抗坏血酸(AsA)含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060911320982121](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060911320982121.png)
溶液的配制:
1.试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:试剂二为 1:250 的体积比例充分混匀,现用现配;
2.标准品:临用前配置,加入5.679 mL蒸馏水充分溶解,即10 mmol/L AsA;吸取0.04mL上述溶液,加入0.96mL蒸馏水,混匀,即 400 μmol/L AsA。
产品说明:
AsA又称维生素c。AsA是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂,AsA在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用,也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。
抗坏血酸氧化酶(AAO)催化AsA氧化生成DHA,通过测定AsA的氧化速率,即可计算出AsA含量。
技术指标:
最 低检出限:0.7539 μmol/L
线性范围:6.25-1400 μmol/L
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可调式移液器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。
2、细菌、细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);8000g,4℃离心 20min,取上清液置冰上混匀待测。
3、血清等液体:直接测定。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到265nm,蒸馏水调零。
2、 试剂二在25℃水浴锅中预热30min以上。
3、 标准管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL标准液、160μL试剂二和20μL试剂三,迅速混匀后于265nm测定,记录30s和150s的吸光值A1和A2。ΔA标准管=A1-A2。
4、 测定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL试剂二和20μL试剂三,迅速混匀后于265nm测定,记录30s和150s的吸光值A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。
注意:如果样本数量较大。可将试剂二与试剂三按照8:1的体积比混匀配成工作液使用,根据样本所需现配现用,禁止一次性配完。加样顺序为180 μL工作液、20 μL上清液(或标准液),加入上清液(或标准液)即开始计时。(标准管只需测定1-2次)
三、AsA 含量计算公式
1、 按蛋白浓度计算:
AsA (nmol/mg prot) =(C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样)÷(Cpr×V样)=400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷Cpr
2、 按样本质量计算:
AsA(nmol/g 质量) =(C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样)÷(W×V样÷V样总) =400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷W
3、 按细胞数量计算:
AsA(nmol/104 cell) =(C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样)÷(细胞数量×V样÷V样总)
=400×ΔA测定管÷ΔA标准管÷细胞数量
4、 按液体体积计算:
AsA (nmol/mL) =(C标准液×ΔA测定管÷ΔA标准管×V样)÷V样=400×ΔA测定管÷ΔA标准管
C标准液:标准液的浓度,400μmol/L=400nmol/mL;V样总:上清液总体积,1.0mL;V样:加入反应体系中上清液体积,0.02mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;细胞数量:以104为单位计量,万。
注意事项:
1、 试剂三和标准品现配现用,配制好的 4℃保存,3 天内使用完。
2、 如果样本初始吸光值大于 1.4,建议将样本用试剂一稀释后进行测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 山楂加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 20min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 Δ 测定管=A3-A4=1.0228-0.6627=0.3601,ΔA 标准管=A1-A2=0.3660-0.0090=0.3570,按样本质量计算含量得:
AsA(nmol/g 质量) =400×ΔA 测定管÷ΔA 标准管÷W =4035 nmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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