质谱碎片离子表示方法

浙江大学求是特聘教授方群是化学系微分析系统研究所所长，国家杰出青年基金获得者。自1998年开始从事微流控芯片分析的研究工作。目前研究方向包括微流控液滴分析，微流控液相色谱、质谱和毛细管电泳分析，微型化分析系统研制，以及微流控系统在单细胞多组学分析、人工智能+化学、高通量筛选、微量生化分析、临床分析和现场分析中的应用。其团队在基于深度学习的糖肽碎片质谱预测方面取得重要成果，并发表在Nature Communications，方群教授为通讯作者。液相色谱和串联质谱的联用（LC-MS/MS）是蛋白质组学和糖蛋白质组学研究中被广泛使用的方法，其核心是将碎片的谱图与候选肽段的理论或者实验谱图相匹配来鉴定肽段。目前所使用的大多数匹配方法是基于数据库搜索来实现的，其评分高低的依据是肽段或者糖肽的碎片离子的存在与否。但是这种搜索模式忽略了碎片离子的强度，作为一种补充的方法，基于谱图库的搜索会考虑碎片的存在和强度，从而产生更多的评分，并且可以应用于非数据依赖型的采集模式（DIA）。谱图库的数据来源除了实验，还可以通过预测的方式生成。目前，基于深度学习的方法已经在蛋白质组学当中得到了应用，可以预测蛋白酶酶切效率的可检测性，保留时间，离子淌度质谱中的碰撞截面积，MS/MS中的碎片离子强度，以及翻译后修饰的位点。预测谱库可以直接由蛋白质序列信息生成，并且基于特征评分模型已经可以区分真实信号和噪音。但是目前的方法仍旧无法预测完整糖肽的碎片谱图。作者在传统的线性长短期记忆网络的基础上，引入了树结构的长短期记忆网络用于分析聚糖结构，并且利用带有注意机制的图形神经网络来分析糖肽的碎片化途径。具体地，糖肽在被输入模型之前被分为肽部分和聚糖部分，肽段部分分为序列和修饰，分别以独热编码和元素组成表示。聚糖部分则被表示为一颗由单糖为节点，糖苷键为边的树结构。然后分别采用两个线性的和两个树结构的长短期记忆网络来预测谱图，第一个线性的长短期记忆网络用于分析肽段的序列信息，第二个线性的长短期记忆网络用于分析肽段特征并预测b/y离子的强度。第一个树结构的长短期记忆网络则用于自下而上（非还原端到还原端）地分析聚糖结构，第二个树结构的长短期记忆网络则自上而下的分析聚糖特征。最后将肽部分和聚糖部分合并，得到糖肽的预测谱图。（如图1所示）图1.糖肽碎片预测谱的模型 a输入的糖肽包括一个肽序列和一个聚糖树。b肽序列经线性长短期记忆（LSTM）网络处理。c通过树状LSTM网络遍历多糖树。d, e线性提取的肽特征与树状LSTM提取的聚糖特征相互融合。然后通过另一个线性LSTM网络对肽段特征进行处理，预测肽段b/y碎片的相对强度。糖的特征被另一个树状LSTM网络遍历，更新糖树中每个单糖节点的特征。f潜在裂解位点的特征由裂解后丢失或保留的单糖节点聚集而成。从相应的裂解中聚集结构特异性聚糖碎片的特征，以预测Y离子的相对强度，其中结构异构体碎片被组合。g肽和聚糖碎片离子最终合并形成输出的糖肽谱。作者随后使用不同仪器设置的Orbitrap质谱获得的不同生物数据集对模型进行了训练和验证。在使用数据集进行训练之前，将其随机划分为三个子集，其中3/5用于拟合模型参数，1/5用于控制过拟合，剩下的1/5不参与训练(保留)用于性能估计。在Mouse 1和Human 1数据集上进行基准测试，用光谱角损失（SA）和点积（DP）作为判断的依据，碎片谱预测获得了非常高的相似性(图2a)。在训练集和保留集之间没有观察到实质性的指标差异，表明模型不是过拟合的。在此过程中发现，碰撞能量（CE）参数的设置相较于聚糖部分会对肽段部分产生更多的影响，因此在后续的过程中，还优化了CE参数的设置，并提高了预测的准确性（图2c,d）。用排除高甘露糖肽的数据集对带有分支的模型进行重新训练和验证，结果表明Y离子保持良好预测性能的情况下，B离子在不同生物和仪器设置下具有相当高的相似性，从而实现对整体的准确预测。图2.预测性能评估 a Mouse1和Human1的训练集或保留集中所含糖肽的预测碎片离子强度与实验碎片离子强度之间的谱图相似性分布。b在Human1中，糖肽谱图匹配的镜像图比较了预测碎片强度和实验碎片强度。c模型微调后Mouse2和Human2的谱图相似度分布。d比较Human2中预测和实验碎片强度的镜像图。分别计算肽b/y离子和聚糖y离子的谱图相似性，以及肽和聚糖离子的总谱图相似性。此外，作者探究了模型区分不同糖肽的聚糖异构体能力，从MS/MS数据集中选择非高甘露糖糖肽的谱图匹配作为查询谱图，进行谱库搜索。对于每个谱图匹配，候选糖肽是通过在预定义的聚糖空间中用其结构异构体替换原始聚糖来生成的。然后将查询谱与每个候选糖肽的预测谱进行比较，并计算它们之间的相似性度量(图3a)。图3b是从总共有超过1、2或3个候选谱图的情况中计算出正确鉴别被列为第一、第二或第三候选谱图的百分比。71%-80%的谱图匹配是正确的，并有92%-95%的概率能够在前三名的候选谱图中包含正确预测。此外还分别采用糖苷酶酶解和敲除的方式对末端的HexNAc和核心岩藻糖的鉴别进行了评估，结果如图3c,d所示。图3. 利用预测谱库区分结构异构体糖肽。a将查询谱与具有异构体聚糖结构的候选糖肽的预测谱进行比较，然后根据谱相似度评分对其进行排序。b标准糖肽数据集的候选排序结果。正确鉴别被列为第一、第二或第三候选的谱图的百分比由总共有超过1、2或3个候选的情况计算出来。前三名的图表显示了在有三个以上候选的案件中，正确鉴别在前三名候选中所占的百分比。c内糖苷酶处理末端HexNAc去除示意图。d利用预测谱库对内糖苷酶处理的小鼠脑数据集进行再分析，得到末端HexNAc识别的混淆矩阵。e在Fut8基因敲除小鼠中，核心岩藻糖消失，而在野生型小鼠中则保留。f通过重新分析Fut8基因敲除和野生型小鼠大脑数据集得出核心岩藻糖识别的混淆矩阵。 最后，作者将预测的谱图库与实验所得的DDA数据库分别用于DIA的数据检索，考察预测谱图是否能为DIA的数据检索带来更多的糖肽采集。在酵母的数据集分析中，与DDALib相比，预测谱库导致检测到的糖肽前体和位点特异性聚糖损失高达10%，但数据完整性略好。而在更加复杂的人类血清数据集中，预测的谱图库比DDA数据库所得的糖肽前体和位点特异性糖肽都更多（糖肽前体多7%，位点特异性糖肽多10%）。此外作者还生成了一个扩展的预测谱图库（PredExt），得到了更多的糖肽覆盖，在DIA的数据采集中也覆盖了更多的糖肽前体和位点特异性糖肽。并且对预测谱图库进行了精度的评估（图4d）。计算了不同混合比例样品间测得的糖肽丰度的倍数变化(图4e)。使用预测的谱库，与使用DDALib相比，人类糖肽丰度的倍数变化略高，而酵母糖肽的定量精度接近甚至有时优于DDALib。结果表明，预测谱库与实验谱库性能相当，适用于DIA数据分析。图4.DIA分析预测谱库的性能。a每次检测血清样本的鉴定数量。“full”表示在所有运行中观察到的识别 “shared2/3”表示在2次运行中观察到的识别 “unique”表示仅在一次运行中观察到的标识。b各批次血清样本的累积鉴定数。“full”表示在累积运行中共享的标识 “saprse”表示在累积运行中至少一次运行中观察到的标识。c使用不同文库shared2/3次血清样本的鉴定次数比较。d量化结果的变异系数(cv)。显示中位数。e混合生物样品定量结果倍数变化的箱形图可视化。根据每个样本三次重复的平均数量计算百分比变化。

大家好，本周为大家分享一篇2024年发表在Analytical Chemistry上的文章，Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的常乘研究员以及中国科学院大连化学物理研究所的王方军教授。　　在过去的十年里，UVPD (193nm)因其出色的碎裂效率而备受关注。它能够产生a/x, b/y, c/z等多种类型离子，并能够对小于30 kDa的蛋白质提供近乎完整的序列裂解。它是完整蛋白表征的有利工具，能够提供序列、PTM、次级结构等丰富信息。常规的UVPD分析主要依赖于识别N-端或C-端碎片(a/x, b/y, c/z)，尽管已经满足大部分的小分子蛋白质(　　图2. Panda-UV工作流程　　通过在三种模型蛋白质上进行全面基准测试，展示了Panda-UV强大性能(图3)。内部片段的加入使得识别的片段数量提高了26%，并将平均蛋白质序列覆盖率提高到了93%，解锁了模型蛋白质中最大蛋白碳酸酐酶II的隐藏区域。此外，平均65%的内部片段可以在多次重复实验中被识别，展示了Panda-UV识别片段的高置信度。与现有的内部片段匹配软件ClipsMS进行对比，Panda-UV通过对代码框架的优化，搜索模型蛋白的一个质谱数据不超过9分钟，比ClipsMS快50倍。最后，在分析单克隆抗体时，Panda-UV将识别的片段数量翻倍，mAb亚基的序列覆盖率可以提高到86%，并且CDR几乎完全测序，显著提高了mAb的识别准确性(图4)。　　图3. A) B)Panda-UV与C) D)Clips MS解析CA、Mb、Ub三种蛋白的UVPD数据对比　　图4. Panda-UV在mAb UVPD数据分析中的应用　　总的来说，Panda-UV赋予研究人员解锁UVPD数据中内部片段的能力。尽管Panda-UV是专门为UVPD设计开发的，但是用一般解离方法(例如：HCD、ETD)得到的质谱图也是兼容的。Panda-UV揭露了完整蛋白质表征的隐藏深度，为蛋白质组学top-down深度分析提供了帮助。　　撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳文章引用：Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterizationwith Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Zhu Y, Liu Z, Liu J, et al. Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry. Anal Chem. 2024 96(21): 8474-8483.

紫外吸收光谱UV 　　分析原理：吸收紫外光能量，引起分子中电子能级的跃迁 　　谱图的表示方法：相对吸收光能量随吸收光波长的变化 　　提供的信息：吸收峰的位置、强度和形状，提供分子中不同电子结构的信息 　　荧光光谱法FS 　　分析原理：被电磁辐射激发后，从最低单线激发态回到单线基态，发射荧光 　　谱图的表示方法：发射的荧光能量随光波长的变化 　　提供的信息：荧光效率和寿命，提供分子中不同电子结构的信息 　　红外吸收光谱法IR 　　分析原理：吸收红外光能量，引起具有偶极矩变化的分子的振动、转动能级跃迁 　　谱图的表示方法：相对透射光能量随透射光频率变化 　　提供的信息：峰的位置、强度和形状，提供功能团或化学键的特征振动频率 　　拉曼光谱法Ram 　　分析原理：吸收光能后，引起具有极化率变化的分子振动，产生拉曼散射 　　谱图的表示方法：散射光能量随拉曼位移的变化 　　提供的信息：峰的位置、强度和形状，提供功能团或化学键的特征振动频率 　　核磁共振波谱法NMR 　　分析原理：在外磁场中，具有核磁矩的原子核，吸收射频能量，产生核自旋能级的跃迁 　　谱图的表示方法：吸收光能量随化学位移的变化 　　提供的信息：峰的化学位移、强度、裂分数和偶合常数，提供核的数目、所处化学环境和几何构型的信息 　　电子顺磁共振波谱法ESR 　　分析原理：在外磁场中，分子中未成对电子吸收射频能量，产生电子自旋能级跃迁 　　谱图的表示方法：吸收光能量或微分能量随磁场强度变化 　　提供的信息：谱线位置、强度、裂分数目和超精细分裂常数，提供未成对电子密度、分子键特性及几何构型信息 　　质谱分析法MS 　　分析原理：分子在真空中被电子轰击，形成离子，通过电磁场按不同m/e分离 　　谱图的表示方法：以棒图形式表示离子的相对峰度随m/e的变化 　　提供的信息：分子离子及碎片离子的质量数及其相对峰度，提供分子量，元素组成及结构的信息 　　气相色谱法GC 　　分析原理：样品中各组分在流动相和固定相之间，由于分配系数不同而分离 　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化 　　提供的信息：峰的保留值与组分热力学参数有关，是定性依据 峰面积与组分含量有关 　　反气相色谱法IGC 　　分析原理：探针分子保留值的变化取决于它和作为固定相的聚合物样品之间的相互作用力 　　谱图的表示方法：探针分子比保留体积的对数值随柱温倒数的变化曲线 　　提供的信息：探针分子保留值与温度的关系提供聚合物的热力学参数 　　裂解气相色谱法PGC 　　分析原理：高分子材料在一定条件下瞬间裂解，可获得具有一定特征的碎片 　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化 　　提供的信息：谱图的指纹性或特征碎片峰，表征聚合物的化学结构和几何构型 　　凝胶色谱法GPC 　　分析原理：样品通过凝胶柱时，按分子的流体力学体积不同进行分离，大分子先流出 　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化 　　提供的信息：高聚物的平均分子量及其分布 　　热重法TG 　　分析原理：在控温环境中，样品重量随温度或时间变化 　　谱图的表示方法：样品的重量分数随温度或时间的变化曲线 　　提供的信息：曲线陡降处为样品失重区，平台区为样品的热稳定区 　　热差分析DTA 　　分析原理：样品与参比物处于同一控温环境中，由于二者导热系数不同产生温差，记录温度随环境温度或时间的变化 　　谱图的表示方法：温差随环境温度或时间的变化曲线 　　提供的信息：提供聚合物热转变温度及各种热效应的信息 　　TG-DTA图 　　示差扫描量热分析DSC 　　分析原理：样品与参比物处于同一控温环境中，记录维持温差为零时，所需能量随环境温度或时间的变化 　　谱图的表示方法：热量或其变化率随环境温度或时间的变化曲线 　　提供的信息：提供聚合物热转变温度及各种热效应的信息 　　静态热―力分析TMA 　　分析原理：样品在恒力作用下产生的形变随温度或时间变化 　　谱图的表示方法：样品形变值随温度或时间变化曲线 　　提供的信息：热转变温度和力学状态 　　动态热―力分析DMA 　　分析原理：样品在周期性变化的外力作用下产生的形变随温度的变化 　　谱图的表示方法：模量或tg&delta 随温度变化曲线 　　提供的信息：热转变温度模量和tg&delta 　　透射电子显微术TEM 　　分析原理：高能电子束穿透试样时发生散射、吸收、干涉和衍射，使得在相平面形成衬度，显示出图象 　　谱图的表示方法：质厚衬度象、明场衍衬象、暗场衍衬象、晶格条纹象、和分子象 　　提供的信息：晶体形貌、分子量分布、微孔尺寸分布、多相结构和晶格与缺陷等 　　扫描电子显微术SEM 　　分析原理：用电子技术检测高能电子束与样品作用时产生二次电子、背散射电子、吸收电子、X射线等并放大成象 　　谱图的表示方法：背散射象、二次电子象、吸收电流象、元素的线分布和面分布等 　　提供的信息：断口形貌、表面显微结构、薄膜内部的显微结构、微区元素分析与定量元素分析等 　　原子吸收AAS 　　原理：通过原子化器将待测试样原子化，待测原子吸收待测元素空心阴极灯的光，从而使用检测器检测到的能量变低，从而得到吸光度。吸光度与待测元素的浓度成正比。 　　(Inductivecouplinghighfrequencyplasma)电感耦合高频等离子体ICP 　　原理：利用氩等离子体产生的高温使用试样完全分解形成激发态的原子和离子，由于激发态的原子和离子不稳定，外层电子会从激发态向低的能级跃迁，因此发射出特征的谱线。通过光栅等分光后，利用检测器检测特定波长的强度，光的强度与待测元素浓度成正比。 　　X-raydiffraction,x射线衍射即XRD 　　X射线是原子内层电子在高速运动电子的轰击下跃迁而产生的光辐射，主要有连续X射线和特征X射线两种。晶体可被用作X光的光栅，这些很大数目的原子或离子/分子所产生的相干散射将会发生光的干涉作用，从而影响散射的X射线的强度增强或减弱。由于大量原子散射波的叠加，互相干涉而产生最大强度的光束称为X射线的衍射线。 　　满足衍射条件，可应用布拉格公式：2dsin&theta =&lambda 　　应用已知波长的X射线来测量&theta 角，从而计算出晶面间距d，这是用于X射线结构分析 另一个是应用已知d的晶体来测量&theta 角，从而计算出特征X射线的波长，进而可在已有资料查出试样中所含的元素。 　　高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE) 　　CZE的基本原理 　　HPLC选用的毛细管一般内径约为50&mu m(20～200&mu m)，外径为375&mu m，有效长度为50cm(7～100cm)。毛细管两端分别浸入两分开的缓冲液中，同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得分析样品沿毛细管迁移，当分离样品通过检测器时，可对样品进行分析处理。HPLC进样一般采用电动力学进样(低电压)或流体力学进样(压力或抽吸)两种方式。在毛细管电泳系统中，带电溶质在电场作用下发生定向迁移，其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗是指在高电压作用下，双电层中的水合阴离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象 电泳是指在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。溶质的迁移速度由其所带电荷数和分子量大小决定，另外还受缓冲液的组成、性质、pH值等多种因素影响。带正电荷的组份沿毛细管壁形成有机双层向负极移动，带负电荷的组分被分配至毛细管近中区域，在电场作用下向正极移动。与此同时，缓冲液的电渗流向负极移动，其作用超过电泳，最终导致带正电荷、中性电荷、负电荷的组份依次通过检测器。 　　MECC的基本原理 　　MECC是在CZE基础上使用表面活性剂来充当胶束相，以胶束增溶作为分配原理，溶质在水相、胶束相中的分配系数不同，在电场作用下，毛细管中溶液的电渗流和胶束的电泳，使胶束和水相有不同的迁移速度，同时待分离物质在水相和胶束相中被多次分配，在电渗流和这种分配过程的双重作用下得以分离。MECC是电泳技术与色谱法的结合，适合同时分离分析中性和带电的样品分子。 　　扫描隧道显微镜(STM) 　　扫描隧道显微镜(STM)的基本原理是利用量子理论中的隧道效应。将原子线度的极细探针和被研究物质的表面作为两个电极，当样品与针尖的距离非常接近时(通常小于1nm)，在外加电场的作用下，电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极。这种现象即是隧道效应。 　　原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy，简称AFM) 　　原子力显微镜的工作原理就是将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。 　　俄歇电子能谱学(Augerelectronspectroscopy)，简称AES 　　俄歇电子能谱基本原理：入射电子束和物质作用，可以激发出原子的内层电子。外层电子向内层跃迁过程中所释放的能量，可能以X光的形式放出，即产生特征X射线，也可能又使核外另一电子激发成为自由电子，这种自由电子就是俄歇电子。对于一个原子来说,激发态原子在释放能量时只能进行一种发射：特征X射线或俄歇电子。原子序数大的元素，特征X射线的发射几率较大，原子序数小的元素，俄歇电子发射几率较大，当原子序数为33时，两种发射几率大致相等。因此，俄歇电子能谱适用于轻元素的分析。