谷氨酰胺衍生物类样品的分离纯化

实验部分

本文中待纯化的样品来自某制药公司，为谷氨酰胺衍生物类物质，极性很大，其分子结构式示意图参见图1，粗品纯度约为73%（HPLC分析图谱参见图2）。

图1. 谷氨酰胺衍生物类样品分子结构式示意图。

图2. 粗品的HPLC分析图谱。

取1.5 g样品溶于1 mLDMSO，超声使之完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。

表1. Flash制备纯化实验参数设置

结果与讨论

首先，我们利用一根普通C18反相柱对少量样品进行了纯化实验，样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图3所示。

图3. 样品在普通C18柱上的Flash分离图谱。

分析图3可知，样品在普通C18反相柱上几乎没有得到保留，随着样品溶剂DMSO一起直接从Flash柱上被流动相洗脱下来，因此目标产物未能与样品中的杂质有效地分离。对于这一结果，我们认为原因可以归结于固定相的疏水坍塌效应。在反相色谱中，常用的洗脱溶剂按照其洗脱强度（Elutropic strength）可以排序为：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<异丙醇。对于极性很大或亲水性很强的样品，为了确保这类样品与分离柱固定相能产生足够的保留作用，通常需要使用高比例的水相体系作为流动相，有时甚至需要用到100%的水相。在采用纯水相体系（包括纯水或纯盐溶液）作为流动相时，C18反相柱固定相上的长碳链由于疏水作用会趋向于避开纯水流动相而互相搅合到一起，导致色谱柱瞬间保留能力下降甚至毫无保留作用，此种现象称之为固定相的疏水坍塌（参加图4左边部分）。这种情况虽然可逆（可用甲醇或乙腈等有机溶剂冲洗），但是会对色谱柱造成一定的损坏，因此需要尽量避免这种情况的发生。此外，对于大极性或强亲水性样品的分离纯化，普通C18反相柱就显得有点无能为力了。

图4. 普通C18柱和C18AQ柱硅胶表面键合相示意图。

针对上述情况，色谱填料生产厂家进行了技术改进，通过在硅胶基质表面进行一些修饰，如引入亲水的氰基（参见图4右边部分），使硅胶表面的亲水性更强，从而防止疏水坍塌现象的发生。此类经过改性的C18柱被命名为C18AQ柱，即亲水性C18柱，专门为高水相洗脱条件设计，可以耐受100%水相体系。C18AQ柱已被广泛应用于有机酸、缩氨酸、核苷以及水溶性维生素等强极性化合物的分离纯化。

我们利用一根C18AQ柱对样品进行了的分离纯化，样品在C18AQ柱上的Flash制备图谱如图5所示。分析图5可知，谷氨酰胺衍生物类样品在C18AQ柱上获得了足够的保留作用，粗品中的其他杂质得到了有效的分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度超过98%（参见图6），可以用于下一步的研究开发。

图5. 样品在C18AQ柱上的Flash分离图谱。

图6. 纯化后目标产物的HPLC分析图谱。

结论

由于固定相疏水坍塌效应的影响，限制了普通C18反相柱应用于谷氨酰胺衍生物类大极性样品的分离纯化，而改进过的C18AQ柱克服了上述效应的影响，在本案例中被成功地应用于此类样品的制备纯化。因此，对于大极性谷氨酰胺衍生物类样品的分离纯化，SepaFlash^® C18AQ反相分离柱配合SepaBean^® machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。