介绍

2019年底出现的新型冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的。 该病毒具有高度传播性，并使用血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 作为主要受体进入哺乳动物细胞。ACE2 是一种细胞表面蛋白，存在于许多细胞和组织中，包括肺、心脏、血管、肾脏、肝脏和胃肠道(Hamming, 2004)。 ACE2 在健康肺组织中适度表达，在慢性阻塞性肺病 (COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘、糖尿病和高血压等病理状况中高度表达 (Saheb Sharif-Askari, 2020)。 众所周

知，SARS-CoV-2 会感染呼吸道并传播到整个人体，导致多器官感染症状（de Melo，2021 年）。 因此，由于病毒对人类健康的严重影响，开发新的诊断方法、疫苗和抗病毒药物迫在眉睫。

在这项研究中，我们专注于生物打印原代人支气管上皮细胞或 Calu-3 细胞以生成气液界面 (ALI) 模型。Calu-3 是一种分化良好且具有特征的细胞系，来源于人支气管黏膜下腺 (Zhu, 2010)。 人肺的黏膜下腺是气道表面液体、粘蛋白和其他免疫活性物质的主要来源。

生物打印的肺病模型在 Transwell 插入物中培养 14 天，并对 ACE2 和粘蛋白 5AC (MUC5AC) 蛋白进行免

疫染色。 使用本应用说明中介绍的实验装置，可以研究宿主-病原体与 SARS-CoV-2 和气道上皮细胞的相互作用（Zhu，2010）。

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图 2. 第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14) 肺组织模型在 10 倍放大时的 H&E 染色。 位于构建体顶部的 Calu-3 和 HBE 细胞的上皮层。 比例尺=100 µm。

材料和模型

细胞准备

在肺组织模型中使用了两种不同的上皮细胞类型：人支气管上皮细胞（HBEpC；C-12640，PromoCell）和 Calu- 3（肺腺癌细胞衍生的上皮细胞；HBT-55，ATCC）。人肺成纤维细胞（HPF；C-12360，PromoCell）用作支持细胞。 在根据各自制造商的协议进行生物打印之前，将细胞解冻并在 2D 中扩增。 HBEpC在气道上皮细胞生长培养基（C-21060，PromoCell）中培养，HPF在补充有生长培养基2试剂盒（C-23020，PromoCell）的成纤维细胞生长培养基2中培养，分别用于第4代和第9代； 而 Calu-3 细胞在补充有 10% 胎牛血清 (FBS; 10270106, Gibco Thermo Fisher Scientific) 和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合物 (PSN; 15640055，Gibco Thermo Fisher Scientific）并用于第 4 段。

肺组织模型的生物打印

肺模型被设计成一个圆盘，底部有一个实心层，顶部有一个 5 层边缘（图 1A、1B）。 这样做是为了促进接种后上皮细胞的包埋。 该磁盘是用 GelMA-Laminin 521 (GelMA-LN521, CELLINK) 3D 打印的。 接下来，将 2 x 106 HPF 用胰蛋白酶消化、洗涤、收集、旋转并轻轻重悬于 100 µL 成纤维细胞培养基 2 中，然后将其小心地混合到1mLGelMA-LN521生物墨水中，预热至37°C并转移到琥珀色墨盒中（ CSO010311502，CELLINK）。 为了去除截留的气泡，将嵌入 HPF 的 GelMA-LN521 滤芯以 460g 离心 1 分钟。 在开始打印会话之前，将墨盒安装在 BIO X™ 生物打印机中设置为 27°C 的温控打印头（00000020346，CELLINK）中 20 分钟。 将药筒倒置 2 至 3 次以避免细胞沉淀。 GelMA-LN521 生物墨水的合适生物打印温度为 26°C 至 27°C。然后在 12 孔板中使用温控打印头在 27°C 下对圆盘篮进行生物打印。 首先使用 405 nm 光固化模块（距离设置为 5 厘米）对每个构建体光固化 12 个圆盘复制品，并将成纤维细胞生长培养基添加到每个孔中。 然后在添加上皮层之前，将圆片在成纤维细胞生长培养基中于 37°C 孵育 3 天。

图 3. HBE 细胞中 ACE2 的免疫染色。 在 ALI 培养的构建体上不同天的 ACE2（绿色）和细胞核染色 DAPI（蓝色）。 比例尺=100 µm。

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结论

该研究表明，3D 生物打印与 Transwell 细胞培养相结合可用于生成复杂的体外肺上皮模型。

* 体外 ALI 模型显示 ACE2 和 MUC5AC 蛋白的表达。

* 原代支气管上皮细胞在整个实验过程中保持紧密的单层，而 Calu-3 细胞在第 14 天形成多层上皮。

* 与腺癌细胞来源的 Calu-3 细胞系相比，ACE2 在原发性支气管上皮细胞中的表达中等。

* ALI 培养中生长的细胞变得极化，如培养物顶膜上 ACE2 的表达所见。