通过整合体外和计算机实验预测和阐明3D打印癌症细胞在水凝胶结构中的打印后行为-INKREDIBLE+

图1所示。本研究涉及的主要步骤示意图；步骤1：制备由明胶、海藻酸盐和MDA-MB-231细胞系组成 的生物链；步骤2：打印和交联承载细胞的3D结构；步骤3：进行印后体外检测；步骤4：开发和校准 一个硅模型。创建与BioRender.com。

硅内方法可用于补充体外实验并协助解决该3D方法的一些局限性10 -12 。常见的内部方法包括机器 学习(ML)方法和机制建模。机器学习模型可以进一步分类为深度神经网络、随机森林、支持向量机

(SVM)和树分类器。机器学习越来越多地应用于3D打印过程的不同阶段，如工艺优化、施工精度分析 、缺陷诊断和生物墨水性能预测13 。例如，Xu等人14 成功地使用ML方法创建了一个预测模型，以良好  的灵敏度预测细胞活力，并评估各种工艺参数(包括紫外线强度和紫外线曝光时间)对基于立体光刻的  3D生物打印中细胞活力的重要性。多项研究也试图开发不同的基于ml的技术来优化生物墨水的可打印 性。例如，Lee等人15 使用多元回归分析证明了印刷适性与油墨机械特性之间的关系。然而，尽管ML模 型在生物医学领域的应用取得了很大的进展，但由于数据收集的过程和研究的目的，这种方法面临着 一些局限性。

为了做出准确的预测，机器学习模型需要大量的数据，选择合适的算法，并确定感兴趣的输入

和输出16 。从生物打印研究中获取大量数据可能是不切实际的，这些研究涉及昂贵的细胞和材料以及   耗时的过程。ML应用程序的另一个常见挑战是它们可能难以解释。这可能会导致寻求生物打印结构中 细胞行为机制解释的研究人员缺乏信任17 。相比之下，机制建模关注的是通过对潜在机制的假设来描   述现象。机制模型包括随机和基于主体的模型、离散模型、常微分方程(ode)和偏微分方程(PDEs)。这 种机制模型可以提供洞察生物打印结构中细胞行为的机制方面。因此，它们是我们在这项研究中首选  的数学技术。

作为生物3D打印过程的一部分，对机械建模和仿真的研究越来越多。例如，有多项数学研究预  测了施加在喷嘴中的生物链接和细胞上的剪切应力18, 19 ； 基于生物墨水材料性能的最终打印结构力学性 能预测20 ；并模拟生物链接的沉积过程和3D结构的最终形状9 。这些数学技术试图模拟生物打印过程-在 生物打印过程中和之后-研究不同参数对生物打印的各个方面的影响，包括细胞活力和结构稳定性。

然而，关于细胞嵌入生物3D打印结构的打印后行为的全面计算研究尚未报道。这样的数学研究 可以为研究人员提供更多关于打印后细胞功能的见解，并允许他们预测复杂的细胞活动和优化细胞微 环境，通过将实验评估保持在最低限度来节省金钱和时间。这是第一项旨在开发体外和硅生物3D打印 乳腺癌模型的整合研究，以研究嵌入生物3D打印结构中的乳腺癌细胞群的打印后行为（图1 ）。在体  外研究中，我们使用了MDA-MB-231细胞系，这是癌症相关研究中最常用的最具侵袭性的乳腺癌细胞 系之一。为了开发生物墨水，选择明胶和海藻酸盐的混合物作为3D生物打印中最常见的生物墨水材料

,因为它具有与天然ECM相似的特性，并且具有适合生物打印应用的生理和生物学特性21 。在我们的  计算机研究中，我们选择了元胞自动机建模，其中大部分参数都是从实验数据中选择的。为了提高模 型的可靠性，还进行了全面的体外实验。

本研究中提出的基于主体的模型有利于展示复杂的细胞系统，包括细胞增殖、运动、细胞与环 境的相互作用（例如，ECM、邻近细胞和资源消耗）以及支架内的细胞聚集。在这项研究中，我们证  明了数学模型和计算机模拟可以用来捕捉体外动力学。这种体外和芯片研究的结合可以提高研究人员 对3D生物打印结构中细胞活动的理解，从而加速和提高优化和实验设置的准确性。所提出的硅模型是 非常有前途的，并能够进一步发展，应用于3D细胞培养使用生物打印技术在不同的生物医学应用。

结果与讨论

体外细胞研究。成功打印出肿瘤样水凝胶网络模型（图2 a）。为了确定包埋在水凝胶中的MDA-MB-  231细胞的增殖情况，采用MTT法监测细胞在第0、4、7、10和11天的代谢活动。如图2 b所示，与第0天 相比，3D细胞/水凝胶构建的MDA-MB-231细胞在第4、7、10和11天分别表现出1.86倍、2.7倍、2.78倍 和2.8倍的增殖。确实，细胞在前7天表现出快速增殖，从第7天到第11天几乎保持了几乎稳定的细胞  增殖。有趣的是，结果表明，在3D微环境中封装的MDA-MB-231的倍增时间比在2D培养中生长的细胞高 3倍，这可以归因于3D基质中细胞活性的降低22 。从第7天到第11天，增殖细胞的数量大致保持不变，

留下了一个问题:细胞是死亡还是由于不希望的条件进入非增殖期（静止期）。为了回答这个问题， 在11天的时间里，我们进一步采用了活死实验和Ki-67免疫染色，以更好地了解包裹在3D支架中的细 胞行为生长

采用活死染色法观察MDA-MB-231 在11天内的生存能力，结果与 MTT试验结果。如图2 所示，打印 后大部分细胞都能存活，第0天细胞存活率为76±2%，这清楚地表明生物打印过程对细胞活力的损害  较小。第1周存活率逐渐提高，第4天和第7天分别达到98±1%和99±1%。因此，该结构具有足够的多  孔性，使氧气和葡萄糖能够通过水凝胶支架扩散和分布，为细胞提供适宜的生存环境。从第7天到第1 1天，虽然有部分细胞死亡，但大部分细胞存活，第11天存活率达到96±2%。通过对比活死实验和MTT 实验的结果，可以得出结论，在支架达到最大容量的7天后，有相当一部分细胞进入了静息期，部分  细胞在长期静息期开始死亡，或者是由于缺乏资源。本实验中的细胞死亡几乎可以忽略不计，这说明 明胶/海藻酸盐支架在生物打印中的应用前景广阔。

为了观察MDA-MB-231的增殖能力，将细胞固定，并使用抗Ki-67抗体在共聚焦显微镜下对增殖细 胞进行成像（图3 ，4 ）。Ki-67是一种常用的标记物，在细胞周期的所有活跃阶段都存在，但在细胞  的固定阶段则不存在23 。结果表明，在第0天和第4天，ki-67的阳性细胞分别接近98±1%和95±2%，而 在第7天，这一数字下降到86±2%，然后在第11天急剧下降到约48.2±2.4。这一结果与前面的数据一 致（图3 ），说明在7天内，细胞不仅存活，而且保持了增殖能力。从第7天到第11天，尽管有很大比  例的细胞存活，但由于缺乏足够的细胞增殖空间，它们处于静止状态，无法再增殖。此外，在第7天  和第11天，细胞变得更加聚集，特别是靠近毛孔，细胞聚集中心的细胞由于被其他细胞包围而显示出 不增殖。因此，由于没有足够的空间放置子细胞，并且由于聚集体中心缺乏营养和氧气，增殖过程被 中止。

将体外实验结果用于参数化所建立的数学模型。

图2 。(A)：利用生物3D打印技术制备细胞/水凝胶结构；(B)：从第0天到第11天，MDA-MB-231在水 凝胶网络中包埋的增殖。误差条表示±SD, n≥3。

图3 。从第0天到第11天，使用荧光活/死检测试剂盒，显微镜图像显示了3D水凝胶构建中的MDA-MB- 231细胞的活力。分别用calcein-AM 和 PI 对活细胞和死细胞进行染色（绿色为活细胞；红色代表死细 胞）。使用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像。比例尺，50 μm(放大图像，比例尺，30 μm)。

硅细胞研究。使3D生物打印技术优于其他3D细胞培养技术的一个基本特性是它提供了对创建结

构的精确控制。这种特性为制造具有可控结构和机械性能（如孔隙度、渗透性和刚度）的仿生结构提 供了机会24 - 26 。然而，分析打印后支架内的细胞行为仅取决于执行不同的体外测量。实验测量生物3D打 印结构中细胞行为的某些方面是具有挑战性的，因为缺乏精确的定量技术，例如定义细胞-细胞和细  胞-微环境相互作用。这个问题促使我们开发了一个数学框架来模拟打印后支架内的细胞行为。这个  框架不仅要克服这些挑战，而且要在不重复实验的情况下准确地设计和预测打印后的细胞功能。

使用元胞自动机的基于个体的建模是在细胞水平上模拟细胞生长的时空机制的一种方法27 , 28 。这 种方法是一个动态系统，包括细胞网格，每个细胞都有一组离散状态29 。近年来，CA模型被广泛用于 研究基于各种静态自动机规则的不同癌细胞机制30 。然而，到目前为止，还没有研究将CA建模应用于 使用3D生物打印技术3D培养癌细胞。我们选择这种数学方法来模拟封装在3D生物打印结构中的细胞生 长，因为它能够捕捉3D打印结构的空间特性，并且能够灵活地探索不同的假设。此外，由于从体外实 验中获得的数据包含离散形式的细胞，因此这种离散数学技术将更准确地模拟这一过程。本研究中开 发的框架代表了细胞增殖、活力、运动和与环境相互作用的规则，包括水凝胶和邻近细胞，以及水凝 胶网络内的簇形成。本文中演示的计算机结果基于n=100次模拟运行的平均值和标准偏差，其中n是由 一致性分析驱动的（补充材料，一致性分析）。

图5 显示了在体外和在硅材料中支架内11天的细胞增殖模式，说明它们彼此一致。在细胞增殖  过程中，初始细胞密度和支架容量是我们分别指定为初始变量和C变量的两个关键参数。这些参数的  相应值通过校准来确定，以产生与体外研究的最佳拟合。请注意，所开发模型中的初始细胞密度代表 了薄层内可以相互作用的细胞的有效初始种群，而不是支架中细胞的总数。因此，与实验设置中的细 胞密度相比，模拟细胞密度减少了一个比例因子。结果表明，模拟细胞和实验细胞均在7天后达到最  大细胞密度。细胞在支架中达到最大密度所需的时间在很大程度上取决于初始细胞的数量和打印支架 的容量。初始细胞数量越多，支架容量越小，细胞越早达到最大细胞密度，越早停止增殖。因此，通 过微调这些参数并在不同情况下进行模拟，研究人员可以设计实验以获得所需的结果，而无需重复体 外分析。

模拟数据也能够一致地复制活力和增殖实验结果。如前一节所述，虽然细胞在打印后7天内的存 活率约为99%，但在第7天至第11天，死亡细胞的数量略有增加，此时大部分细胞处于静止期。因此，

图4 。生物3D打印构建体中包裹的MDA-MB-231细胞的Ki-67染色。用Alexa Fluor 546和Hoechst 33 ， 342标记的抗ki-67抗体对细胞进行染色（红色表示ki-67阳性细胞;蓝色表示所有单元格）。使用激光 扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像。比例尺，50 μm（放大图像，比例尺，30 μm）。

为了精确地模拟体外条件，我们假设细胞保持在一个延长的固定期超过指定的小时，由一个随机数字 （Cd）定义，开始以指定的概率（Pd）死亡。这种观察结果可以从生物学上解释为细胞在进入细胞静 止期后无法重新进入细胞周期。

图5 显示了在水凝胶网络中生长的硅MDA-MB-231细胞的快照；以及细胞三维结构的体外显微图 像。在这张图中，你可以看到细胞分布和细胞团形成的进展在0 ，4 ，7和11天的体外和在硅。在计算机 图像中，黄色、红色和黑色细胞分别代表增殖、非增殖和死亡细胞。

第0天，少量细胞分布在水凝胶网络内。随着时间的推移，细胞增殖，产生了最初的两个细胞群 , 然后是更大的细胞群。与体外观察相似，到第11天，存活率保持在100%左右，第11天存活率略有下  降，为93.74±0.5%0。此外，模拟细胞增殖随着时间的推移而下降，并且在7天后由于达到支架的最大 容量而显著下降;最终在第11天降至54.14%±0.25%。11天水凝胶支架内细胞生长的动画也可在补充材  料中获得(图S3)。

除了细胞活力和增殖外，另一个重要因素是细胞在周围基质中移动的能力。这种模拟也可以应  用于分析细胞运动以及水凝胶网络中形成的肿瘤簇的结构和分布，而无需实验评估。肿瘤簇可能是由 于邻近细胞之间或亲本和子细胞之间的相互作用而产生的，这取决于它们的位置和微环境31 。事实上， 细胞通过细胞间的物理和信号相互作用进行协调，并形成集群。

在图S1(补充材料)中，细胞表现出向支架孔爬行的趋势，然后在这些孔周围形成簇，因为必需  资源在那里更集中，特别是在7天后。这一事实表明，水凝胶网络具有有限的资源运输能力。因此，我 们定义了细胞-细胞信号(LC)和细胞-孔吸引（Lp）的特定吸引力范围，以考虑不同的细胞迁移方向。

运动速度是影响星团形成的另一个重要参数。Fallica等研究表明，由于材料刚性和细胞受体的锚定作 用，癌细胞在三维微环境中运动受到抑制，且运动速度极低22 。因此，基于本研究和以往研究的观察， 我们对细胞运动速度进行了校准。在运动过程中，每个个体在特定时间(定义为mC)沿着基于细胞吸引  力确定的方向运动。在校准过程中，通过比较体外和计算机上的结果，得出的结论是，与支架表面/孔 隙(Lp)相比，在较小的吸引力范围(LC)内，细胞向邻近细胞移动的倾向较小。在模型中应用这些规则  (图6 )，细胞在运动和簇形成方面模仿体外细胞行为。该模型的结果与先前的研究一致22 ,32 。

总的来说，该模型是为了结合体外3D生物打印评估而开发的，从而对整个3D制造结构进行全面 分析。该模拟的主要应用之一是预测在未实践的微环境中打印后的细胞行为，从而提高其复制所需生 物设置的能力。例如，该模型提供了评估不同重要参数(如各种初始细胞密度)在长期内对细胞行为的 影响的机会。这有利于研究人员在不需要重复实验的情况下产生更适合细胞生长的微环境。例如，他 们可以从大小或结构形状方面设计支架， 目的是修改支架的容量，以提高细胞增殖和减少细胞死亡。

硅学模型验证。为了进一步验证硅模型，我们在两种不同的情况下使用不同的实验变量进行生物打印

过程：情况1：不同的初始细胞密度；案例2：不同的生物油墨配方。在案例1中，我们使用含有4% (w/ v)明胶、4% (w/v)海藻酸盐和1.5×1 06 MDA-MB-231细胞mL - 1的生物墨水进行生物打印。案例2：我 们使用终浓度为4% (w/v)明胶、5% (w/v)海藻酸盐和2×1 06 MDA-MB-231细胞mL - 1的生物墨水进行  生物打印实验。使用校准的计算机模型，我们想预测细胞在这两种新条件下的增殖模式。

图7显示了病例1在体外和在计算机上10天的细胞增殖模式，说明它们彼此一致。在硅模型中，除 Cinitial(初始细胞密度)外，所有参数与校准模型中的值相同。与实验设置中的细胞密度相比，模拟

图6 。中间的面板显示了MDA-MB-321在硅三维水凝胶结构中的生长情况;黄色代表增殖细胞;红色代表 非增殖细胞;黑色代表死细胞。左右两张图分别为第0天、第4天、第7天和第11天在相差显微镜下观察 到的包裹在3D水凝胶结构中的MDA-MB-231细胞:比尺，50 μm。