肠杆菌感染败血症的初步研究发现，预防性地给予相对特异性的重组弹性硬蛋白酶抑制剂eglin c可导致AT-Ⅲ和其他血浆蛋白质消耗的显著减少，同时肺组织间隙水肿明显减轻。Siebeck等进一步研究发现，eglin c尚能减轻大肠杆菌感染败血症猪的低血压和高毛细血管通透性。在此研究中发现，给入eglin c后，弹性硬蛋白酶-PMN细胞蛋白酶抑制剂（LNP1）复合物在血浆中的水平明显降低，提示外源性的弹性硬蛋白酶抑制剂与粒细胞来源的血浆蛋白酶拮抗剂（LNP1）之间的快速竞争机制。eglin c引起的快速竞争机制比内源性的抑制剂能更有效地抑制释放的弹性硬蛋白酶的蛋白水解活性。另外，Siebeck和Hoffmann等研究发现，除了eglin c，凝血酶特异性抑制剂水蛭素（另一种重组的抑制剂）也能显著增加内毒素休克的生存率。预防性地给予水蛭素能减少内毒素休克动物的纤维蛋白原的消耗、纤维蛋白单体的产生，肺血管收缩的发生以及PMN成分的释放。其炎症过程可能主要是通过释放巨噬细胞蛋白酶和反应性的氧代谢产物而维持的。

Koyama等研究了蛋白酶抑制剂调节支气管内皮细胞对内毒素的反应。内毒素能刺激多形核白细胞（PMN）趋化黏附，并通过乳酸脱氢酶的释放诱导支气管内皮细胞的细胞毒性。内毒素能抑制支气管内皮细胞的聚集。几种结构和功能不同的蛋白水解酶抑制剂，如α1蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂、两种氯甲酸酮衍生物和PMN弹性硬蛋白酶抑制剂L-658、758，均能减弱PMN趋附活性，减少乳酸脱氢酶的释放。α1蛋白酶抑制剂能减弱内毒素对支气管内皮细胞聚集的抑制作用。他们认为，支气管内皮细胞对内毒素的反应包括激活细胞的蛋白水解活性。Knoell等研究认为，α1抗胰蛋白酶（α1-AT）和蛋白水解酶络合物是由单核细胞内毒素、IL-1β和TNF-α所产生。他们发现，α1-AT的局部调节作用在维持炎性细胞微环境蛋白水解酶和抗蛋白水解酶的平衡中起重要作用。他们将从正常健康志愿者中提取出的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分别给予内毒素、IL-1β和TNF-α，然后分别测定上清液中α1-AT的浓度。与无刺激因素的正常上清液（147±19μg/L）相比，LPS（439±66μg/L；P≤0.001）、IL-1β（263±37μg/L；P≤0.01）和TNF-α（316±59μg/L；P≤0.05）导致α1-AT的浓度增高2~3倍。局部炎症条件能使单核细胞产生的a-AT增加，并使PBMC 来源的蛋白水解酶增加。

Tkalcevic等研究发现，缺乏多形核白细胞（PMN）弹性硬蛋白酶和组织蛋白酶B时小鼠免疫受损并对内毒素的抵抗增加。研究发现，缺乏PMN弹性硬蛋白酶和（或）组织蛋白酶B的小鼠对真菌易感。这些蛋白酶的缺乏导致对致死剂量的内毒素的抵抗能力增加，尽管此时已产生正常水平的TNF-α。这些结果表明PMN在宿主免疫和免疫病理中的作用，弹性硬蛋白酶和组织蛋白酶B在内毒素休克级联瀑布中处于TNF-α的下游。对200多例大手术后细菌感染患者的前瞻性临床研究发现，PMN弹性硬蛋白酶释放入外周循环中的量与炎症反应程度相关。无术后感染患者的复合型弹性硬蛋白酶水平仅有短暂的缓和性升高（为正常的3倍），而败血症开始及过程中其浓度增加30倍。持续败血症的患者弹性硬蛋白酶水平持续显著升高直至患者死亡；而恢复期时，弹性硬蛋白酶的水平相应恢复正常。最终死于败血症的患者在出现严重败血症的临床表现前2~3d，复合型弹性硬蛋白酶水平已有显著升高，此后在一过性降低后又明显增高。而存活的患者，PMN弹性硬蛋白酶水平的明显增高与严重感染的临床表现相一致，而恢复期弹性硬蛋白酶水平的下降早于临床表现的好转。在25例结肠手术患者中，12例复合型弹性硬蛋白酶水平升高，且术后第5天该指标仍显著升高，在临床证实并发症前3d即可预示感染的发生。另一研究组研究了56例腹部手术患者，其中31例患者血浆弹性硬蛋白酶水平在手术过程中升高3倍，而术后早期发生败血症的患者其水平升高5倍以上；10例经历败血症但存活的患者复合型弹性硬蛋白酶水平持续下降，并与无败血症的患者之间无明显区别；而死亡患者术后弹性硬蛋白酶水平持续明显升高。因此，不少学者认为长期持续的PMN弹性硬蛋白酶水平升高高度提示败血症情况的严重恶化。最近，Tanaka等用一周时间比较了16例合并多器官功能衰竭（MOF）的感染性休克患者与30例继发于严重外伤的失血性休克患者的每日血浆弹性硬蛋白酶水平。他们发现，败血症患者休克期持续超过7d，而外伤后失血性休克患者24h 内即恢复。败血症休克患者复合型弹性硬蛋白酶水平升高至正常的8倍，并在整个一周中维持高水平；失血性休克患者弹性硬蛋白酶水平也可升高至正常的6倍，但在恢复期很快降至正常。Speer和Tegtmeyer等研究了新生儿败血症和其他新生儿疾病，结果用升高的复合型弹性硬蛋白酶水平诊断败血症发生的敏感度为95%，特异度为81%。Tsaka和 Herkner等对135例新生儿的研究也得出类似结论。另外，在致死性的感染过程中，单核细胞及巨噬细胞来源的组织蛋白酶B与PMN弹性硬蛋白酶的释放方式相似，提示溶酶体半胱氨酸蛋白水解酶的释放可能会增强细胞外蛋白水解能力。Tanaka等还发现，血浆复合型弹性硬蛋白酶水平的升高与血浆纤维连接素（fibronectin）和XⅢ因子水平的降低相关。支气管肺泡灌洗液中弹性硬蛋白酶的活性与败血症休克患者的呼吸指数也相关。提示败血症和MOF的疾病组织损伤可能与PMN弹性硬蛋白酶的破坏作用部分有关。Shimanuki等也发现血浆复合型弹性硬蛋白酶水平和呼吸指数之间的显著正相关性，49例接受不同强度外科手术应激的患者，随手术刺激的增大，血浆PMN弹性硬蛋白酶水平也相应增高，术后肺综合征也越严重。

脓毒血症传统上被认为是器官对革兰阴性细菌的系统性炎症反应，导致感染性休克并最终导致多器官功能衰竭。有趣的是，由创伤或感染引起的多器官功能衰竭最后的共同通路非常相似，包括基本相同的激素和细胞依赖的介质。其中，蛋白水解酶系统被认为在脓毒血症和创伤诱导的炎症反应过程中起到相当重要的作用。若在创伤或脓毒血症时，巨噬细胞被激活、裂解并大量释出溶酶体、丝氨酸蛋白水解酶、弹性硬蛋白酶和原发的炎性细胞半胱氨酸蛋白水解酶、组织蛋白酶B和L。而激活这些炎症反应过程的初始机制在不同情况下各不相同。细菌内毒素和其他细菌产物如外毒素，N-甲酰化肽、细菌蛋白水解酶和抗原-抗体复合物被认为是感染引起的炎症反应的有效刺激剂。Rukmini 等研究色林吉亚克利丝多杆菌属δ内毒素及蛋白酶在前毒素转化为毒素过程中的作用发现，色林吉亚克利丝多杆菌属δ吲哚前毒素转化为有毒性的毒素是通过胰蛋白酶介导的。Maeda等研究发现，大多数细菌和真菌排泄至感染宿主的蛋白酶与疼痛、水肿至细菌易位的发病机制均有关，直至发生败血症。这些现象的基本机制在于激肽的产生。一些细菌的蛋白酶还能激活其他宿主的蛋白酶原，如纤维蛋白溶酶原、前胶原酶和凝结系统的前酶原。一些细菌蛋白酶尚可激活细菌毒素。它们还能降解免疫球蛋白和补体系统的成分并辅助微生物的繁殖。总之，微生物的蛋白酶有助于严重疾病的发展。而细菌细胞壁的成分内毒素本身也能激活缓激肽的生成环。Suntres等研究了鼠微脂粒包埋的地塞米松对内毒素诱导的肺损伤的作用。用内毒素处理的动物发生肺损伤表现在肺重量的增加以及肺血管紧张素转化酶和碱性磷酸酶活性的降低，后两者分别是肺毛细血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型细胞的标志。另外，内毒素可导致细菌磷脂酶A（磷脂酶A2）、血栓烷B（血栓烷B2）和白细胞三烯B（白细胞三烯B4）浓度的明显上升。内毒素还能增加肺髓过氧化物酶和弹性蛋白酶的活性以及增加氯胺的浓度，提示有中性粒细胞的浸润和炎症反应的激活。而预先给予地塞米松能明显减轻肺的炎症反应和其他肺损伤。Lorenzen等研究发现，致病性的奈瑟菌属的辅酶及免疫球蛋白A1蛋白水解酶是前炎症介质的有效诱导剂。他们发现人类致病性的奈瑟菌属的特征是产生和分泌一种IgA1特异性的色氨酸蛋白水解酶（IgAl蛋白水解酶）并优先分解人类IgA1和其他靶蛋白。天然的IgA1蛋白水解酶的显著功能是使外周血单核细胞产生前炎症介质如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。在T淋巴细胞存在的前提下，IgA1蛋白水解酶使单核细胞产生细胞因子的反应增强。IgA1蛋白水解酶并没有诱导调节性细胞因子IL-10的作用，而内毒素和植物凝集素能诱导IL-10。他们发现，IgAl蛋白水解酶有重要的免疫刺激作用，并通过诱导TNF-α和其他前炎症介质的大量产生而与奈瑟菌属感染的发病有关。Witter等研究发现，内毒素对昆虫细胞的刺激需要细胞释放的蛋白水解酶的活性。鳞翅目昆虫血细胞对细菌内毒素的反应依赖于巨噬细胞的反应并与溶菌酶的释放有剂量依赖关系。在给1g/L的内毒素后，细胞培养上清液中蛋白水解活性明显增强。这种蛋白水解作用是由于细胞释放的蛋白水解酶所引起的，并对细胞的激活十分必要。内毒素激发的蛋白水解活性是激活过程的一个重要组成部分，它在细胞外发生并呈递免疫反应激活因子。尽管近期的研究认为半数以上的脓毒血症患者的病因并不是革兰阴性细菌感染，但对革兰阴性细菌细胞壁LPS的作用仍被广泛研究。实验动物和人类脓毒血症休克反应的区别主要在于蛋白水解酶和其内源性抑制剂。有关临床研究已发现蛋白水解酶，尤其是多形核白细胞弹性硬蛋白酶和组织蛋白酶B在人类脓毒血症中的作用。

外周给入内毒素能诱导脑介导的反应，包括激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）和体温调节的变化。对体温调节的作用是综合性的，包括巨噬细胞依赖的高热反应和低热反应。给入小剂量内毒素能激活外周血巨噬细胞产生IL-1β，后者进入循环中作为激素信号。IL-1通过中间隆突的有孔的内皮细胞刺激促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）从CRH神经终端释放；IL-1还能激活脑内皮细胞产生并释放IL-1、IL-6和前列腺素等，这些物质通过旁分泌作用可影响神经元（如CRH神经元）或作用于小神经胶质细胞，表现为IL-1诱导的IL-1产生并放大和延长细胞内的IL-1信号。相反﹐给入大剂量内毒素可能直接刺激内皮细胞产生IL-1、IL-6和前列腺素E2（PGE2），从而以巨噬细胞依赖方式激活HPA轴。Ma等发现，外周血给予大鼠内毒素后15min即可发现脑细胞外液中IL-1β浓度增加，30min后从HPA轴释放的激素增加。可见，下丘脑细胞外液中IL-1β浓度的改变早于HPA轴的激活。但关于内毒素和IL-1能激活HPA 轴以及脑去甲肾上腺素和蚓噪胺的代谢的观点仍存在争议。Dunn等研究鼠IL-1受体拮抗剂对IL-1和内毒素诱导的HPA 轴的激活和脑生物源胺的作用后认为，IL-1对腹膜内注入内毒素后的HPA轴或神经化学反应无调节作用，而中枢神经系统中的IL-1对腹膜内注入IL-1有反应，但对腹膜内注入内毒素或静脉内注入IL-1无反应。Lenczowski等研究发现，腹膜内注入内毒素或IL-1β能激活HPA轴，但HPA轴对这些刺激的反应存在个体差异。血浆中IL-6的量是决定HPA轴对腹膜内注入内毒素及IL-1β的反应存在个体差异的主要因素。IL-6可能协助迷走神经传入神经信号的产生或增强迷走神经信号传入下一级脑干核。Wang 等认为，IL-6与内毒素和IL-1引起的刺激HPA轴的后期反应有关。另外，Shanks等发现HPA轴对内毒素的反应在哺乳期被减弱。Uribe等认为，NO是一种在脑组织中产生的不稳定气体，并参与控制HPA轴的活性。NO合成酶Ⅰ是脑中合成NO的酶之一，注入内毒素后其作用被增强，但这种改变比内毒素诱导的ACTH的释放要迟。内毒素诱导的HPA轴的激活与侧脑室NO系统的激活有关，并且NO刺激HPA轴对免疫刺激具有调节作用。

神经肽α-促黑激素（alpha-melanocyte stimulating hormone，a-MSH）是前阿片黑皮质素衍化物，是有效的调节体温、炎症和其他急性期反应的调节剂。a-MSH能拮抗几种刺激引起的发热反应，包括内毒素、内源性致热源和细胞因子。输入大剂量内毒素后，兔血浆a-MSH浓度增加，但在人类中是否有类似反应尚不明确。Catania等研究内毒素引起的人类急性炎症情况下血浆α-MSH的变化时发现，内毒素给入后体温上升程度与血浆a-MSH升高程度平行。5例发热程度高者（升高>2.6℃），循环α-MSH升高2~4倍；而发热程度低者（升高℃），a-MSH不升高。内毒素给入后血浆ACTH值也升高，但其升高程度与体温上升程度不相关。Martin等为了研究在中枢神经系统中α-MSH是否能拮抗I-6和TNF的致热作用，将细胞因子分别与或不与α-MSH（200ng）注入兔侧脑室中，并持续测量直肠温度。研究结果与以往观察到的α-MSH的解热效果一致，即给入细胞因子后再给予α-MSH，能显著降低体温。可见，a-MSH在脑中能拮抗特异性细胞因子的致热作用，提示中枢给予α-MSH能降低体温。因此，α-MSH在中枢神经系统体温调节方面起重要作用。现已明确，中枢神经源性的影响可调节外周炎症，如α-MSH能减轻皮肤的急性炎症，Delgado等进一步研究了对于内毒素鼠中枢给予α-MSH是否能减少系统炎症的表现，发现中枢给入小剂量α-MSH能调节内毒素引起的TNF-α和NO的升高，a-MSH还能调节肺和肝脏iNOS活性和 iNOS mRNA水平。肺的髓过氧化物酶活性是一种中性粒细胞浸润的标志，在内毒素鼠中升高，中枢给入α-MSH后，鼠肺髓过氧化物酶含量下降。阻断中枢α-MSH后，内毒素引起的前炎症介质在外周血、肺组织和肝脏组织中的含量显著升高。由以上结果，他们推断α-MSH触发的神经源性的抗炎作用能用于治疗系统性炎症。Catania等的研究证实了上述发现。Delgado等还发现，除了其中枢影响外，a-MSH尚具有对外周宿主细胞的抑制作用﹐能减少前炎症介质的释放。α-MSH能降低人中性粒细胞的趋附能力，减少TNF-α和NO的产生。体外研究发现，a-MSH能抑制感染时TNF-a、IL-1β和IL-8在全血中的释放。因此，用包括a-MSH的抗炎剂减少外周宿主反应或抑制中枢神经系统的炎症前信号可提高抗炎效果。a-MSH的免疫调节作用已被广泛认识。a-MSH能拮抗许多前炎症介质的活性，如IL-1、IL-6、TNF-α和细菌内毒素。Catania等研究了α-MSH在系统性炎症患者中的内源性浓度和抗细胞因子作用，发现血浆α-MSH和TNF浓度之间呈负相关，在内毒素刺激的全血样本中加入α-MSH 能以浓度依赖方式抑制TNF-α和IL-1β的产生。在体内，a-MSH已被证明能抑制鼠的接触高敏反应并诱导半抗原特异性耐受。Becher 等进一步研究发现，α-MSH可通过改变抗原呈递细胞的功能而起到免疫抑制作用。a-MSH和其C末端三肽a-MSH 11～13能调节前炎症介质的产生并抑制炎症反应。Wong等研究发现，α-MSH及其抗炎的—COOH末端三肽能抑制内毒素诱导的人神经胶质瘤细胞中TNF-α的产生，并认为a-MSH在神经胶质瘤细胞中的抗细胞因子作用可能由黑皮质素受体调节。Ichiyama等研究了在内毒素诱导的鼠脑炎症模型中a-MSH和a-MSH 11～13是否抑制核因子NF-κB的激活，而后者对表达前炎症介质十分重要。免疫电泳发现a-MSH能抑制NF-κB的激活，Western blot分析提示这种抑制作用与α-MSH诱导的在脑中持续表达胞质抑制剂IκB-α蛋白有关。a-MSH对NF-κB和IκB-α的作用与事先给予α-MSH 11～13有关。这些结果提示，脑急性炎症诱导的NF-κB的激活能被a-MSH所抑制。Ichiyama等进一步发现，a-MSH可调节脑组织和外周炎性细胞中前炎症介质的产生，这些前炎症介质的转录基因受NF-κB调节，NF-κB同样也能被前炎症介质激活。IκB-α蛋白的降解导致NF-κB的激活。因此，α-MSH在中枢神经系统炎症中的抗炎作用是通过肽诱导的抑制IκB-α蛋白降解从而激活NF-κB而调节的。Huang等研究了外源性和内源性的α-MSH对内毒素诱导的厌食和发热之间的关系，发现：脑室内注入两种剂量（30ng和300ng）的α-MSH均能增强内毒素对食物摄入的抑制作用，高剂量的α-MSH还能缓解内毒素引起的发热；对照组鼠无内毒素负荷，仅高剂量的α-MSH显著抑制食物摄入，而体温和活动力均不受影响。总之，a-MSH 是内源性TNF-α的神经免疫调节肽，能减轻发热并抑制所有类型的实验性炎症。在人类，a-MSH的浓度在炎症部位和内毒素感染后的炎症血浆中增加，其抗细胞因子作用通过α-MSH受体以及调节循环巨噬细胞和中性粒细胞介导，还通过抑制来源于中枢神经系统α-MSH受体的神经抗炎通道起作用。α-MSH对多种类型的炎症有效，包括实验性炎症性肠病、CNS缺血-再灌注损伤和细菌内毒素诱导的脑炎。α-MSH有多种调节早期炎症反应的作用，a-MSH的抗炎作用主要有以下三种机制：抑制炎症介质的产生或抑制外周宿主细胞的炎症作用；抑制脑中作用于黑皮质受体诱导的外周炎症；通过肽的局部作用抑制中枢神经系统的炎症。α-MSH的抗炎效果，尤其是α-MSH 1～13和其-COOH末端三肽α-MSH 11～13已被确定。a-MSH在所有主要类型炎症中的有效作用提示神经肽在炎症过程中起重要作用。

上个月，科德角国际生物医学科技（北京）有限公司举办了第一期细菌内毒素检测技术应用及PKF细菌内毒素定量检测系统实操培训（点击查看详情），获得了技术人员的热烈反响和一致好评。为了进一步满足学员需求，科德角国际第二期细菌内毒素检测技术应用及PKF细菌内毒素定量检测系统实操培训来啦！本期实操培训，旨在通过一系列理论学习和实践操作，深化学员们的细菌内毒素检测知识储备，提升细菌内毒素检测的应用能力，让细菌内毒素检测变得更简单、高效。科德角国际第二期细菌内毒素检测技术应用及PKF细菌内毒素定量检测系统实操培训报名正式启动，诚邀广大细菌内毒素检测相关人员踊跃报名参加！一、培训组织主办单位：科德角国际生物医学科技（北京）有限公司协办单位：北京阿克庇斯医药有限公司二、培训对象（一）各省 （区、市）药品审评中心、核查中心、药检（院）所相关人员；（二）制药企业、研发公司、CRO 公司、高等院校、科研院所等相关专业人员。三、培训时间培训时间：2023年7月19日-2023年7月20日四、培训地点科德角国际生物医学科技（北京）有限公司北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地华佗路50号院18幢五、培训内容※本次培训结业学员，将颁发培训合格证书。六、培训讲师尹雪雁 科德角国际技术主管 秦焕甲 科德角国际高级应用工程师七、公司荣誉细菌内毒素检测实验室ILPQ国际能力认证  中国食品药品检定研究院能力验证结果报告通知单  2022年度细菌内毒素LGC能力验证八、实验环境九、报名方式扫描下方二维码进行报名▲扫描二维码进入报名页面十、联系方式官网：www.bio-life.cn  www.acciusa.cn电话：400-687-6881手机：18701356057    邮箱：info@bio-life.cn地址：北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地华佗路50号院18幢科德角国际生物医学科技(北京)有限公司北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地华佗路50号院18号楼2层策划丨科德角国际·市场部编辑丨Carrie·Tse校对丨Zoe·Yin,Feng

 “第二十一届世界制药原料中国展”暨“第十六届世界制药机械、包装设备与材料中国展”（CPHI &PMEC China 2023）将于6月19日-6月21日在上海新国际博览中心（浦东）举办。科德角国际生物医学科技（北京）有限公司受邀参展。  届时，科德角国际将携带PKF细菌内毒素定量检测系统、动态浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、凝胶法鲎试剂、重组鲎试剂等产品出席本届大会，我们的展位号是E7G61，欢迎您前来与我们共同探讨细菌内毒素检测的应用与发展。 展位指引平面图本届展览规模达20万平方米，突破3,300余家中外参展企业，与海内外观众共同拉开“国内国际双循环”医药贸易序幕。此外，80+精彩会议活动将辐射制药全产业链热点，邀请行业专家分享政策更新、市场准入、技术创新等实用性话题，为企业实施战略部署、开拓国际商机提供有效支撑。 展会信息参展时间：2023年6月19日-6月21日展位地址：上海新国际博览中心（浦东）展位号：E7G61

血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）可诱导肺水肿。Falk等用无血灌注和通气的鼠肺进行研究时发现，PAF能增加肺重量约0.59±0.18g；另外还发现，喹啉能减少血栓烷和TNF形成，减少PAF诱导的血管收缩和支气管收缩，并减少PAF和内毒素诱导的肺水肿。因此，推断PAF诱导的肺水肿包括两种不同的机制：一种依赖于环氧合酶的代谢；另一种对喹啉敏感。Goldsmith等研究灌注的鼠肺后发现，注入内毒素能显著增加PAF引起的肺动脉高压的程度。对缓冲剂灌注的鼠肺在5nmol/L PAF基础上用不同剂量的内毒素（0、1、10μg/L）灌注，2h后测定肺动脉压力。无血浆时，10μg/L剂量的内毒素能增加肺动脉高压的程度，而1g/L剂量的内毒素无效；有血浆灌注时，仅1μg/L剂量的内毒素就能显著增加5nmol/L PAF引起的肺动脉高压。他们认为，血浆成分可能是内毒素结合蛋白质和可溶性CD14（一种有效的内毒素初始成分），导致对PAF引起的肺动脉高压的扩大反应。血浆蛋白质可降低内毒素引起肺反应的阈值，并可能在内毒素诱导急性肺损伤的发病机制中起重要作用。

血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）可诱导肺水肿。Falk等用无血灌注和通气的鼠肺进行研究时发现，PAF能增加肺重量约0.59±0.18g；另外还发现，喹啉能减少血栓烷和TNF形成，减少PAF诱导的血管收缩和支气管收缩，并减少PAF和内毒素诱导的肺水肿。因此，推断PAF诱导的肺水肿包括两种不同的机制：一种依赖于环氧合酶的代谢；另一种对喹啉敏感。Goldsmith等研究灌注的鼠肺后发现，注入内毒素能显著增加PAF引起的肺动脉高压的程度。对缓冲剂灌注的鼠肺在5nmol/L PAF基础上用不同剂量的内毒素（0、1、10μg/L）灌注，2h后测定肺动脉压力。无血浆时，10μg/L剂量的内毒素能增加肺动脉高压的程度，而1g/L剂量的内毒素无效；有血浆灌注时，仅1μg/L剂量的内毒素就能显著增加5nmol/L PAF引起的肺动脉高压。他们认为，血浆成分可能是内毒素结合蛋白质和可溶性CD14（一种有效的内毒素初始成分），导致对PAF引起的肺动脉高压的扩大反应。血浆蛋白质可降低内毒素引起肺反应的阈值，并可能在内毒素诱导急性肺损伤的发病机制中起重要作用。

各种细胞均能产生血小板激活因子（platelet activating factor，PAF），包括巨噬细胞、多形核白细胞、血小板、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞、肥大细胞和内皮细胞以及肾脏内的各种细胞。但不知在体内哪一种细胞对PAF的产生起主要作用。在正常生理状态下肾脏可产生少量PAF，但其他细胞如炎性细胞在某些病理状态下对PAF的含量可能产生主要影响。Dupuis等研究发现，在小剂量的内毒素刺激下﹐新鲜分离的人类单核骨髓细胞和髓基细胞培养后可产生PAF，髓基细胞产生的PAF量为单核骨髓细胞的50倍，提示髓基细胞可能是人类PAF的一个重要来源。PAF的生成始于磷脂酶A2对膜结合磷脂的作用，局部钙离子浓度增加可激活磷脂酶A2，生成花生四烯酸；并通过一种乙酰辅酶A依赖性乙酰转移酶形成PAF。PAF的生成与花生四烯酸代谢密切相关（图17-1）。磷脂酶Az抑制剂如三氟拉嗪酸和前列环素均能抑制PAF的生成。同样，选择性抑制花生四烯酸代谢而不阻碍PAF的生成也是可能的。对PAF生成的刺激较为明了。巨噬细胞在吞噬调理过的颗粒（如酵母菌多糖）时产生PAF。人和兔的中性粒细胞在吞噬C3b、免疫球蛋白包被的颗粒或免疫复合物时释放PAF；用天然C5a，脱精氨酸的C5a或中性粒细胞阳离子蛋白刺激中性粒细胞时也能释放PAF。人类血小板释放PAF是在凝血酶诱导其聚集时，而人内皮细胞与凝血酶、血管升压素或血管紧张素Ⅰ作用后才形成PAF。钙离子载体A23-187是人血小板、内皮细胞、分离的肾小球、肾髓质细胞和培养的系膜细胞生成PAF的一种非特异性刺激物。血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）生成途径什么因素能控制PAF释放?实验证实，虽然内皮细胞经过适当刺激能生成PAF，但释放PAF却不需要刺激。McIntyre等人证明，在刺激内皮细胞时，PAF和前列腺素的生成是相伴随的，然而即使前列腺素已释放到上清液中，PAF仍以完整的细胞结合形式存在。或许只有损伤的细胞才将PAF释放出来。内毒素可以导致PAF和一些细胞因子如TNF、IL等的释放。Novo等发现，在腹膜炎鼠模型中，血清内毒素水平高的，其PAF水平也相应增高。PAF是有力的磷脂介质。细胞外PAF通过与特异性膜受体结合来发挥其作用。这种受体可能是一种蛋白质，已证实存在于血小板、中性粒细胞和兔回肠上。PAF受体结合导致快速的、可逆转性细胞内钙离子浓度增加。钙的来源可能是细胞外钙的流入和细胞内存钙的释放。PAF诱导的细胞内钙增加能激活磷脂酶，并导致花生四烯酸和细胞内PAF的形成。PAF能增加细胞黏附性，并通过直接影响或通过形成毒性氧和（或）花生四烯酸激活内皮细胞。PAF和一些细胞因子之间的相互作用导致自身催化的炎症介质的释放，依据靶细胞的不同，可导致血栓烷、白细胞三烯、前列环素或其他前列腺素类的产生。

血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）是一种新的磷脂介质，在免疫刺激和非免疫刺激下，通过许多类型的细胞和组织释放，经磷脂酶A2和乙酰转化酶作用而产生，与特异性结合位点结合而激活细胞。PAF抑制很大范围的生物学和药理学活性，导致血小板和中性粒细胞聚集、嗜酸粒细胞趋化、支气管痉挛、血压降低和急性肾功能衰竭。另外，PAF在移植急性排斥反应、内毒素休克和胃肠溃疡中均起作用。更进一步的是，它模拟支气管哮喘的发病机制并能产生炎症中的许多现象。另外，几种PAF受体拮抗剂能减轻感染程度，将来可进一步研究用这些拮抗剂清除PAF在人类疾病中的作用。1970年，Henson观察到激活的白细胞可释放一种可以刺激血小板释放反应的“液相介质”，这种成分被鉴定为乙酸甘油醚磷酸胆碱（AGEPC），并被称为血小板激活因子（PAF）。以后又发现PAF除具血小板激活作用外，还具有各种不同的生物学和药理学作用谱。到目前为止，它是已发现的最有效的自分泌物质，纳克水平的PAF即可产生极明显的生理变化。

Coffee等的研究揭示，较对照组而言，内毒素耐受组大鼠的巨噬细胞不管有无内毒素存在，百日咳毒素和霍乱毒素对它的作用均受到明显抑制。而且，GTP-γ-s对于合成血栓烷B的作用也较对照组受到显著抑制。这种内毒素耐受巨噬细胞对内毒素和G蛋白拮抗剂的抵制反应提示G蛋白功能状态的降低。由于内毒素耐受状态下机体对其他伤害性刺激如肿瘤坏死因子、肾上腺素诱导的休克、血栓烷A2类似物的刺激、心肌缺血-再灌注损伤等产生交叉耐受性，所以G蛋白活性的改变可能具有重要的临床应用前景。G蛋白功能的减低会导致受体信号传输系统以及细胞对各种病理刺激反应的全面减退。内毒素耐受状态下G蛋白功能减低的机制是由于G蛋白分子水平的改变如磷酸化、G蛋白在细胞膜表面的表达减少还是由于中间介质的形成减少仍不确切。G蛋白功能的改变影响细胞内信号传输过程的详情值得进一步研究。

内毒素刺激巨噬细胞中蛋白激酶C的活化，与新的蛋白质的诱导以及细胞因子和类二十烷酸的合成有关。已有越来越多的证据表明这些内毒素诱导的细胞内的系列反应存在互相联系。在RAW264.7细胞系中，脂质A可激活蛋白激酶C。PMA是蛋白激酶C的一种强有力的激活剂，可使内毒素刺激下的鼠腹腔巨噬细胞能显示出相似的但不全相同的蛋白质磷酸化反应。内毒素可诱导巨噬细胞中数种蛋白的十四烷化反应，其中两种是蛋白激酶C的底物。以蛋白激酶C的激活物PMA刺激鼠腹腔巨噬细胞和人类内皮细胞能诱导其产生前列腺素。若以星形孢菌素或氨磺酰异喹啉H7抑制蛋白激酶C则可抑制内毒素刺激下的类二十烷酸的合成。因此，蛋白激酶C的活化似乎在内毒素刺激的花生四烯酸代谢中起一定的作用。然而，蛋白激酶C在内毒素刺激的花生四烯酸代谢中的确切作用并未阐明，只是推测包含蛋白质的十四酰化、PLA2的活化和再酰化的抑制几个环节。已知蛋白激酶C的活化与十四酰富丙氨酸激酶C底物蛋白（MARCKS）的十四酰化、转运和磷酸化过程相连结。内毒素使MARCKS的mRNA合成增加。1988年，Aderem等发现内毒素和PMA两者都诱导鼠腹腔巨噬细胞的相对分子质量为68000的蛋白质的十四酰化和磷酸化，以后确认这种蛋白质即为MARCKS。在对内毒素无反应的C3H/Hej小鼠的巨噬细胞中，尽管MARCKS的数量与内毒素敏感性小鼠C3H/HeN一样，但它既不被十四酰化也不发生磷酸化。这种大鼠对内毒素刺激的类二十烷酸的合成具有抵抗性。蛋白激酶C的多种激活物会造成酰基辅酶A/溶血磷脂酰基转移酶的抑制，对于花生四烯酸掺入细胞膜磷脂也有抑制作用。资料也显示，PLA2的活化是通过激活蛋白激酶C而达到的。尽管蛋白激酶C的激活会增加花生四烯酸合成类二十烷酸的供应量，但并不能单独以这一机制解释。Geisel等的研究使用了放线菌素D以抑制转录，结果使PMA诱导的类二十烷酸合成减少，提示新合成的蛋白质参与其中。在家鼠腹膜巨噬细胞中，内毒素对类二十烷酸合成的刺激需经过2h的延滞期方能达到高峰。如此缓慢的蛋白质合成的激活提示蛋白质的从头合成过程的存在。反之，钙离子载体A23-187或GTP-γ-s 只需15～30min即可最大程度地激活类二十烷酸的合成。目前已经知道内毒素诱导的类二十烷酸合成依赖于在转录和翻译两个水平合成调节蛋白质。证据为，即使以内毒素诱导1h后，放线菌素D和放线菌酮两种抑制剂仍会产生明显的抑制作用。与此不同的是，钙离子载体A23-187对血栓烷B合成的刺激作用并未明显受抑。内毒素诱导的巨噬细胞中蛋白质的从头合成与蛋白激酶C的激活密切相关。内毒素诱导的巨噬细胞中的基因表达与蛋白激酶C激活后的基因表达相类似。评价星形孢菌素抑制蛋白激酶C的效果时，是通过观察它在对蛋白质合成产生抑制的时间段内的作用而进行的。星形孢菌素除了在转录和翻译水平产生抑制作用外，它也可以抑制内毒素诱导的血栓烷合成，即使鼠巨噬细胞与内毒素共同孵育后1h仍能起作用。上述结果表明，内毒素对于花生四烯酸代谢的诱导，既作用于蛋白激酶的活化的过程，也作用于蛋白质的从头合成过程。这种情况下，就需深入研究内毒素刺激蛋白激酶的活化和蛋白质合成的机制的作用点。推测蛋白激酶C可能是通过对组蛋白的磷酸化和（或）拓扑酶Ⅱ活性的调节来调控蛋白质的合成的。上述两个过程均参与蛋白质合成的转录。内毒素能刺激多种癌基因，刺激细胞因子mRNA的转录，还能诱导目前为止其功能尚未阐明的其他6种基因的转录。蛋白激酶C通过在各种细胞中表达细胞因子来体现其中介作用。在人类单核细胞中，蛋白激酶C与血小板活化因子和肿瘤坏死因子相关联；在鼠巨噬细胞中则与白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α相联系；在成纤维细胞则与白细胞介素-1相关。目前有证据表明，环氧化酶的表达也是通过蛋白激酶C达到的，这种对环氧化酶的蛋白质从头合成过程的调节作用在人体内皮细胞、培养的大鼠肠系膜细胞和内皮细胞的实验中均获得证实。Fu和Masferrer等分别阐明，在人体单核细胞和鼠巨噬细胞中，地塞米松可通过抑制内毒素诱导的环氧化酶合成而发挥其药理作用。上述资料表明，环氧化酶及其同工酶的蛋白质从头合成是把蛋白激酶C的活化与类二十烷酸合成连接起来的机制。在内毒素刺激下，其他能增加类二十烷酸合成的蛋白质包括PLA2、磷脂酶活化蛋白和G蛋白。它们中有些蛋白质通过调节PLA2活力和（或）G蛋白来调节内毒素诱导的花生四烯酸代谢。在培养的鼠星形胶质细胞中，内毒素能诱导PLA2合成。在鼠腹膜巨噬细胞，肿瘤坏死因子可促使峰毒肽样的磷酸酯酶激活蛋白的合成。因此，内毒素直接或间接地刺激G蛋白的功能，继而通过它激活蛋白激酶C，随之刺激Px蛋白的合成、转录和翻译。由于在类二十烷酸的合成中PLA2的活化是限速步骤，因此磷酸酯酶的调节对于其可能为内毒素所干扰的许多生化和细胞内过程是必不可少的。

鸟苷酸调节蛋白（G蛋白）水解鸟苷三磷酸（GTP），成为细胞膜表面受体激活剂的偶联机制的中介。Freissmuth等指出，G蛋白可能是受内毒素激活后细胞内信号传输的机制之一。确实，内毒素对白细胞介素-1β转录的介导作用与人体巨噬细胞U937中的Gi2蛋白是相互关联的。同样，内毒素诱导的小鼠P338D1细胞中白细胞介素-1的合成以及刺激大鼠肠系膜细胞中前列腺素E合成均与百日咳毒素敏感性G蛋白相关联。有证据表明，G蛋白调控着PLA2的活性，在内毒素刺激下的大鼠腹膜巨噬细胞花生四烯酸的代谢中起作用。Coffee等阐明了在内毒素刺激的大鼠腹膜巨噬细胞合成血栓烷B和 6-酮基-前列腺素F1α的过程中霍乱毒素、百日咳毒素以及抗水解型GTP类似物和氟化钠的作用。百日咳毒素能不可逆地使ADP糖基化，若以之预处理，对于巨噬细胞的类二十烷酸的基础合成量并无影响，但是能显著抑制内毒素刺激的血栓烷B2和6-酮基-前列腺素F1α的合成。而霍乱毒素则不可逆地使ADP糖基化，若以之预处理，则可使内毒素诱导的血栓烷B2和6-酮基-前列腺素F1α的合成量明显增加，但对它们的基础生成量则无影响。GTP-γ-s是一种稳定的GTP类似物，它可刺激G蛋白的活力，能显著增加血栓烷B2的合成量，也可增加对照组中内毒素刺激的巨噬细胞中血栓烷B2的合成。

在合成类二十烷酸的过程中，从磷酸酯类合成释放花生四烯酸是一个限速步骤。内毒素刺激细胞合成特殊的磷酸酯类，包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI），其主要途径至少有两条。磷脂经磷脂酶A2（PLA2）作用直接释放出花生四烯酸。多种PLA2的同工酶优先催化PC或PE。花生四烯酸主要来源于PC和PE，因为它们是各种磷脂中构成含量最大的。另一条途径为磷酸酯酶C裂解4，5-二磷脂酰肌醇为1，4，5-三磷酸肌醇和1，2-二酰甘油，它们两者均为细胞内的第二信使。二酰甘油酶使花生四烯酸从二酰甘油中释放出来。脂氧化酶途径或环氧化酶途径以何者激活为主，可能取决于某一特殊刺激引发的磷酸酯类底物的情况。家鼠巨噬细胞受刺激后激活脂氧化酶途径，显示它对磷酸酯酶C/二酰甘油酶途径的依赖。但是，内毒素或醋酸豆蔻酸佛波酯（PMA）诱导的前列腺素合成并不依赖于磷酸酯酶C/二酰甘油酶途径。另一种存在于人类多形核中性粒细胞的激动剂即血小板活化因子，它激活钙离子依赖的PLA2，进而作用于磷脂底物。大鼠腹膜巨噬细胞受内毒素刺激使14C标记的花生四烯酸从磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺/磷脂酰肌醇大量释出。磷脂酰胆碱在被利用的磷酸酯类中占主导地位，这一事实表明内毒素是直接或间接刺激PLA2合成的。Cavaillon和Haeffuer等早就推测细胞表面存在内毒素受体，但是将细胞外内毒素与细胞内类二十烷酸合成连接起来的机制始终未获阐明。这种可能存在的受体调控着鸟嘌呤核苷酸调节蛋白，也调控着蛋白激酶C的活化过程以及蛋白质的重新合成。

单核-巨噬细胞是机体受到内毒素刺激时的主要效应细胞之一，也是探明内毒素作用的分子机制研究的关键部位之一。Michalek等早在1980年即通过实验揭示了巨噬细胞是内毒素血症时宿主的主要效应细胞，该实验系把对内毒素有反应性的C3H/HeN小鼠的骨髓移植给对内毒素无反应性的C3H/HeJ小鼠组成嵌合体，则后者会获得对内毒素的敏感性。以后进一步的研究发现，只需将相当少数量的C3H/HeN小鼠巨噬细胞移植给C3H/HeJ小鼠，就会使后者内毒素的致死率明显增加。Mathison和Ulevich于1979年通过将放射性核素标记的内毒素注入实验动物揭示肝脾巨噬细胞是主要聚集场所。对单核-吞噬细胞系统系统功能有调节作用的药物可使机体对内毒素的敏感性和对花生四烯酸的合成造成显著的改变。巨噬细胞激活剂葡聚糖使实验动物较对照组对内毒素的敏感性增加100倍，也使内毒素诱导的血浆血栓烷和6-酮基-前列素F1α水平增高。反之，甲基棕榈酸因能抑制巨噬细胞的功能而使机体对内毒素的抵抗力增强，也使内毒素诱导的类二十烷酸水平降低。目前已确认巨噬细胞是休克动物血浆中类二十烷酸和细胞因子的来源之一。支持巨噬细胞是主要效应细胞的证据还在于已确知它是肿瘤坏死因子的来源。因为更晚时候的研究发现，使用抗肿瘤坏死因子抗体对发生内毒素血症的小鼠有保护作用。1990年，Mohri等认为类二十烷酸调节肿瘤坏死因子的诱导和表达，它们与其他细胞因子协同作用，造成了内毒素血症时一系列复杂的综合征。

早在1983年，Cook等就报道血栓烷和前列腺素Ⅰ2参与实验性的内毒素血症和败血症。Butler等阐明，在败血症和内毒素血症时，实验动物和患者其血浆中血栓烷或前列腺素Ⅰ2的稳定代谢产物TXB2和6-酮基-前列素F1α均增加。若给予多种血栓烷合成酶抑制剂——非甾体类抗炎药物或选择性血栓烷受体拮抗剂，均可减轻内毒素血症和败血症的许多症状，若给健康人静脉注射内毒素以造成神经体液应激，则此时布洛芬也能使症状减轻；并且，临床上亦显示给予败血性休克患者布洛芬能带来潜在的益处。通过脂氧化酶合成花生四烯酸的途径是研究的一个焦点。研究发现，在内毒素血症和急性肺损伤患者，其支气管肺泡灌洗液，胆汁和尿液中LTC4，LTD4，和LTE4的硫化物，以及LTB4及其代谢终产物均增加。若给予5-脂氧化酶抑制剂、选择性的硫化白细胞介素受体拮抗剂和选择性LTB4受体拮抗剂﹐能阻止内毒素血症和急性肺损伤的病理生理后果。总的来说，上述研究已经确认环氧化酶和脂氧化酶产物是内毒素血症和败血症时的重要的致病介质。