概述
信使RNA(mRNA)的poly A尾是腺苷的重复序列(A),它是疫苗和基因疗法开发中常见的形态。在3'端,该尾巴长度的增加为“核心”序列提供了额外的稳定性,该序列可保证细胞核中mRNA的稳定和细胞质中mRNA的降解,调配mRNA与核糖核蛋白的结合以及随后的宿主免疫反应。鉴于mRNA稳定性的挑战以及当前递送方式的挑战,了解poly A尾降解的情况是改善治疗的重要方式。在此应用中,使用RNase H酶酶解了1250个核苷酸的mRNA核苷酸链,然后将其进样到Biozen 2.6μm Oligo中。我们证明了HPLC和高分辨率质谱法(HRMS)区分自然降解的聚A尾的能力。
LC条件
色谱柱:Biozen 2.6μm Oligo
规格:50x2.1mm
货号:00B-4790-AN
流动相:
A: 95mM HFIP, 5.7mM DIEA水溶液
B: 7.1mM HFIP, 2.1mM DIEA于80%甲醇溶液
梯度:
Time (min) | %B |
0 | 3 |
45 | 35 |
45.6 | 80 |
50 | 80 |
50.5 | 3 |
60 | 3 |
流速:0.3mL/min
进样量:5μL
温度:70℃
检测:HRMS
HRMS 条件
扫描方式:Full MS
极性:负极
分辨率:140,000
AGC目标:3e6ms
Max IT:200ms
扫描范围:450 to 3500m/z
扫描方式:MS2
分辨率:35,000
AGC目标:1e5ms
Max IT:50ms
离子源:HESI
离子源温度:320℃
鞘气压力:30psi
辅助气压力:8psi
电喷雾电压:3000V
S-lens RF Level:50
辅助气体温度:30℃
图表1. 总离子流图中的单核苷酸分辨率:Poly A尾<5ppm
图表2. mRNA Poly A尾长度与相应保留时间
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