在纯化的最后阶段，目标是蛋白质的浓度为克每升水平，同时内毒素的浓度为微克每升左右，这种情况常常会类似于大海捞针一样的劳而无获。检测这些低浓度的内毒素也是一个问题，往往很难在纳克每升水平应用一般的常规方法直接检测出来。据许多尚未正式报道的资料表明，许多检测到的成分起先被认为是致热性的新物质，后来证实这些物质的致热活性的来源并不是这种物质本身而是内毒素。这是由于检测技术的不敏感所造成的，所以要完全清除内毒素显然是不可能的。用来检测内毒素的生化试验有兔试验、鲎试验，鸡胚致死性试验和半乳糖氨预处理小鼠致死性试验等。其中，鲎试验(LAL)是最为敏感和经济的一种检测方法。LAL试验由Renrson于1985年创立，其原理是利用一种称为鲎的海洋节肢动物的血凝集系统。运用这种方法在体外可检测出0.02EU/ml水平的内毒素。虽然LAL试验被认为是检测内毒素的敏感而可靠的方法，但是许多物质也会干扰凝聚过程而导致假阳性或假阴性结果。这些干扰通常与样品的浓度有关，如果将所检测的样品溶解可以避免干扰，但是这样又会降低试验的敏感性。当然，有的时候对于一些复杂的液体如血液、阳离子蛋白质溶液和脂质体包被的内毒素等检测也会偶尔失效。因此，寻找一种可行的、敏感的生化试验需要进一步的研究，全血刺激试验是新近发展起来的一种检测内毒素的试验﹐目前尚在德国进行有关方面的验证。

产物的纯化可以有效地去除内毒素﹐常用的纯化流程由几个层析步骤组成，包括离子交换、疏水相互作用层析和凝胶过滤色谱法。一般来说，起初，高内毒素含量的产物通过上述过程的纯化而不再经别的特殊处理就能将内毒素减少至100EU/ml左右，甚至更低。如重组α1-抗胰蛋白酶在粗制的细胞匀浆中浓度为1.2×107EU/ml，当采用超滤﹑离子交换和固定的金属螯合物吸附层析法三步纯化后，终产物中的内毒素含量小于0.22 EU/ml。另外，虽然有几种吸附步骤的混合使用，但在最终产物中仍有相当量的内毒素未能被清除。虽然在通过阳离子交换和肝素吸附剂等无菌层析后，蛋白质的纯化度可达到99%以上，但是最终产物中的内毒素含量仍有14EU/ml。再如，在纯化的鼠IgG1预备物（PI=5.5）中微生物污染是很少的，经过立即无菌过滤后，内毒素和 IgG1分别为100EU/ml和3EU/ml。此时再用其他方法（包括离子交换、疏水相互作用和蛋白质A亲和层析）再处理此IgG1溶液并未能进一步去除所含的内毒素。同样，当多黏菌素B或组胺酸用作层析柱时，在大剂量的样品情况下，不能有效地将内毒素减少到一个理想的限度以下。而在处理少量的样品时则可以一定程度地减少内毒素，但问题是会丢失相对大量的产物。蛋白质和内毒素分子的特性对于蛋白质和内毒素的进一步减少有独特的影响。如针对碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）的内毒素选择性吸附剂是以聚乙胺葡聚糖为基础的，能成功地在负性层析模型中进行。当内毒素被吸附的同时，bFGF的残留可以避免。对IgG1来说，只有特殊的内毒素选择性吸附剂是成功的。在制药工业上有一些可选择的方法可以得到低内毒素含量的产物，这些方法之间的差异表现在内毒素清除时鱼和熊掌不能兼得的问题。因为药用性蛋白质的酸碱性不同，在制造过程中需要的合适环境也不同，所以不能采用完全相同的方法来去除其中的内毒素。例如，离子交换层析对尿激酶或bFGF等碱性蛋白质的去污染有用，而对酸性蛋白质则因为吸附因素的作用将会同时伴有产物的丢失。小分子蛋白质如肌球蛋白（相对分子质量为18000）可用于超滤法去除大的内毒素聚合物，而对大分子蛋白质如免疫球蛋白（相对分子质量为150000）来说，超滤则不起作用。此外，如果内毒素和蛋白质的相互作用使内毒素单体通过细胞膜渗透到蛋白质中，则此时超滤也是无效的。由于产物多种多样，人们期望用一个统一适用的内毒素清除方法是不切实际的。另一方面，由于所采用技术的不同也说明，在纯化步骤的改进时，内毒素分子的特殊性质并不总是被完全考虑到的。

现代生化技术提供了许多合成蛋白质的方法，其中有人蛋白质（如生长激素和干扰素）表达的模拟生物技术、哺乳动物细胞的培养技术以及酵母菌和真菌蛋白质在转录后加以修饰改变而成单克隆抗体等。随着越来越多地采用这些生物技术工程来合成药用性蛋白质，内毒素的污染也成为一个必须关注的重要问题。生物技术应用过程中造成的内毒素污染量很大，污染的程度取决于产品的来源。在细胞培养上清液中通常含内毒素100~1000000EU/ml不等。理想的细胞培养上清液中不应有内毒素存在，因为整个操作过程中使用的试剂都是无内毒素的介质和缓冲液。但是，完全没有内毒素的环境很难实现，水的质量是一个根本的问题。一方面，不含内毒素的水用作注射用水价格昂贵，如果大量使用很不经济；另一方面，在产品保存过程中常会有数量可观的内毒素进来，如果产物的来源是人的血液，则由于献血者以前曾受过感染或急性感染的存在而使得内毒素的污染成为一个严重的问题。

由于内毒素的毒性作用严重影响机体的正常生理功能，因此预防和治疗内毒素对免疫细胞所产生的有害作用已引起国内外多数学者的普遍重视。近十余年来，研究者对此进行了大量的研究并取得了长足的进步。1991年，Zregler等首次采用抗内毒素抗体；1992年，Lynn和 Golenbock分离出一部分内毒素的结构用以阻断内毒素受体及使用介导受体的拮抗剂等均获得了成功。然而，内毒素和免疫细胞间的相互作用并不只是通过特异性受体的介导，内毒素分子非特异性插入靶细胞的细胞膜中也可启动以后类似的一系列反应。当然，内毒素也具有有利作用的一方面，如造成人工热用于治疗、破坏肿瘤和提高非特异性免疫防御等。1963年，Bennett曾就内毒素对人体作用的两面性进行过一番论述，他是这样说的:“内毒素可以引起发热，但是发生于人体的发热有多少是由内毒素引起的呢?内毒素可导致休克，但是所有的休克都是源于内毒素的毒性吗?内毒素会造成人体对感染的抵抗力降低，但是对人体感染性有影响的因素又何止是内毒素一个!”内毒素被普遍认为是一种对人体很有害的东西，虽然Bennett也曾为内毒素做过一番相当努力的辩解。但是不管怎样，至少到目前为止，正是因为内毒素的众多毒性和由此而产生的严重后果，阻碍了其在人体的应用。我们要严格避免不必要的内毒素暴露以防止并发症的发生，特别是对那些经静脉应用的药剂，这方面的预防显得尤为重要，因此，内毒素的检测也自然而然地成为评价此类药物质量的重要方面。

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内毒素血症时，分泌异常的激素主要为一些分解代谢性激素，如皮质醇、胰高血糖素、儿茶酚胺、胰岛素等均分泌增加。儿茶酚胺包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺三种。肾上腺素是由肾上腺髓质分泌的，去甲肾上腺素和多巴胺是由交感神经末梢分泌的，两者都受交感神经支配。交感神经对内毒素具有较高的应激性，在内毒素血症或内毒素休克时，其兴奋性增高，儿茶酚胺分泌增加。儿茶酚胺具有强力收缩血管的作用，当其分泌增加时，微血管产生强烈收缩，以维持血压，保证重要器官的血液供应。但长时期的收缩将影响组织的血液供给，引起缺血缺氧、酸中毒等一系列后果。休克后期，儿茶酚胺耗竭或组织血管对儿茶酚胺敏感性下降，可造成微血管的麻痹性扩张。儿茶酚胺分泌增多也可影响糖、蛋白质，脂肪的代谢，表现为糖原分解、糖异生增多，蛋白分解以及脂肪氧化。这些作用除了儿茶酚胺直接作用外，可能还通过促使胰岛素、胰高血糖素及皮质醇等激素的分泌来调节，单一激素不能解释所有的变化。有人用皮质醇、肾上腺素及胰高血糖素三激素联合输入志愿者体内，发现心率、呼吸及脉搏增快，还观察到机体的高代谢、负氮平衡，内源性葡萄糖产生增加、胰岛素耐受、钠潴留和白细胞增多等现象，这些改变与内毒素休克及其他危重患者的典型症状类似。

内毒素致休克的机制十分复杂，涉及的因素非常多，有的仍不清楚，但微循环障碍、代谢障碍及微血栓形成是最基本的机制。尽管如此，引起这些障碍并非是内毒素直接作用的结果，而是通过许多调理介质及异化激素而实现的。内毒素在体内的作用大多是通过间接作用而实现的。内毒素进入体内后，可激活单核-吞噬细胞系统使其释放大量细胞因子。至今发现的细胞因子已有60～70种之多，常常是一因子具有多功能或多因子具有相同的功能，并互相形成网络。目前公认的细胞因子分类和命名有以下几类：①白细胞介素。②肿瘤坏死因子。③干扰素。④生长因子。⑤趋化因子。⑥集落刺激因子。⑦神经营养因子。IL-1是一个蛋白家族的代表，是急性时相反应中的一个重要介质，能引起发热以及增加急性时相的蛋白合成。IL-1静脉注射或甚至较小剂量鞘内注射即可引起发热，提示IL-1在中枢神经系统（CNS）中可能是一种内源性神经调节剂。另外，IL-1可活化T细胞、NK细胞和内皮细胞，促进IL-2受体和黏附分子的表达，促进B细胞的分化和活化，增加中性粒细胞，引起机体发热、嗜睡、食欲低下、低血压，休克及胶原酶合成，并可诱导TNF、INF及CSF分泌。IL-2也具有重要的免疫调节作用，其全身作用与使用内毒素所观察到的情况相似。IL-2注射后可使机体出现发热、心动过速和其他流感样症状，并有反向调节激素增加。这些变化与使用内毒素后很相似，但这些症状的发生所需时间较长。目前，已报道有超过18种的IL，有些了解尚不多，有的作用仍有争论。但IL在内毒素血症及内毒素休克发生中肯定起着重要的作用。TNF主要由激活的单核-巨噬细胞产生，现已证明，T、B、NK细胞也能分泌TNF-α，TNF-β由活化的T细胞产生。有人把TNF输入志愿者体内，可引发头痛、肌痛、寒战等症状，并有发热和心动过速，而促肾上腺皮质激素含量的增加则表明肾上腺-垂体轴被激活。这些症状的发生与TNF的输入量有关，而且输入内毒素后TNF含量也随之增加。这些结果提示，TNF'可能启动代谢反应。目前已基本证实，TNF可能是内毒素刺激单核-巨噬细胞后引起一系列反应的启动介质，TNF的释放可进一步促使其他细胞因子的分泌，对细胞有毒性作用。INF的生物学活性很广泛，其中Ⅰ型IFN具有抗病毒作用，可抑制某些细胞生长，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和造血细胞，在内毒素致细胞损伤机制中可能起一定作用。生长因子是血液和组织自身形成的多肽物质，能促进细胞生长，其中TNF-β作用复杂，具有双向性，既能促进细胞生长和间质产生，又是一个潜在的各种细胞包括上皮细胞等生长的抑制剂。TNF-β可以诱导某些细胞的凋亡。趋化因子也是一个超家族成员，可分为三个亚族。一方面，在内毒素及其他致炎因子刺激下，单核细胞，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞，NK细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等产生趋化因子。同时，又通过这些细胞所产生的趋化因子吸引更多的中性粒细胞、单核-巨噬细胞等参与炎症反应。

内毒素致休克的机制十分复杂，涉及的因素非常多，有的仍不清楚，但微循环障碍、代谢障碍及微血栓形成是最基本的机制。尽管如此，引起这些障碍并非是内毒素直接作用的结果，而是通过许多调理介质及异化激素而实现的。内毒素在体内的作用大多是通过间接作用而实现的。内毒素进入体内后，可激活单核-吞噬细胞系统使其释放大量细胞因子。至今发现的细胞因子已有60～70种之多，常常是一因子具有多功能或多因子具有相同的功能，并互相形成网络。目前公认的细胞因子分类和命名有以下几类：①白细胞介素。②肿瘤坏死因子。③干扰素。④生长因子。⑤趋化因子。⑥集落刺激因子。⑦神经营养因子。IL-1是一个蛋白家族的代表，是急性时相反应中的一个重要介质，能引起发热以及增加急性时相的蛋白合成。IL-1静脉注射或甚至较小剂量鞘内注射即可引起发热，提示IL-1在中枢神经系统（CNS）中可能是一种内源性神经调节剂。另外，IL-1可活化T细胞、NK细胞和内皮细胞，促进IL-2受体和黏附分子的表达，促进B细胞的分化和活化，增加中性粒细胞，引起机体发热、嗜睡、食欲低下、低血压，休克及胶原酶合成，并可诱导TNF、INF及CSF分泌。IL-2也具有重要的免疫调节作用，其全身作用与使用内毒素所观察到的情况相似。IL-2注射后可使机体出现发热、心动过速和其他流感样症状，并有反向调节激素增加。这些变化与使用内毒素后很相似，但这些症状的发生所需时间较长。目前，已报道有超过18种的IL，有些了解尚不多，有的作用仍有争论。但IL在内毒素血症及内毒素休克发生中肯定起着重要的作用。TNF主要由激活的单核-巨噬细胞产生，现已证明，T、B、NK细胞也能分泌TNF-α，TNF-β由活化的T细胞产生。有人把TNF输入志愿者体内，可引发头痛、肌痛、寒战等症状，并有发热和心动过速，而促肾上腺皮质激素含量的增加则表明肾上腺-垂体轴被激活。这些症状的发生与TNF的输入量有关，而且输入内毒素后TNF含量也随之增加。这些结果提示，TNF'可能启动代谢反应。目前已基本证实，TNF可能是内毒素刺激单核-巨噬细胞后引起一系列反应的启动介质，TNF的释放可进一步促使其他细胞因子的分泌，对细胞有毒性作用。INF的生物学活性很广泛，其中Ⅰ型IFN具有抗病毒作用，可抑制某些细胞生长，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和造血细胞，在内毒素致细胞损伤机制中可能起一定作用。生长因子是血液和组织自身形成的多肽物质，能促进细胞生长，其中TNF-β作用复杂，具有双向性，既能促进细胞生长和间质产生，又是一个潜在的各种细胞包括上皮细胞等生长的抑制剂。TNF-β可以诱导某些细胞的凋亡。趋化因子也是一个超家族成员，可分为三个亚族。一方面，在内毒素及其他致炎因子刺激下，单核细胞，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞，NK细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等产生趋化因子。同时，又通过这些细胞所产生的趋化因子吸引更多的中性粒细胞、单核-巨噬细胞等参与炎症反应。

溶酶体是广泛存在于细胞内的一种胞质小体，其中含40多种酶。溶酶体的功能主要是消化细胞，吞噬和胞饮而来的大分子颗粒（如脂肪核酸）在溶酶的作用下分解成为更小的颗粒。因此，溶酶体是细胞内重要的消化器。在内毒素作用下，特别是在内毒素休克时，溶酶体的膜通透性增高，完整性破坏，溶酶释出，但具体机制尚未完全明了，可能与下列因素有关：①溶酶体膜的脆性增加，这是由于内毒素或缺氧酸中毒等因素作用于膜后直接引起的，或者是由于溶酶体内的磷脂酶被激活，溶酶体膜的磷脂类物质被水解，致使膜通透性增高，出现膜漏现象。②溶酶体释放因子的作用。内毒素在体内可激活补体的经典途径或旁路途径使溶酶体释放因子形成，以刺激人的多形核白细胞释放溶酶体酶，内毒素本身并没有刺激溶酶体溶解的作用。③休克时，由于组织内cAMP减少，cGMP升高，进而影响细胞代谢和溶酶体膜的稳定性，使膜漏增加，溶酶释放。溶酶体破裂后对周围组织有自溶破坏作用，导致：①组织细胞坏死。②释放趋化因子，吸引更多的白细胞破坏及释放更多的溶酶。③释放缓激肽原，并转为缓激肽，进一步对微血管产生影响。④使肥大细胞脱颗粒，释放组胺及5-羟色胺，参与炎症反应。⑤释放胶原酶，消化基膜。⑥形成心肌抑制因子，对心脏造成直接抑制及使内脏血管收缩。⑦抑制单核-巨噬细胞功能。⑧促使血小板凝聚。有人认为，休克时所致的多器官功能衰竭综合征的产生主要与溶酶体大量释放有关。除上述因素外，内毒素对糖、蛋白质、脂肪代谢也有明显的影响。败血症性的自身分解代谢是败血症性休克的一个代谢特征，主要表现为抗胰岛素性高血糖、负氮平衡和骨骼肌蛋白质减少。在内毒素休克及内毒素血症时，对糖代谢的影响主要表现为：①糖的有氧氧化减少，ATP产生下降。除休克时细胞缺氧及细胞由于酸中毒的存在使氧利用障碍因素外，内毒素还有抑制有氧氧化途径关键酶的作用，如1，6-二磷酸果糖激酶等。②促进无氧酵解，这可能是人体的一个代偿性反应。由于ATP产生减少，人体为了维持各种功能所需的能量，就需动用无氧酵解途径，以满足ATP产生的需要。内毒素可促进无氧酵解的关键酶，但无氧酵解的增加，不仅不能满足人体ATP的需要，反而积聚了大量的酸性代谢产物，进一步影响细胞代谢。③糖异生增加。内毒素可使胰高血糖素释放增加，促使糖异生增加，此时无氧酵解所产生的代谢物，如乳酸等，蛋白分解所产生的生糖氨基酸，以及脂肪分解所产生的甘油等均为糖异生提供了足够的原料。④蛋白质分解作用增加，合成作用减弱。有证据表明，内毒素可抑制肝脏白蛋白mRNA的转录，但具体机制尚不十分清楚，可能是通过细胞因子的间接作用进行的。内毒素休克时，血流中的氨基酸，特别是丙氨酸水平升高，此时常伴有尿素生成速度增加，表明有大量氨基酸分解。

从事细菌内毒素检测（BET）方法开发的分析人员经常会遇到新化合物或新产品，要求他们计算内毒素限值，为新材料开发检测方法，并将经过验证的检测方法转移到质量控制部门。什么是内毒素限值，化验开发人员需要了解哪些信息才能计算出内毒素限值？内毒素是革兰氏阴性菌外细胞膜外层的成分。虽然内毒素注射到哺乳动物体内会产生多种生物效应，但目前 BET 检测的重点是确定材料中或材料上的内毒素含量是否足以导致患者发烧。由于革兰氏阴性菌在自然界中普遍存在，因此大多数原材料和肠外产品中可能都存在一定程度的内毒素。为了评估药品的安全性，药典BET根据产品特异性、剂量依赖性、给药途径依赖性和给药时间依赖性计算出的内毒素限值（Weary，1990）来测量常驻内毒素水平（Weary，1990）。计算肠外药剂中内毒素限量的公式一般为K/M，其中 K =内毒素阈值剂量，M是药物剂量（单位/公斤/小时）。K =内毒素阈值剂量K是内毒素限量公式的分子，即内毒素阈值剂量（TPD）。这是一个常数，是对诱发兔子发烧所需的内毒素活性水平的统计评估。 （Wachtel and Tsuji，1976; Dabbah，等，1980）。根据这些研究结果，静脉注射（IV）或肌肉注射（IM）产品的内毒素阈值剂量为K= 5EU/（kg·h）。如果一种产品是鞘内给药（IT），也就是说该物质被注射到容纳脑脊液的空间中，K会降低到0.2EU/（kg·h）。如果药物产品是放射性药物，则非鞘内给药途径的K=175 EU，鞘内给药途径的K=14EU。很多人，甚至一些现行的指导文件都混淆了这一点，认为“K”就是内毒素限值。然而，“K”只是故事的一部分……M =ml /（kg·h）、mg /（kg·h）、U/（kg·h）计算内毒素限值故事开始了。产品开发组（PD）给化验开发实验室（AD）发了一封邮件，提前感谢他们为一个剂量为 50 mg的热门新产品计算内毒素限值。1.AD假设成人肌肉注射的剂量为 50 mg/kg，其计算如下为：K/M = 5 EU/（kg·h） ÷ 50 mg（kg·h） = 0.1 EU/mg.2.AD组将此信息发送回PD组，PD组表示：“对不起。我们忘记告诉您剂量为50mg/人。”AD将此信息考虑在内，假设患者群体为成年人，并重新计算限值：剂量/kg=剂量/人÷kg/人=50mg/人÷70kg/人=0.71mg/kgK/M = 5 EU/（kg·h）÷ 0.71 mg/（kg·h） = 7.04 EU/mg.3.“你难道不知道吗”，PD总监回电话说，“营销组已经采访了多位KOL，这些KOL正在寻找这种新热门药物的鞘内给药。请问AD能否重新计算一下内毒素限值？”AD假设鞘内给药的剂量为50mg/（kg·h），他们的新计算结果如下：K/M = 0.2 EU/（kg·h）÷ 50 mg/（kg·h） = 0.004 EU/mg.4.PD又发来另一封电子邮件：抱歉，第三点中的鞘内给药量不是50mg/kg，而是50mg/人，计算如下：剂量/kg=剂量/人÷kg/人=50mg/人÷70kg/人=0.71mg/kgK/M = 0.2 EU/（kg·h） ÷ 0.71 mg/（kg·h）  = 0.28 EU/mg.5.哎呀。 KOL还希望在6小时内进行静脉输液。AD被再次要求计算内毒素限值，并假设总剂量为50mg/kg。但现在他们需要根据给药时间进行调整。M = （总剂量/kg ÷（给药小时数）=（50 mg/kg）÷（6h）= 8.3 mg/（kg·h）K/M = 5.0 EU（kg·h）÷ 8.3 mg（kg·h）= 0.6 EU/mg.6.随后，AD接到日本营销集团的电话，该集团希望为成年人注射50毫克的全人体推注，也为平均体重20公斤的儿童注射35mg的全人体推注。成人剂量/kg=剂量/人÷kg/人=50mg/人÷60kg/人=0.83mg/kgK/M = 5 EU/（kg·h） ÷ 0.83 mg/（kg·h）= 6.02 EU/mg.儿童剂量/kg=剂量/人÷kg/人=35mg/人÷20kg/人=1.75mg/kgK/M = 5 EU/（kg·h）÷ 1.75 mg/（kg·h）= 2.86 EU/mg.AD学到了什么？1.永远不要假设。在开始计算之前，一定要获得所需的所有信息。计算内毒素限值需要三项重要信息：给药途径。对于静脉注射（IV）或肌肉注射（IM）给药，K=5EU/kg，鞘内给药K=0.2 EU/kg。每公斤患者的剂量。如果剂量是以“全人”剂量给予的，则必须用剂量除以目标人群的体重来调整剂量，来获得剂量/kg。如果相同的整体剂量适用于成人和儿童，则儿童剂量/（kg·h）将高于成人剂量/（kg·h）。每小时剂量。 如果总剂量是通过持续“n”小时的输注给药，则必须通过将总剂量除以给药时间来调整，以获得每小时的剂量。对于上述示例，AD针对初始请求计算了七种不同的内毒素限值，其中剂量为50mg 如果剂量为1 mg/（kg·h），则内毒素限值为5 EU/（kg·h）÷1 mg/（kg·h）=5 EU/mg2.对于任何给药途径，内毒素限值都与剂量成反比。剂量越低，每单位剂量的限值就越高。试想一下 ：如果剂量为10 mg/（kg·h），则内毒素限值为5 EU/（kg·h）÷10 mg/（kg·h）=0.5 EU/mg如果剂量为100mg/（kg·h），内毒素限量为5 EU/（kg·h）÷100 mg/（kg·h）=0.05 EU/mg3.一种产品的内毒素限值可能有很多种，这取决于PD小组的预测或最终包装说明书中关于剂量和给药的说明。要找到任何给定制剂的最低内毒素限值，必须将实验室提供的或包装说明书中描述的所有给药途径、剂量/kg和剂量/h结合起来进行计算。最终，当产品总监询问这款热门产品的内毒素限值是多少时，AD必须说：“视情况而定。” 然而，如果第1点至第6点中描述的所有选项对于任何制剂都是可能的时候，则AD必须选择最低内毒素限值作为公司的内部放行规范，以便该药品可以用于所描述的任何给药方式中 例如，产品的内毒素限量为第3点时，计算结果为 0.004 EU/mg。引用文献1. Dabbah, R., E. Ferry Jr., D.A. Gunther, R. Hahn, P. Mazur, M. Neely, P. Nicholas, J.S> Pierce, J. Slade, S. Watson, M. Weary and R. L. Anford. 1980. Pyrogenicity of E. coli 055:B5 Endotoxin by the USP Rabbit Test – a HIMA Collaborative Study. J. Parent Drug Assoc. May-June2. Wachtel, Ruth E. and Kiyoshi Tusji. 1977. Comparison of Limulus Amebocyte Lysates and Correlation with the United States Pharmacopeial Pyrogen Test. Appl Env Microbiol.33(6): 1265-1269.3. Weary, Marlys. 1990. Understanding and Setting Endotoxin Limits. J Parent Sci Tech. 44(1): 16-18

八月，暑气犹盛，作为东南亚地区最大的展会，亚洲国际医疗实验室仪器设备及医疗器械展览会（Medlab Asia & Asia Health）在泰国曼谷IMPACT展览中心正如火如荼地进行着！科德角国际生物医学科技（北京）有限公司受美国ACC（Associates of Cape Cod）邀请，相聚泰国，共谱细菌内毒素检测领域华章，展望未来国际市场。美国ACC（Associates of Cape Cod）携PKF细菌内毒素检测系统、浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、凝胶法鲎试剂、重组鲎试剂等产品亮相于泰国曼谷IMPACT展览中心H6.B38展位，以其出众的产品、独特的优势、极佳的技术成果惊艳全场。本次展会，美国ACC展出96孔Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统、鲎试剂及细菌内毒素检测耗材等多款产品。其中，96孔Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统和配套的Pyros® eXpress软件共同提供了一套快速、高效、精准、灵敏的细菌内毒素定量检测系统。1、快速高效的PKF细菌内毒素定量检测系统美国ACC推出的Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统具备高灵敏度、节约试剂、温控精准等优势，适用于重组法/动态显色法/动态浊度法内毒素检测实验。仪器包括32、64、 96孔三种型号，符合USP、ChP、EP、JP细菌内毒素检测标准。其配套的Pyros® eXpress软件具有微软SQL数据库，具备数据完整性，自动生成审计追踪报告，符合联邦法规21 CFR Part 11，能为客户带来更高效的细菌内毒素检测，是细菌内毒素检测行业的不二之选。2、精准灵敏的鲎试剂得益于深厚的研发实力与技术工艺，美国ACC积极开拓鲎试剂产品布局。此次展会带来的浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、凝胶法鲎试剂等产品均通过美国FDA认证，符合USP、ChP、EP及JP法规要求，满足ICH国际协调方案指导原则。3、热闹非凡的展会现场科德角国际携手合作伙伴美国ACC（Associates of Cape Cod）在此次展会与全球客户伙伴展开了密切的交流与探讨，细菌内毒素产品的展出更是引起了众多客户的热烈关注。目前科德角国际与美国ACC已接待了来自美国、泰国等国家的众多客户。近年来，细菌内毒素检测领域快速发展，此次展会为科德角国际进入东南亚新兴市场和建立伙伴关系，提供了理想环境。2019年，科德角国际的合作伙伴美国Associates of Cape Cod在成立45周年之际，在迪拜举行了盛大的全世界经销商大会，并在会议现场进行了凝胶法，动态浊度法及动态显色法等细菌内毒素检测培训。美国ACC世界经销商大会-迪拜国外的参展大会，象征了科德角国际向国际市场又前进了一大步。展会还剩一天，如需详细了解美国ACC（Associates of Cape Cod），欢迎各位莅临美国ACC展位H6.B38参观指导，期待您的到来！展位信息参展时间：2023年8月16-18日展位地址：IMPACT Exhibition Centre - Bangkok Thailand展位号：H6.B38策划丨科德角国际·市场部编辑丨Carrie·Tse校对丨Zoe·Yin,Feng,Qin

DIC与休克的关系十分密切。急性 DIC常伴有休克；休克特别是休克晚期可促进DIC形成。各类休克中，感染性休克最易伴发DIC，这主要是由内毒素本身的性质决定的。研究表明：①内毒素可使血液凝固性升高。②内毒素可使毛细血管扩张，血流变慢。内毒素休克更易使组织缺氧，影响有氧氧化，产生酸中毒。内毒素对血管内皮细胞有直接及间质的损害作用，最后促使微血栓形成。③内毒素可引起全身性Shwartzman反应，加速促凝。④内毒素可对凝血系统产生真接或间接的作用：内毒素中的脂质A，可使Ⅻ因子活化成Ⅻ8，启动内源性凝血系统；内毒素可作用于粒细胞、B淋巴细胞及单核细胞，当脂质A与这些细胞接触后，可使后者释放出组织因子，促发外源性凝血系统；另外，内毒素也可使凝血酶原激活成为凝血酶.⑤除内毒素激活凝血系统外，还可通过间接作用激活纤维蛋白溶解、激肽及补体系统。内毒素可激活补体经典及旁路途径，从而进一步造成休克与DIC间的恶性循环。⑥内毒素可使血小板聚集，并使其释放血小板因子及血栓球蛋白等促凝血物质。内毒素还具有增加血小板激活凝血因子X的活性作用。休克时DIC的形成标志着休克进入难治阶段。临床上虽有许多检测DIC的指标，但有时结果不肯定，为此有人对此种情况进行电镜检查，可发现毛细血管中有聚合但聚合不完全的纤维蛋白丝的存在，因此有人称之为DIC的亚临床型。

（1）血池形成：休克时，某些微循环收缩，而某些微循环则扩张，这主要是由于神经-体液等因素调节的结果，目的是保护重要器官的血供。扩张的微血管中常有血液的蓄积，从而形成血池（blood pool）。众多的血池能蓄积大量的血液，这就使机体有效循环血量减少。休克中晚期，由于酸性代谢物、补体的激活及组胺与5-羟色胺等的作用，使大量毛细血管开放，进而形成更大的血池，严重影响有效循环血量，使休克进一步加深，加重。（2）血淤泥形成（blood sludge）：根据物理流体力学原理，由于血流缓慢，导致血液悬浮稳定性下降，各有形成分分离，形成三层，即成分较重的红细胞下沉到血管的下部，成分较轻的白细胞和血小板在中层，血浆在上层。各层流速不同，血浆流速最快，红细胞层流速最慢，白细胞和血小板的流速在两者之间。结果造成血池的局部血流更加缓慢、淤滞，并有旋涡形成，使下沉的红细胞更加下沉，集积在微血管壁上，最后导致红细胞凝集。这种现象为不可逆的，也是DIC形成的前奏。

休克时，由于微循环发生一系列的病理生理改变，造成血管扩张、通透性增加、血流减馒和血液淤积，由此也可引起微血流流态的紊乱。微血流流态的紊乱一般常发生于休克的中晚期，而很少发生于休克早期。休克时微血流流态的紊乱，按先后次序大致可分为三个阶段，以下介绍早期情况：血细胞与微血管间、血细胞相互间黏聚力增加，血黏度增高。内毒素休克早期即可发现血流缓慢，血小板和白细胞分流并拥集在微血管的边缘分支中。由于内毒素及休克后许多代谢产物、缺氧、酸中毒等因素的共同作用，使微血管内皮细胞受损，此时血小板可发生局部黏聚。如果休克很快纠正、血压恢复，则微循环血流可得到改善。如休克进一步发展，血小板发生破坏，释出血小板因子，则可加速凝血作用，促进DIC的形成。内毒素休克与其他休克的微循环及血细胞变化类似，但前者的作用更严重。休克早期使血小板黏附的机制可能与下列因素有关：①内毒素及其他毒性物质包括氧自由基对微血管内皮的损害，可使内皮脱落，其下胶原暴露。现研究明确，内皮胶原内有Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原，Ⅰ型胶原的羧基端和Ⅲ型胶原α链中心部位的多肽是血小板黏附时的主要部位。②血小板膜上的许多糖蛋白结构，特别是糖蛋白Ⅰb结构是血小板黏附于内皮下层的特异部位，其内也包含着血小板聚集的重要分子。③血小板受凝血酶等刺激后，可释放TXA2及其他介质，使内皮细胞损伤加重。内毒素对红细胞表面电荷及红细胞形态有明显影响。正常时红细胞均匀地混悬于血浆之中，一般认为这是因为红细胞表面与血管内皮表面均带负电，因而红细胞间和红细胞与毛细血管内皮细胞间相互排斥，以维持红细胞的混悬状态，如由各种原因使红细胞表面电荷降低，就可增加红细胞间的黏附能力，使红细胞聚集。有人预测，红细胞在血浆中的表面电荷约为16.4×10-5静电单位，其表面负电荷的主要来源是糖蛋白上的羧基，包括唾液酸的羧基，α-羧基、β-羧基和γ-羧基。正常时，由于红细胞上带有基本相等的负电荷，因此红细胞之间相互排斥。红细胞之间的最小距离为20nm，内毒素可使红细胞膜上的电荷数明显减少，其他如酸性代谢产物、氧自由基、外来高分子物质等也可使其表面电荷数减少，并引起红细胞聚集。血流动力学的改变也是促使红细胞聚集的因素之一。在血流淤滞、浓缩、黏滞度增大、流速减慢等因素作用下，红细胞由于血液浓缩而紧紧挤靠在一起，一般为4～5个红细胞聚集在一起，但此时其仍可在血流中流动，中间可夹杂白细胞或血小板。此时，红细胞的完整性仍未破坏，聚集的红细胞仍可重新解聚，但成串的红细胞可进一步影响微循环的流量。血浆的黏度主要受血浆蛋白相对分子质量（或体积）、血浆蛋白浓度、蛋白质分子形状和蛋白质分子的对称性等影响，其中以血中纤维蛋白原的浓度对血浆黏度的影响最大。休克时，特别在内毒素休克时，由于血液浓缩或纤维蛋白原合成增多，纤维蛋白原含量升高，血浆黏度升高、流速减慢，并且纤维蛋白原覆盖于红细胞膜上，使红细胞间的相互排斥作用减少，相互之间的聚合作用增加，最后可促使红细胞聚集。红细胞的另一特征是其具有可塑性，能通过毛细血管。内毒素休克时及在由此所产生的缺氧、酸中毒等因素的作用下，红细胞膜收缩蛋白可出现代谢障碍，并使红细胞变形能力降低。有人用内毒素注射动物后发现，动物红细胞外形改变为球形、棘形，且变形能力也明显下降。另外，由于缺氧及内毒素对红细胞膜的毒性作用，红细胞膜上Na+，K+-ATP酶活性下降，Na+-K+交换出现障碍，细胞内Na+大量聚集，细胞内渗透压增加，细胞外液水分进入，使红细胞发生肿胀变形，严重时可使红细胞破坏，并发生溶血。除血小板及红细胞外，在微循环障碍时，白细胞的数量及质量也有改变，这也可影响微血管的畅通。白细胞在血液中数量相对较少，但变形能力也较小。在内毒素刺激下，大量新生白细胞进入血液，由于白细胞形态改变得又高又圆，故变形能力进一步减小。此时，如果存在微血管痉挛、毛细血管壁水肿使管腔变窄，则白细胞极易阻塞毛细血管，并影响相应区域微循环的灌流。正常情况下，血液内的白细胞在血管中央流动，不与微血管壁接触，在内毒素休克时，白细胞可发生贴壁翻滚现象，即白细胞沿着血管壁缓慢流动，造成此种现象的原因目前仍不很清楚，这可能与内皮细胞膜上带电荷数减少、有化学趋化物质存在、血流减慢、白细胞膜发生变化等因素有关。严重时，白细胞可以沿血管壁成队排列，影响循环的流畅。白细胞膜及血管内皮膜上存在着黏附分子。内毒素、TNF、IL、白细胞三烯等能促成黏附分子的表达，使白细胞与血管内皮之间的黏附能力增加。白细胞膜的黏附蛋白为整合素，如CD11和CD18。微血管内皮细胞膜上的黏附蛋白为选择素，如ICAM-1、ICAM-2、ELAM-1.CD 62等。近来发现，休克时微循环Skimming现象也是休克患者的一个特征，即某些微血管中仅有血浆流过而无红细胞通过，特别是在血流减慢时更可以如此。关于此种现象的意义尚不清楚，可能是休克时人体的一种代偿机制。虽然红细胞不能通过影响组织氧的供给，但仍可利用血浆中的营养成分供应组织细胞的需要。

毛细血管壁由单层内皮细胞组成，厚约 1µm。真毛细血管与组织细胞十分接近，距离约为20~50µm。近年来应用电子显微镜发现，毛细血管壁相邻两个内皮细胞之间虽有紧密连接结构，但仍有一狭窄细缝，其宽度约为3~20nm，而脑毛细血管内皮细胞间的缝隙因细胞融合而封闭，这是血-脑屏障的机械结构。尽管毛细血管壁具有紧密连接，但微血管内的营养物质仍可自由通过血管壁进入组织周围，这是因为有下列机制的存在：①经过微血管内皮细胞紧密连接处狭缝。②微血管内皮细胞胞质突入管腔，将微血管管腔的内容物包裹，然后在内皮细胞中往微血管基膜的方向推送。③微血管内皮细胞胞质形成小凹以吞饮泡的方式将管腔内容物往基膜方向转运。④部分毛细血管内皮结构中存在着窗孔结构，使血管内的物质可通过窗孔进行交换。⑤有时内皮细胞上的凹陷与内皮细胞中的小泡连成一个小管腔，使管腔内容物经小管腔通道进入组织周围。⑥内皮结构有时成为不连续型，毛细血管内容物可通过此处缺口进行通透。⑦小分子物质及脂溶性物质可通过整个内皮细胞渗出管腔。内毒素休克及其他休克时，毛细血管内皮细胞间的缝隙加大可使毛细血管通透性增加，这主要是因为在内毒素作用下，体内的组胺、5-羟色胺、缓激肽，NO及其他扩血管物质增加，使内皮细胞中的微丝发生收缩，从而使毛细血管内皮间的裂缝加大，毛细血管通透性增加.另外，在内毒素及其他代谢物质作用下，内皮细胞可发生缺氧、细胞变性坏死及血管通透性明显增加，尤其在毛细血管、微静脉处特别明显，严重时甚至可发生渗漏现象。毛细血管通透性受多种因素影响，但最为重要的是以下三个因素：（1）内皮细胞间的缝隙连接：一般认为内皮细胞间有两种连接方式，一种称为紧密连接，即相邻细胞膜通过特异性的跨膜蛋白彼此融合，构成闭锁连接；另一种为缝隙连接，是由特异性细胞间黏附蛋白形成的黏附连接，也称为抛锚连接（anchoring functions），此种连接是通过血管内皮细胞钙黏附蛋白（cadherin）与相邻细胞间的钙黏附蛋白左右对称连接的，然后再通过Catenin的β或丫亚基结合，后者再与α亚基与骨架蛋白相连形成抛锚。钙黏附蛋白受钙离子影响，当细胞骨架蛋白收缩时，通过钙黏附蛋白放松，使紧密连接开放而增加毛细血管的通透性。（2）细胞与基膜黏附连接：是决定毛细血管通透性的另一重要因素，这种细胞与基膜之间的连接称为局部黏附，其中黏附蛋白整合素在局部黏附中起重要作用。（3）内皮细胞的收缩蛋白：与血管平滑肌相似，血管内皮细胞可通过细胞内的微丝而收缩。这个收缩作用依赖于球蛋白轻链的磷酸化，激活ATP酶使肌动蛋白收缩，由此使血管内皮细胞收缩及增加血管的通透性。

▲西藏自治区食品药品检验研究院 ▲PKF96型细菌内毒素定量检测系统今日，科德角国际生物医学科技(北京)有限公司的美国ACC—PKF96型细菌内毒素定量检测系统在西藏自治区食品药品检验研究院配置成功，并顺利投入运行。▲数据收集中...通过OD-onset time实时Plots图直观地查看每个独立孔位反应情况。▲数据收集结束弹窗Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统可实现自动化检测。数据收集完成，实验自动终止，即时生成电子检验报告，方便实验人员在线查看、分析实验数据，更加方便快捷。▲测试结果 拟合标准曲线详情（相关系数R、斜率、截距）。▲样品测试结果详情稀释倍数、反应时间onset time、CV、初始浓度、实测值、PPCs加标回收率、限值符合与否判定。此次西藏自治区食品药品检验研究院配置的PKF96型细菌内毒素定量检测系统支持动态浊度法细菌内毒素定量检测，检测标准曲线：1-0.1-0.01-0.001EU/ml。Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统，适用于基因重组法/动态显色法/动态浊度法细菌内毒素检测实验，设备包括32, 64, 96孔三种型号。其配套的Pyros® eXpress软件符合USP、ChP、EP、JP细菌内毒素检测标准。具有微软SQL数据库，具备数据完整性，自动生成审计追踪报告，符合联邦法规21 CFR Part 11。Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素检测设备和Pyros® eXpress软件共同提供了一套快速、高效、精准、灵敏的细菌内毒素定量检测系统。细菌内毒素检测系统特点双重检测波长：405nm和660nm，适用于重组鲎试剂法/动态显色法/动态浊度法细菌内毒素检测审计追踪：严格遵循联邦法规21CFR Part 11标准，微软SQL数据库，具备数据完整性，自动生成审计追踪报告FDA认证：生成检测报告可直接用于美国FDA认证申报节约试剂：鲎试剂使用量仅需50µL高灵敏度：灵敏度可达0.001EU/mL，实际可达0.0005EU/mL温控精准：37℃±0.1℃独立孔位：每个孔都是独立计时的，允许操作员在运行过程中添加更多样品科德角国际欢迎各大企业、研究院、政府机构前来实地考察、洽谈合作，科德角国际将助力合作伙伴在细菌内毒素检测领域取得重要成果！合作伙伴：西藏自治区食品药品检验研究院西藏自治区食品药品检验研究院是西藏自治区药品监督管理局直属事业单位，是行政执法的主要技术支撑机构，区内权威药品、化妆品、医疗器械和食品检验检测机构。西藏自治区食品药品检验研究院前身为西藏自治区药品检验所，始建于1975年5月，2006年更名为西藏自治区食品药品检验所，2017年更名为西藏自治区食品药品检验研究院。2001年增加医疗器械检验检测职能，2006年增加食品、保健食品检验检测职能；2011年增加化妆品卫生检验检测职能。西藏自治区食品药品检验研究院在西藏自治区药品监督管理局领导下，依法对药品、食品、医疗器械、化妆品、药品包装材料（容器）、边境口岸进口中（藏）药材及洁净环境开展检验检测。承担西藏自治区辖区内药品、医疗器械、药品包装材料容器生产、经营、使用单位的质量监督抽查检验、复验、注册检验工作；承担食品、化妆品质量监督抽查检验、委托检验工作；开展药品、食品、医疗器械检测方法及质量标准的研究工作。策划丨科德角国际·市场部编辑丨Carrie·Tse校对丨Zoe·Yin,Feng

研究者发现，实验动物肝门静脉结扎时，内毒素水平增加，但结扎放松后6h内内毒素血症消失，提示在致命性肠系膜缺血模型中，肠屏障和单核-吞噬细胞系统功能在病因解除后能迅速恢复正常。细菌转位常指打击后肠系膜淋巴结出现内源性肠道细菌。特殊菌种转位的能力与其在肠道内的优势有关，而逃过单核-吞噬细胞系统继续存活的能力则与其毒性有关。实验中，在实验动物肠道细菌过度生长时，投予内毒素、失血性休克、降低T细胞功能以及用海狸油损伤黏膜后均会发生细菌转位，许多模型都出现肠上皮层破坏。失血性休克、内毒素和海狸油都可引起组织学可见的黏膜损伤。黏膜破坏引起的细菌转位是暂时性的，通常持续2～4d，这取决于细菌在单核-吞噬细胞系统的存活能力。通常情况下，黏膜损伤都能在24h内迅速修复，损伤后24～~48h，肠系膜淋巴结内出现的细菌可能是经淋巴系统缓慢移动而来，但均被局限于其中，此时如果同时有单核-吞噬细胞系统破坏，则可发生致命的菌血症和败血症。单纯内毒素血症和内毒素血症+30%TBSA烧伤的作用不同。非致死量的内毒素以激烈依赖方式促进细菌转位，腹腔内注射2mg内毒素的鼠89%的肠系膜淋巴结有活细菌，但仅仅限于肠系膜淋巴结中，而没有扩散到其他脏器及体循环。相反，在烧伤鼠中，同样激烈的内毒素则引起细菌向肝、脾、血转位。仅接受内毒素鼠或烧伤鼠的死亡率低于10%，而烧伤伴内毒素血症鼠的死亡率达100%。单次非致死量内毒素可促进细菌转位，但无创伤时细菌感染可以自限，而内毒素+烧伤则迅速引起致命性败血症。蛋白质营养不足可以破坏正常肠微生态，但不发生细菌转位；然而蛋白质营养不足的鼠给予内毒素后，比正常营养鼠更易发生细菌转位引起的败血症。因为蛋白营养障碍可破坏肠微生态及损害人体防御系统。以上结果说明，人体免疫功能对肠细菌转位具有重要意义。肝脏对防止细菌及内毒素转位具有非常重要的意义。特别是肝脏巨噬细胞，其占人体总吞噬细胞的80%左右，穿过肠道的细菌及内毒素进入肝门静脉，必须经肝巨噬细胞解毒后才能进入体循环。实验动物和人的正常小肠能吸收一定量的内毒素，因此内毒素是人类肝门静脉的正常成分之一。有研究认为，肝门静脉内毒素对维持正常单核-吞噬细胞系统吞噬功能方面起一定作用，因为无病原动物和口服非吸收性抗生素的动物单核-吞噬细胞系统抑制。尽管肝门静脉内存在着内毒素，但正常人体循环中无内毒素，这主要是由于正常的巨噬细胞对其解毒作用的结果。一旦肝脏特别是巨噬细胞功能受损，肝门静脉内毒素就可进入体循环造成内毒素血症，如肝病时就可发生内毒素血症。急、慢性肝病均可不同程度地并发内毒素血症：严重肝功能不全患者几乎无例外地发生内毒素血症；肝硬化患者至少50%在体循环中出现内毒素；肝功能衰竭患者，合并中枢神经系统障碍或肾功能衰竭时，外周性内毒素血症发生率更高。提示内毒素在中枢神经系统和肾衰竭方面的致病作用。肝昏迷患者内毒素血症发生率增加与单核-吞噬细胞系统清除能力明显降低有关。这些研究明确提示，肝脏单核-吞噬细胞系统清除能力抑制引起消化道正常吸收的内毒素蓄积，造成内毒素血症。如果创伤和败血症患者单核-吞噬细胞系统功能正常，可能在损伤后数天乃至数周内都不会发生明显内毒素血症。综上所述，人体肠道是含细菌及内毒素最大的贮存场所，这些细菌和毒素不能进入体循环，这主要是由于有正常的肠道屏障功能和正常的免疫防御系统存在。各种损伤、休克、感染等因素可使肠道屏障功能破坏，肠道的细菌和内毒素可穿透肠道而进入体循环，造成细菌及内毒素转位。各种损伤等应激反应引起肠道屏障功能下降的机制，可能是通过ATP耗尽、组织缺氧、氧自由基、细胞因子等途径对肠黏膜细胞造成损伤，但以ATP耗尽最为重要。单纯肠道黏膜受损只造成短暂的或一过性的菌血症或内毒素血症，只有同时存在单核-吞噬细胞系统的抑制才会造成广泛的细菌或内毒素转位，对人体造成影响。

饮食成分是影响肠道屏障功能的另一因素。全肠外营养（TNP）可增加肠黏膜通透性和细菌转位，即使使用不同脂质配方的饮食也可增加肠细菌转位。饥饿时可增加细菌转位的发生。有人认为，慢性营养不良一般不会导致肠黏膜屏障功能不全。但此时如再有另外一刺激如炎症或注射内毒素等就可使细菌转位增加。关于TNP及基本要素饮食增加肠黏膜通透性的机制仍不清楚，但近年的研究认为，该机制涉及肠黏膜屏障本身及肠相关免疫功能。Deitch等研究表明，TNP及基本要素饮食可增加上皮对水溶性物质及活菌的通透性。同时也可诱导肠免疫功能及细胞的改变，减少肠上皮内及Peyer结节内的淋巴细胞、IgA+浆细胞及IgA的产生等。正常饮食中的纤维素可能对肠屏障功能的维持具有重要意义。如在饮食中添加纤维素可预防TNP及要素饮食所诱发的肠通透性增加及细菌转位的发生。发泡剂是一种纤维素，也可明显改善肠屏障功能。关于其机制尚不清楚。纤维素可能为常驻菌的食物，在维持肠道微生态平衡中有意义。谷氨酰氨对肠道屏障功能的维持也很重要。研究认为，肠内或肠外营养中增加谷氨酰氨可减轻肠屏障功能的损害，可改善肠免疫功能。此外，许多肠营养激素和生长激素对肠屏障功能的作用也很重要，主要有胰岛素样生长激素、表皮生长因子、Bombesin，肝素、纤维母细胞生长因子等。也有报道称前列腺素E也可改善肠屏障功能。

在病理和生理情况下，具有信号及效应作用的一氧化氮（NO）对肠道屏障功能的调节具有重要作用。胃肠道的NO可能来源于肠神经元、血管内皮细胞、间质细胞以及黏膜下各种炎性细胞如肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等，肠道细菌也可产生大量NO。肠细胞是NO的另一重要来源。NO合成酶以两种形式存在，结构酶和诱导酶，后者在正常情况下不一定起作用，但受细胞因子或内毒素刺激时，诱导酶可大量生成，并合成大量NO。在消化道炎症性病变如溃疡性结肠炎的活检标本中可发现诱导型NO合成酶（iNOS）增加，注射内毒素后可发现鼠空肠及结肠iNOS mRNA表达增加。这一结果表明，不同炎症状态中均有肠上皮iNOS诱导产生增加，当然这些研究仍不能排除局部浸润的肠炎性细胞诱导产生的 iNOS增加。但Tepperman等给动物注射内毒素后所分离的肠细胞中有iNOS上调现象。因为如事先注射抗中性粒细胞抗血清，仅能阻止白细胞的浸润，但对iNOS活性无影响，因此提示内毒素血症时肠 iNOS上调作用与肠细胞有关，而与炎性细胞无关。此外，研究者在内毒素血症的小鼠肠上皮细胞中发现亚硝酸复合体形成，且肠细胞与细胞因子混合培养可诱导肠细胞产生更多的iNOS。这些证据进一步支持肠细胞可诱导产生NO的假说。NO对肠黏膜屏障功能的作用是双向的，即有利也有害。NO对维持肠黏膜屏障功能是必需的，证据有：在正常猫肠系膜上动脉中输入NOS抑制剂L-精氨酸可明显增加上皮细胞对水溶性物质如51Cr-EDTA的通透性；在缺血-再灌注猫及内毒素诱导的鼠黏膜损害模型中，输入NO可减轻肠黏膜的通透性。也有相反报道，阻断NO生物合成可加剧缺血-再灌注及内毒素诱导的肠通透性增加。但另有资料显示，NO产生过多对胃肠道黏膜有损害作用，如NO供体硝普钠应用可使小鼠结肠及胃黏膜细胞受损。有报道称LPS注射后鼠肠上皮细胞活性降低是通过NO依赖机制实现的；有也报道称NO供体或NO可增加单层培养细胞的通透性。与其他因素促使肠通透性增加相似，NO对肠黏膜屏障功能的损害作用也是通过ATP耗尽实现的。一般通过以下几个机制来耗尽ATP：激活PARP，抑制线粒体呼吸链；抑制糖酵解酶——甘油醛-3-磷酸脱氢酶。除ATP耗尽作用外，也有报道肠黏膜细胞暴露于NO供体后，可使细胞内Ca2+浓度增加，从而影响肠屏障功能，严重时可使细胞死亡。肠道NO的许多有害作用不是由NO本身的作用所致，而是通过过氧化亚硝酸盐发挥作用，后者是NO与超氧自由基反应后所产生的。过氧化亚硝酸盐的毒性作用与其结合酸（过氧化亚硝酸）的强力氧化特征有关，在酸性条件下，有利于过氧化亚硝酸形成。值得注意的是，NO介导的肠上皮通透性增加在pH低值时更易发生。

为维持能量水平，缺氧时细胞无氧酵解增加。与有氧氧化相反，在糖酵解过程中，糖分解不完全，一个葡萄糖分子仅能产生4～6个ATP，而在有氧氧化时1个分子葡萄糖能产生38个ATP，同时无氧酵解还产生许多H+离子（2H+/1mol葡萄糖），最后导致ATP缺乏及组织酸中毒。其实，在内毒素血症或败血症时，即使没有缺氧缺血，也可发生酸中毒，这是因为内毒素可下调丙酮酸脱氢酶活性，使线粒体氧化过程受阻，同时无活性丙酮酸脱氢酶增多，可使无氧酵解途径增加。酸中毒可使肠黏膜屏障功能下降，肠通透性增加，肠组织酸中毒发生往往伴有ATP下降。有人认为，酸中毒可抑制磷酸果糖激酶，使葡萄糖酵解过程所产生的ATP进一步减少。因此，ATP减少也是酸中毒对肠黏膜屏障功能影响的最后环节。

反应性氧中间体（ROI）如 H2O2及羟自由基，是导致肠屏障功能不全的另一些因素。在缺血-再灌注实验中，肠缺血可致肠通透性增加，并有氧化反应的证据，缺血-再灌注时，至少可通过两种机制使氧自由基产生增加：①黄嘌呤氧化酶反应。②肠微血管中白细胞的NADPH氧化酶催化的反应。应用氧自由基清除剂或抑制黄嘌呤氧化酶，可减轻缺血-再灌注时的肠黏膜屏障功能损伤。氧自由基可使上皮及内皮细胞通透性增加，虽然具体机制仍不完全清楚，但ATP耗尽可能是上皮细胞功能损伤的最后共同途径。氧自由基产生可抑制葡萄糖分解过程中的关键酶——甘油醛-3-磷酸脱氢酶，自由基也可损伤线粒体，抑制ADP氧化磷酸化形成ATP的过程。另一机制可能是激活多ADP核糖聚合酶（PARP），PARP催化核蛋白多ADP核糖过程，消耗NAD，最后导致ATP耗尽，细胞内钙离子浓度升高，如损伤较重，则可使细胞死亡。

ATP是细胞能量的来源，在缺氧状态下，无氧酵解所产生的ATP不能满足代谢所需，细胞ATP含量下降，除了组织缺氧因素外，其他因素如氧化反应、NO和组织酸中毒等也可使ATP耗尽。ATP耗尽可影响肌动蛋白，抑制单体肌动蛋白转为F-肌动蛋白，因此细胞骨架系统受到破坏，使上皮细胞和内皮细胞通透性增加。ATP耗尽导致上皮细胞通透性增加的另一因素是细胞内外Ca2+梯度紊乱。Ca2+对上皮通透性的作用非常复杂。细胞外Ca2+浓度的提高有利于紧密连接的形成，细胞内Ca2+浓度增加可使细胞通透性增加。正常时上皮细胞外与胞质内Ca2+浓度梯度为10000倍，Ca2+梯度的形成部分受滑面内质网及线粒体钙质控制，使Ca2+进入细胞器内。细胞内外Ca2+梯度的形成还受胞膜上的钙泵控制，其也需消耗ATP，使细胞内的钙泵出至细胞外，形成梯度。ATP耗尽使细胞内的钙离子不能有效地被泵到细胞外，大量钙离子贮存在细胞内，使紧密连接不良，并增加细胞旁通透性。细胞内的Ca2+离子水平还受Na+-Ca2+交换机制影响。在ATP供给充足情况下，细胞内外进行Na+-K+交换，在 Na+泵出细胞外的同时，Ca2+被泵入细胞内。

关于肠黏膜屏障功能受损的机制目前仍不清楚。因肠道屏障功能非常复杂，不可能用单一的机制来解释其所有表现，这可能涉及多种原因，以下介绍黏膜缺氧导致细菌及内毒素转位机制的原因肠绒毛的血液是由绒毛内中央营养小动脉供给，血液回流是由弓型小静脉完成。这种解剖学的特点导致绒毛顶端也相对缺氧（即使在正常情况下），这是因为多数的氧被绒毛其他细胞所利用，以至顶端的血流含氧量下降。另外，绒毛微血管的解剖特点符合对流交换条件，因此绒毛内动静脉可能存在着氧弥散分流的可能，进一步使绒毛顶端缺氧。失血性及心源性休克是导致肠系膜缺血最常见的两个因素。心源性休克时，心每搏输出量减少，肾素-血管紧张素轴激活，使肠小动脉阻力明显增加。与此相反，关于败血症和内毒素血症时肠系膜血流灌注和氧供情况的了解不多。但在内毒素性休克早期，肝内血液灌注是增加的。另外几个研究结果认为，失血性休克及败血症时，肠系膜灌注相对不足，并被认为缩血管物质如花生四烯酸，特别是血栓烷A及白细胞三烯可能在动物模型中起着一定作用；尽管如此，有人发现转肠系膜氧摄取似乎足以维持其氧的需要。胃肠道黏膜酸中毒是感染性休克及内毒素血症患者的特征，并被认为是人或动物模型缺氧的证据，但是，即使肠系膜上动脉血供正常也不能完全纠正猪内毒素诱导的黏膜酸中毒。因此提示除了缺血因素外，其他因素可能参与黏膜酸中毒的发生。有人直接测定内毒素血症猪的肠黏膜血流及氧含量，发现注射内毒素后，黏膜血流灌注没有改变，氧含量不仅没有下降，而且平均黏膜氧张力有所增加，这些结果令人意外。但与以往Hurtado等发现的结果一致，其表明尽管内脏氧供给是充足的，但败血症或内毒素血症时骨骼肌产生大量乳酸到达肠黏膜，使肠黏膜产生乳酸性酸中毒。另外几个研究也发现，内毒素血症鼠胆囊氧供增加，骨骼肌氧分压正常，肠上皮等组织氧供增加，这可能是由内毒素血症时线粒体功能受损，氧利用障碍所致，也可能是由于酸中毒的存在影响了氧从血红蛋白游离释放的结果。

有研究者在实验中用C14标记的大肠杆菌注入实验鼠肠腔，然后放血，诱发失血性休克[收缩压2.94kPa（30mmHg），维持4h]，结果实验组14只鼠中有7只在体循环中检测到放射性物质，其中5只血培养发现大肠杆菌生长，而对照组无1例在体循环中检到放射性物质，血培养也阴性。体循环有放射活性物的7只鼠均于80h内死亡，而无放射活性的另外7只鼠均存活。提示细菌和内毒素的转位影响存活率。研究者已在不同动物模型中发现肠道菌转位至肠系膜淋巴结、腹膜、内脏和体循环。失血性休克、内毒素血症、腹膜炎、烧伤和粒细胞减少症均可促进肠道细菌转位至淋巴结或血液中（表22-2），肠道细菌生长及蛋白质营养障碍使肠道细菌转位更易发生。急、慢性饥饿研究显示，急性饥饿时肠道黏膜可有萎缩，对大分子蛋白质的通透性增加。许多实验室也发现，心肺转流过程中或转流完成后实验动物血清内毒素浓度升高，在某些报道中还指出，内毒素血症与并发症发生密切相关。对肠系膜缺血-再灌注的兔、失血性休克的猫、全身X线照射的小鼠以及热休克的猴子中应用多价内毒素抗血清，可明显提高这些动物的生存率，降低内毒素血症，提示各种损伤可影响肠黏膜屏障功能，使内毒素转位至体循环。抗内毒素抗体的应用可减少这些个体的并发症产生。危重患者的有些治疗措施也影响肠道内稳态。应激患者热量需要明显增加，肠外营养是给危重患者尤其是术后患者提供充分热量和其他营养物质的重要方法，然而却对肠道有一定的副作用。全肠外营养（total parenteral nutrition，TPV）的鼠分泌型IgA水平比用鼠饲料或TPN溶液经口喂养的鼠要低，并且结肠细菌明显过度生长，细菌转位至肠系膜淋巴结的发生率也高。TPN溶液经口喂养不仅可降低细菌转位，对分泌型IgA水平的抑制也轻，提示口服营养液对正常肠功能维持相当重要。

有研究者在实验中用C14标记的大肠杆菌注入实验鼠肠腔，然后放血，诱发失血性休克[收缩压2.94kPa（30mmHg），维持4h]，结果实验组14只鼠中有7只在体循环中检测到放射性物质，其中5只血培养发现大肠杆菌生长，而对照组无1例在体循环中检到放射性物质，血培养也阴性。体循环有放射活性物的7只鼠均于80h内死亡，而无放射活性的另外7只鼠均存活。提示细菌和内毒素的转位影响存活率。研究者已在不同动物模型中发现肠道菌转位至肠系膜淋巴结、腹膜、内脏和体循环。失血性休克、内毒素血症、腹膜炎、烧伤和粒细胞减少症均可促进肠道细菌转位至淋巴结或血液中（表22-2），肠道细菌生长及蛋白质营养障碍使肠道细菌转位更易发生。急、慢性饥饿研究显示，急性饥饿时肠道黏膜可有萎缩，对大分子蛋白质的通透性增加。许多实验室也发现，心肺转流过程中或转流完成后实验动物血清内毒素浓度升高，在某些报道中还指出，内毒素血症与并发症发生密切相关。对肠系膜缺血-再灌注的兔、失血性休克的猫、全身X线照射的小鼠以及热休克的猴子中应用多价内毒素抗血清，可明显提高这些动物的生存率，降低内毒素血症，提示各种损伤可影响肠黏膜屏障功能，使内毒素转位至体循环。抗内毒素抗体的应用可减少这些个体的并发症产生。危重患者的有些治疗措施也影响肠道内稳态。应激患者热量需要明显增加，肠外营养是给危重患者尤其是术后患者提供充分热量和其他营养物质的重要方法，然而却对肠道有一定的副作用。全肠外营养（total parenteral nutrition，TPV）的鼠分泌型IgA水平比用鼠饲料或TPN溶液经口喂养的鼠要低，并且结肠细菌明显过度生长，细菌转位至肠系膜淋巴结的发生率也高。TPN溶液经口喂养不仅可降低细菌转位，对分泌型IgA水平的抑制也轻，提示口服营养液对正常肠功能维持相当重要。

通常对肠黏膜屏障的完整性用两个术语或方法来表示，即细菌转位和肠的通透性。所谓细菌转位（bacteria translocation）即为肠内细菌经肠黏膜转位至局部淋巴结或血液。所谓肠通透性（permeability）是指肠道对不同水溶性物质的通透程度。细菌转位的测定常用局部淋巴结、肝、脾、肺组织及血液中的活菌数目来表示。最近用放射性核素标记细菌来估价转位细菌及其产物（内毒素）的量，认为用局部淋巴结活菌计数法明显低估了实际转位细菌，因为大多数细菌在穿过肠黏膜后即死亡。因此，细菌转位的增加，反映细菌穿透肠壁的能力增加及人体对其杀灭作用降低的综合结果。正常肠上皮具有选择性通透性，可吸收小分子物质及阻止高分子物质吸收，并通过细胞旁途径的特殊结构阻止>1.15nm（11.5A）的水溶性物质吸收。但在病理情况下，其通透性可增加。临床应用的经典肠通透性测定是通过监测胃肠道摄入小分子标记物进入人体循环的量进行的，常用两种不代谢的物质：一种为甘露醇，相对分子质量较小，可通过肠黏膜；另一种为乳果糖，相对分子质量较大，极少通过肠黏膜。可通过测定这两种物质的血尿含量，并根据二者的比例来评价肠黏膜的通透性。大小分子结合应用来测定患者的肠通透性，甘露醇与乳果糖是常用的一对。此外，还有乳果糖和鼠李糖、PEG3350和 PEG400、51Cr-EDTA和PEG400，另外还有许多配对方法。研究结果表明，细菌转位是通过转细胞而不是通过细胞旁通道而实现的。在细菌与肠细胞共同培养后，用电镜可发现细菌在绒毛细胞内出现，但有的研究也发现细胞间的间隙存在着细菌，提示细菌转位可通过细胞旁通道而实现。黏膜通透性增加并不一定伴有细菌转位，因此有人提出疑问：细菌转位与肠通透性增加是否是完全不同的现象？两者是否有机制上的某种联系？Well等表明，通过某些手段干扰，如用无钙培养液或与外毒素一起培养肠细胞，可明显增加其吞噬活菌能力。他们认为，正常时肠细菌容易黏附在肠细胞基底侧，较少黏附在肠细胞顶端。在病理情况下，细胞紧密连接松散，增加了对水溶性物质的通透性，并使细菌黏附增加，促进细菌转位。另一些资料表明，细菌黏附肠细胞后可增加肠细胞对水溶性物质细胞旁通透性增加，但有关机制不清楚，似乎是与细胞内贮存铁的释放致使细胞质内钙浓度增高有关。正常肠的细菌，特别是专性厌氧菌，可协同宿主的免疫防御作用，限制潜伏病原菌生长及其黏附上皮细胞。有人用抗细菌移生作用（colonization resistance）来描述肠道正常常驻菌群的保护作用。厌氧菌不仅是肠道最大的菌群，而且在抗细菌转位中有重要作用，用抗生素改变肠道菌群，可使肠对致病菌的抵抗力下降，导致病菌过度繁殖，厌氧菌肠屏障功能消失，致病菌直接与肠黏膜接触，穿透肠黏膜细胞，造成细菌转位。

肠相关淋巴网状组织（gut-associated lympho-reticular tissue）包括三个部分：Peyer小体、固有层及上皮内淋巴细胞。Peyer小体是黏膜和黏膜下淋巴组织小体，存在于整个小肠，来自肠道的各种抗原在Peyer小体中被淋巴细胞致敏后，刺激B淋巴细胞分化成熟，然后移至炎症部位，参与免疫反应。肠黏膜中还存在着一种特别结构，具有独有的、可通透的上皮细胞，称M细胞，其使淋巴组织暴露于固有层，M细胞对Peyer小体的抗原有促进作用。肠固有层有大量的浆细胞，大多数分泌IgA，其实肠内所含的抗体分泌细胞数量最多，超过所有组织的总和。固有层中还含有大量T细胞，大多为辅助性T细胞及诱导性T细胞。另外，固有层中还有10%左右为巨噬细胞。肠上皮内淋巴细胞是体内最大的淋巴样组织之一，占肠上皮细胞的15%，多数上皮下淋巴细胞为T细胞，其中以CD3及CD8为主。可分泌大量细胞因子，包括IL-3、IL-5及IFN-γ。一般认为他们是保护宿主免受真菌，病毒、细菌及内毒素感染的效应细胞。肠上皮细胞是肠黏膜屏障最关键的部分。肠细胞和具有特别结构的细胞间连接结构可防止肠道细菌和毒素、抗原穿过肠黏膜而不能进入体循环，上皮细胞顶端有一特殊连接结构，为紧密连接（tight junction），这个特殊结构的存在只允许肠道内营养物质、电解质及水的吸收，并阻止较大分子的物质包括毒素吸收。在正常情况下，肠上皮的通透性受许多因子调节，包括生长因子、细胞内cAMP水平，肠腔内渗透压、胰岛素、胰岛素样生长因子、蛋白激酶C激活剂等。许多资料表明，在病理过程中，肠上皮细胞通透性可明显增加。根据临床应用不同物质来测定肠通透性，如乳果糖、聚乙烯甘油400（PEG400）、甘露醇等，有人已提出三个不同通透性通道，即细胞旁通道、转细胞水通道及脂溶性转细胞机制。根据这个模型，较大分子水溶性物如乳果糖或51Cr-EDTA是经细胞间的充水小窗吸收的，而较小的物质包括单糖如L-鼠李糖和甘露醇是经胞质膜上的充水小窗通过上皮的，而PEG400主要是通过脂溶性机制而吸收的。Bjarson等最近提出另一肠通透性模型，认为从腺窝到绒毛，细胞旁通透性不断减低，因此大分子如乳果糖和51Cr-EDTA 在正常情况下仅在腺窝或近腺窝处细胞之间吸收，而小分子物质如L-鼠夺糖和甘露醇正常时沿着整个腺窝绒毛轴吸收，由于小分子物质的吸收面积大于大分子物质，因此小分子与大分子清除率之比应该是高的；在病理情况下，大分子物质吸收增加，超过小分子物质的吸收，致使小分子与大分子清除率的比例减少或近似相等；大分子吸收增加反映绒毛细胞间的紧密连接通透性增加，但这种现象也可出现在绒毛缩短时。有人发现不同种族动物的甘露醇与乳果糖清除率的比例相差很大，而体外实验表明，不同种类的小肠上皮对两种物质的通透性比值相仿，约0.8左右，因此不同种类两种物质的清除率不同，不能简单地用通透性不同来解释，一定有其他因素参与其中。绒毛微血管具有双向对流交换特征，使绒毛顶端持续处于高渗状态，由此吸引水的吸收并通过溶剂曳拉（solvent drag）作用，促进水溶性物质吸收。Bulsma等提出，由于细胞旁水通道直径的限制，溶剂曳拉作用只增加甘露醇的吸收，而不增加乳果糖的吸收，结果使乳果糖与甘露醇清除的比率降低。另外，甘露醇吸收还受Na+和葡萄糖的吸收增加的影响，使水吸收也增加，从而使水溶性小分子物质如甘露醇吸收也增加。

内毒素可以通过激活单核-巨噬细胞、中性粒细胞等细胞释放TNF-α等细胞因子，促使凋亡相关受体表达增加，如Fas、TLR2、CD14等，引起细胞凋亡。已经证实，休克时全身细胞，包括血管内皮细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞、主要脏器细胞，除了可以发生变性坏死外均可以发生细胞凋亡。用非致死剂量的TNF-α，IL-1，NO等刺激物攻击内皮细胞可以导致内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞凋亡，电泳时可以出现细胞凋亡的DNA 断裂的梯形图带。给小鼠腹腔注射内毒素6~8h后可出现大量的肠黏膜上皮细胞DNA链断裂，并发生凋亡。用盲肠结扎穿刺术造成败血症模型18～24h 后鼠肺泡上皮细胞、肝星形细胞、肾小管上皮细胞以及心肌细胞均出现凋亡。休克时，细胞凋亡是细胞损伤的一种表现，也是重要器官功能衰竭的基础之一。在内毒素血症中，抑制实质细胞的凋亡可以缓解多器官功能衰竭的发生，有利于宿主存活，提高败血症的存活率，也是内毒素血症治疗的重要一个方面。

需钙蛋白酶（calpain）为一种对Ca2+具有依赖性的中性蛋白酶，它与凋亡蛋白酶有明显不同（表21-2），有两种异构体（m-calpain和u-calpain），广泛存在各种细胞中，并以异源性二聚体（80000-29000）的酶原形式存在于静息细胞中。需钙蛋白酶可以被Ca2+和自身加工进行活化，能够被内源性蛋白质抑制物calpastatin 所调节。需钙蛋白酶参与细胞死亡，包括坏死和凋亡。需钙蛋白酶的底物为细胞骨架、胞膜结合蛋白（表皮生长因子、血小板衍生生长因子、信号转导依赖性和钙调蛋白依赖性蛋白质以及一些转录因子）。需钙蛋白酶与细胞凋亡时细胞膜和细胞骨架的变化相关。地塞米松诱导胸腺细胞凋亡时，在细胞形态学变化和DNA片段出现之前，细胞内的需钙蛋白酶活性升高，并且需钙蛋白酶抑制物可以抑制电离辐射和地塞米松诱导的细胞凋亡。Sarin用需钙蛋白酶抑制剂抑制HIV感染T细胞凋亡，从而使之恢复缺陷性免疫反应，这提示需钙蛋白酶抑制剂会在HIV感染的治疗中发挥作用。

凋亡蛋白酶（caspase）是半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteine-containingaspantate-specific protein）的简称，它是一组对底物天冬氨酸部位具有特异性水解作用、活性中心含半胱氨酸的蛋白酶。目前已知此组酶共有13种，命名为凋亡蛋白酶1～13，其中起凋亡作用的有凋亡蛋白酶3、6、7；起凋亡信号转导作用的有凋亡蛋白酶8、9。凋亡蛋白酶的激活可以通过以下几种方式：①受体激活途径，即死亡信号（如TNF-α等）通过与细胞表面的相应受体结合而激活.②通过线粒体激活，即在死亡信号作用下，线粒体细胞膜受到损失，释放出细胞色素c进入胞质，与凋亡蛋白酶激活因子、ATP和凋亡蛋白酶9形成复合物，最后使凋亡蛋白酶3激活。③另外，线粒体也可以通过Smac/DIABLO蛋白质[后者能够结合凋亡蛋白酶抑制物（inhibitor of apoptosis protease，IAP）]激活凋亡蛋白酶3，发生细胞凋亡。凋亡蛋白酶的作用有三个：①对抑制凋亡的因素，包括凋亡抑制基因产物如Bcl-2起灭活作用，即灭活细胞凋亡抑制物。②有蛋白水解作用，水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，促进凋亡小体的形成。③参加凋亡级联反应，水解相关活性蛋白，从而使得该蛋白质获得或失去某种生物学活性，如凋亡蛋白酶9可以促使凋亡蛋白酶3酶原水解形成具有分解蛋白质活性的凋亡蛋白酶3。