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小分子多肽的分离纯化

2020/09/16 14:07

阅读:408

分享:
应用领域:
制药/生物制药
发布时间:
2020/09/16
检测样品:
化药制剂
检测项目:
含量测定
浏览次数:
408
下载次数:
参考标准:
小分子多肽

方案摘要:

随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟,越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。因适应症广、安全性高且疗效显著,多肽药物已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗,具有广阔的开发前景[1]。在多肽药物的制备方法中,固相合成法具有产率较高且能够实现自动化等优点。然而,其缺点也十分明显,即每步中间产物不能纯化,且最终产物必须经过可靠的分离手段进行纯化。常用的多肽分离纯化方法包括离子交换色谱法(IEC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)等,这些方法存在样品载量低、分离介质价格昂贵、分离设备复杂且成本高昂等缺点。本文以胸腺五肽为样品,通过SepaFlash Bio C18反相柱与SepaBean machine联用,成功地实现单次进样即可获得高纯度(>94%)的多肽产品,为此类小分子多肽样品的分离纯化提供了一种高效、快速且成本低廉的解决方案。

产品配置单:

分析仪器

SepaBean machine 2快速制备液相色谱

型号: SepaBean machine 2-专家型

产地: 江苏

品牌: 三泰

¥20万 - 30万

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SepaBean machine快速液相制备色谱

型号: SepaBean machine

产地: 江苏

品牌: 三泰

¥20万 - 30万

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设备配件

键合相系列 SepaFlash快速液相制备色谱柱

型号:

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方案详情:

实验部分

1. 样品

文中所用多肽样品为胸腺五肽(Thymopentin,以下简称TP-5),TP-5是胸腺生成素II32-36位的氨基酸残基片段。TP-5的分子式是C30H49N9O9,分子量为679.41 Da,其化学结构式如图1所示。本文中的TP-5粗品采购自无锡亚肽生物科技有限公司。

图片1.jpg 

1. 胸腺五肽的化学结构式。

TP-5主要具有诱导T细胞分化,促进T淋巴细胞亚群发育并活化的功能。临床上TP5主要应用于治疗肿瘤、单纯疱疹、类风湿性关节炎、艾滋病、严重免疫缺陷综合征和慢性乙型肝炎等疾病[2]

2. 仪器和设备

本文所用Flash柱为12g SepaFlash Bio系列C18反相柱(货号:Bio-SW-5223-012-SP),填料粒径15μm,孔径100Å。此Flash柱与一台快速液相制备色谱仪联用,用于TP-5样品的快速制备纯化。

TP-5粗品及纯化后产品的纯度分析采用Agilent 1100 HPLC系统,所用分析柱为Diamonsil 5μm C18分析柱(4.6 x 150 mmDikma)。流动相及洗脱梯度设置参见表1

1. HPLC流动相及洗脱梯度设置

流动相

Solvent A(5%乙腈,0.05%三氟乙酸)

Solvent B乙腈

流速

1.0 ml/min

洗脱梯度

% Solvent B

Time / (min)

0

0

0

3.0

30

6.0

100

12.5

0

13.0

0

15.0

TP-5纯化后产品的质量数确认采用一台LC-MS系统,为Shimadzu LC10A液相色谱仪与AB Sciex API2000质谱检测器联用,所用HPLC柱为ZORBAX 3.5μm XDB-C182.1 x 50 mm, Agilent)。流动相及洗脱梯度设置参见表2

2. LC-MS流动相及洗脱梯度设置

流动相

Solvent A(5%乙腈,0.05%甲酸)

Solvent B乙腈

流速

0.5 ml/min

洗脱梯度

% Solvent B

Time / (min)

5

0

60

2.0

60

4.0

5

4.2

0

6.0

3. 实验方法

45mgTP-5粗品溶于1mL甲醇-水溶液中(v:v = 3:7),然后利用注射器将样品溶液加入Flash柱中,之后开始进行Flash制备纯化。实验相关参数设置参见表3.

3. Flash制备实验参数

仪器

SepaBean machine

色谱柱

12g SepaFlash Bio C18反相柱

(填料粒径15μm,孔径100 Å,订货号:Bio-SW-5223-012-SP

样品量及上样方式

45 mg粗品,溶解后注射器进样

检测波长

220 nm254 nm

流动相

Solvent ASolvent B甲醇

流速

20 ml/min

洗脱梯度

% Solvent B

Time / (min)

10

0

90

10.0

90

12.0

结果与讨论

本文中,45mgTP-5粗品(纯度80.5%,参见图2)在溶解后进样,利用12gC18反相Flash柱仅通过单次实验即可完成全部样品的分离纯化,纯化色谱图如图3所示。将编号为002003的两管收集组分合并,经冻干处理后,称重为27.5mg,利用HPLC分析其纯度为94.1%(参见图4),则可以得出TP-5的回收率为75.3%。经LC-MS鉴定,确认产品的分子量符合预期(参见图5)。

在传统的制备反相高效液相色谱法中,由于上样量的限制,通常需要分多次进样才能完成本文中所用样品量的全部纯化。与之对比,本文中采用的Flash制备方法大大缩短了实验过程,节省了人力和物力,且制备方法易于放大规模,为TP-5这类小分子多肽生产过程中的大规模制备纯化提供了一种经济高效的解决方案。

图片2.jpg 

2. TP-5粗品的HPLC分析图谱。

图片3.jpg 

3. TP-5粗品的Flash制备图谱。

图片4.jpg 图4. TP-5纯化后产品的HPLC分析图谱。

图片5.jpg 图5. TP-5纯化后产品的LC-MS图谱。


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