质谱碎片离子表示方法

大家好，本周为大家分享一篇2024年发表在Analytical Chemistry上的文章，Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的常乘研究员以及中国科学院大连化学物理研究所的王方军教授。　　在过去的十年里，UVPD (193nm)因其出色的碎裂效率而备受关注。它能够产生a/x, b/y, c/z等多种类型离子，并能够对小于30 kDa的蛋白质提供近乎完整的序列裂解。它是完整蛋白表征的有利工具，能够提供序列、PTM、次级结构等丰富信息。常规的UVPD分析主要依赖于识别N-端或C-端碎片(a/x, b/y, c/z)，尽管已经满足大部分的小分子蛋白质(20 kDa)的需求，而对于大分子蛋白质的表征仍然有限。通过解析内部碎片(ax, ay, az, bx, by, bz, cx, cy, cz)而进一步获得更深度的序列信息是常用的策略。但由于内部片段数量庞大和匹配的低置信度，导致内部片段在很大程度上仍未得到充分利用。为了解决这一问题，作者开发Panda-UV这一新型软件工具，通过结合质谱校准技术和皮尔逊相关系数(PCC)评分系统，实现了UVPD内部碎片的有效识别和高精准匹配。Panda-UV有非常友好的界面，即便不具备编程技能也能使用(图1)。使用者需要提供蛋白序列、去卷积后的质谱数据、固定修饰信息、甚至非共价结合配体还能作为unlocalized modification添加进去用于holo-fragmemts的搜索。PCC评分系统将对碎片离子实验测定的同位素分布与理论计算的同位素分布进行比较，由此过滤掉低置信度的匹配。此外，软件中还增加了Mass Calibration用于校正实验测定的m/z或去卷积后的mass，以便获得更准确的内部碎片匹配和打分。　　图1. Panda-UV使用界面　　具体工作流程如图2所示，当设定好所有参数提交后，程序会先进行碎片匹配。首先以20 ppm进行N-端或C-端的碎片匹配，计算所有匹配上离子的平均质量误差(ppm)，此误差将带入以下公式mass_calibrated = mass/(1 + error × 10-6)，用于去卷积后的质量校正。该步骤可以尽可能扣除由仪器测定引入的误差，以便后续更准确的打分和匹配。完成校准后，再使用用户自定义ppm对校准后的去卷积质量进行第二轮碎片匹配。完成碎片匹配后，进入碎片PCC打分阶段。通过根据碎片离子的带电荷量以及化学式生成理论的同位素分布，将其与实验测定的同位素分布进行比较，主要比较同位素峰之间强度的变化趋势。完成PCC打分之后，需要删除不明确的匹配。由于理论搜索空间大，一个实验碎片可以在定义的质量误差范围内(ppm)匹配多个理论碎片，综合考虑质量误差和PCC评分，以去除歧义匹配。完成碎片匹配后，Panda-UV会根据蛋白序列和碎片匹配结果绘制蛋白整体的碎裂图以及各个残基位点的末端/内部碎片强度汇总图。　　图2. Panda-UV工作流程　　通过在三种模型蛋白质上进行全面基准测试，展示了Panda-UV强大性能(图3)。内部片段的加入使得识别的片段数量提高了26%，并将平均蛋白质序列覆盖率提高到了93%，解锁了模型蛋白质中最大蛋白碳酸酐酶II的隐藏区域。此外，平均65%的内部片段可以在多次重复实验中被识别，展示了Panda-UV识别片段的高置信度。与现有的内部片段匹配软件ClipsMS进行对比，Panda-UV通过对代码框架的优化，搜索模型蛋白的一个质谱数据不超过9分钟，比ClipsMS快50倍。最后，在分析单克隆抗体时，Panda-UV将识别的片段数量翻倍，mAb亚基的序列覆盖率可以提高到86%，并且CDR几乎完全测序，显著提高了mAb的识别准确性(图4)。　　图3. A) B)Panda-UV与C) D)Clips MS解析CA、Mb、Ub三种蛋白的UVPD数据对比　　图4. Panda-UV在mAb UVPD数据分析中的应用　　总的来说，Panda-UV赋予研究人员解锁UVPD数据中内部片段的能力。尽管Panda-UV是专门为UVPD设计开发的，但是用一般解离方法(例如：HCD、ETD)得到的质谱图也是兼容的。Panda-UV揭露了完整蛋白质表征的隐藏深度，为蛋白质组学top-down深度分析提供了帮助。　　撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳文章引用：Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Zhu Y, Liu Z, Liu J, et al. Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry. Anal Chem. 2024 96(21): 8474-8483.

紫外吸收光谱UV　　分析原理：吸收紫外光能量，引起分子中电子能级的跃迁　　谱图的表示方法：相对吸收光能量随吸收光波长的变化　　提供的信息：吸收峰的位置、强度和形状，提供分子中不同电子结构的信息　　荧光光谱法FS　　分析原理：被电磁辐射激发后，从最低单线激发态回到单线基态，发射荧光　　谱图的表示方法：发射的荧光能量随光波长的变化　　提供的信息：荧光效率和寿命，提供分子中不同电子结构的信息　　红外吸收光谱法IR　　分析原理：吸收红外光能量，引起具有偶极矩变化的分子的振动、转动能级跃迁　　谱图的表示方法：相对透射光能量随透射光频率变化　　提供的信息：峰的位置、强度和形状，提供功能团或化学键的特征振动频率　　拉曼光谱法Ram　　分析原理：吸收光能后，引起具有极化率变化的分子振动，产生拉曼散射　　谱图的表示方法：散射光能量随拉曼位移的变化　　提供的信息：峰的位置、强度和形状，提供功能团或化学键的特征振动频率　　核磁共振波谱法NMR　　分析原理：在外磁场中，具有核磁矩的原子核，吸收射频能量，产生核自旋能级的跃迁　　谱图的表示方法：吸收光能量随化学位移的变化　　提供的信息：峰的化学位移、强度、裂分数和偶合常数，提供核的数目、所处化学环境和几何构型的信息　　电子顺磁共振波谱法ESR　　分析原理：在外磁场中，分子中未成对电子吸收射频能量，产生电子自旋能级跃迁　　谱图的表示方法：吸收光能量或微分能量随磁场强度变化　　提供的信息：谱线位置、强度、裂分数目和超精细分裂常数，提供未成对电子密度、分子键特性及几何构型信息　　质谱分析法MS　　分析原理：分子在真空中被电子轰击，形成离子，通过电磁场按不同m/e分离　　谱图的表示方法：以棒图形式表示离子的相对峰度随m/e的变化　　提供的信息：分子离子及碎片离子的质量数及其相对峰度，提供分子量，元素组成及结构的信息　　气相色谱法GC　　分析原理：样品中各组分在流动相和固定相之间，由于分配系数不同而分离　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化　　提供的信息：峰的保留值与组分热力学参数有关，是定性依据 峰面积与组分含量有关　　反气相色谱法IGC　　分析原理：探针分子保留值的变化取决于它和作为固定相的聚合物样品之间的相互作用力　　谱图的表示方法：探针分子比保留体积的对数值随柱温倒数的变化曲线　　提供的信息：探针分子保留值与温度的关系提供聚合物的热力学参数　　裂解气相色谱法PGC　　分析原理：高分子材料在一定条件下瞬间裂解，可获得具有一定特征的碎片　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化　　提供的信息：谱图的指纹性或特征碎片峰，表征聚合物的化学结构和几何构型　　凝胶色谱法GPC　　分析原理：样品通过凝胶柱时，按分子的流体力学体积不同进行分离，大分子先流出　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化　　提供的信息：高聚物的平均分子量及其分布　　热重法TG　　分析原理：在控温环境中，样品重量随温度或时间变化　　谱图的表示方法：样品的重量分数随温度或时间的变化曲线　　提供的信息：曲线陡降处为样品失重区，平台区为样品的热稳定区　　热差分析DTA　　分析原理：样品与参比物处于同一控温环境中，由于二者导热系数不同产生温差，记录温度随环境温度或时间的变化　　谱图的表示方法：温差随环境温度或时间的变化曲线　　提供的信息：提供聚合物热转变温度及各种热效应的信息　　TG-DTA图　　示差扫描量热分析DSC　　分析原理：样品与参比物处于同一控温环境中，记录维持温差为零时，所需能量随环境温度或时间的变化　　谱图的表示方法：热量或其变化率随环境温度或时间的变化曲线　　提供的信息：提供聚合物热转变温度及各种热效应的信息　　静态热―力分析TMA　　分析原理：样品在恒力作用下产生的形变随温度或时间变化　　谱图的表示方法：样品形变值随温度或时间变化曲线　　提供的信息：热转变温度和力学状态　　动态热―力分析DMA　　分析原理：样品在周期性变化的外力作用下产生的形变随温度的变化　　谱图的表示方法：模量或tg&delta 随温度变化曲线　　提供的信息：热转变温度模量和tg&delta 　　透射电子显微术TEM　　分析原理：高能电子束穿透试样时发生散射、吸收、干涉和衍射，使得在相平面形成衬度，显示出图象　　谱图的表示方法：质厚衬度象、明场衍衬象、暗场衍衬象、晶格条纹象、和分子象　　提供的信息：晶体形貌、分子量分布、微孔尺寸分布、多相结构和晶格与缺陷等　　扫描电子显微术SEM　　分析原理：用电子技术检测高能电子束与样品作用时产生二次电子、背散射电子、吸收电子、X射线等并放大成象　　谱图的表示方法：背散射象、二次电子象、吸收电流象、元素的线分布和面分布等　　提供的信息：断口形貌、表面显微结构、薄膜内部的显微结构、微区元素分析与定量元素分析等　　原子吸收AAS　　原理：通过原子化器将待测试样原子化，待测原子吸收待测元素空心阴极灯的光，从而使用检测器检测到的能量变低，从而得到吸光度。吸光度与待测元素的浓度成正比。　　(Inductivecouplinghighfrequencyplasma)电感耦合高频等离子体ICP　　原理：利用氩等离子体产生的高温使用试样完全分解形成激发态的原子和离子，由于激发态的原子和离子不稳定，外层电子会从激发态向低的能级跃迁，因此发射出特征的谱线。通过光栅等分光后，利用检测器检测特定波长的强度，光的强度与待测元素浓度成正比。　　X-raydiffraction,x射线衍射即XRD　　X射线是原子内层电子在高速运动电子的轰击下跃迁而产生的光辐射，主要有连续X射线和特征X射线两种。晶体可被用作X光的光栅，这些很大数目的原子或离子/分子所产生的相干散射将会发生光的干涉作用，从而影响散射的X射线的强度增强或减弱。由于大量原子散射波的叠加，互相干涉而产生最大强度的光束称为X射线的衍射线。　　满足衍射条件，可应用布拉格公式：2dsin&theta =&lambda 　　应用已知波长的X射线来测量&theta 角，从而计算出晶面间距d，这是用于X射线结构分析 另一个是应用已知d的晶体来测量&theta 角，从而计算出特征X射线的波长，进而可在已有资料查出试样中所含的元素。　　高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE)　　CZE的基本原理　　HPLC选用的毛细管一般内径约为50&mu m(20～200&mu m)，外径为375&mu m，有效长度为50cm(7～100cm)。毛细管两端分别浸入两分开的缓冲液中，同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得分析样品沿毛细管迁移，当分离样品通过检测器时，可对样品进行分析处理。HPLC进样一般采用电动力学进样(低电压)或流体力学进样(压力或抽吸)两种方式。在毛细管电泳系统中，带电溶质在电场作用下发生定向迁移，其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗是指在高电压作用下，双电层中的水合阴离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象 电泳是指在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。溶质的迁移速度由其所带电荷数和分子量大小决定，另外还受缓冲液的组成、性质、pH值等多种因素影响。带正电荷的组份沿毛细管壁形成有机双层向负极移动，带负电荷的组分被分配至毛细管近中区域，在电场作用下向正极移动。与此同时，缓冲液的电渗流向负极移动，其作用超过电泳，最终导致带正电荷、中性电荷、负电荷的组份依次通过检测器。　　MECC的基本原理　　MECC是在CZE基础上使用表面活性剂来充当胶束相，以胶束增溶作为分配原理，溶质在水相、胶束相中的分配系数不同，在电场作用下，毛细管中溶液的电渗流和胶束的电泳，使胶束和水相有不同的迁移速度，同时待分离物质在水相和胶束相中被多次分配，在电渗流和这种分配过程的双重作用下得以分离。MECC是电泳技术与色谱法的结合，适合同时分离分析中性和带电的样品分子。　　扫描隧道显微镜(STM)　　扫描隧道显微镜(STM)的基本原理是利用量子理论中的隧道效应。将原子线度的极细探针和被研究物质的表面作为两个电极，当样品与针尖的距离非常接近时(通常小于1nm)，在外加电场的作用下，电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极。这种现象即是隧道效应。　　原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy，简称AFM)　　原子力显微镜的工作原理就是将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。　　俄歇电子能谱学(Augerelectronspectroscopy)，简称AES　　俄歇电子能谱基本原理：入射电子束和物质作用，可以激发出原子的内层电子。外层电子向内层跃迁过程中所释放的能量，可能以X光的形式放出，即产生特征X射线，也可能又使核外另一电子激发成为自由电子，这种自由电子就是俄歇电子。对于一个原子来说,激发态原子在释放能量时只能进行一种发射：特征X射线或俄歇电子。原子序数大的元素，特征X射线的发射几率较大，原子序数小的元素，俄歇电子发射几率较大，当原子序数为33时，两种发射几率大致相等。因此，俄歇电子能谱适用于轻元素的分析。

近日，中国科学院大连化学物理研究所所仪器分析化学研究室质谱与快速检测研究中心（102组）李海洋研究员团队在现场检测微型质谱及应用方面取得新进展，基于自主研发的现场快速检测微型质谱（Anal. Chem.，2022），开发了简单易控、高碎片化效率的新型多重碎片化碰撞诱导解离技术，可实现单次进样条件下获得丰富碎片离子信息，对于化学战剂、D品的准确识别，以及新型合成D品的结构解析具有重要意义。　　新型D品层出不穷、种类繁多，成为当前D品犯罪案件的突出特点。此外，D品的种类不断翻新，更具伪装性、隐蔽性和迷惑性，使得检测难度大。因此，开发便携式仪器用于新型D品的及早发现，以及传统D品的现场快速准确识别对禁D工作具有重要意义。李海洋团队前期基于微型质谱关键技术，实现了传统D品和新型芬太尼类D品的定性检测（Anal. Chem.，2021；Anal. Chem.，2021；Anal. Chem.，2019；Anal. Chem.，2019），并在云南边境多个检查站开展了推广应用。　　传统共振碰撞解离技术需要多次进样才可以获得多重碎片离子信息。本工作中，基于此前构建的现场检测微型质谱，该团队开发了一种简单易控的新型碰撞诱导解离方式技术，可实现单次进样条件下获取多重离子碎片信息。基于对离子阱内微区电场分布的研究，团队还揭示了该技术的微观本质，即增大离子阱质量分析器的直流偏置电压有利于增强径向电场强度，从而驱动离子进入强射频场获得能量、发生碰撞诱导解离。通过调控电场、离子的初始动能和气压等，该碰撞诱导解离技术可实现100%的碎片化率。该技术还可同时获得多个碎片离子，有利于提升识别准确性，实现痕量D品同分异构体的区分、化学战剂的准确识别等。此外，该技术通过分析母离子以及不同碎片离子之间的质量数差异，可实现对D品的结构解析与分类，适用于新型合成D品早期发现预警，在D品稽查、公共安全等领域具有广阔应用前景。　　相关研究以“Radial Electric Field Driven Collision-Induced Dissociation in a Miniature Continuous Atmospheric Pressure Interfaced Ion Trap Mass Spectrometer”为题，于近日发表在《美国质谱学会杂志》（Journal of the American Society for Mass Spectrometry）上，并被选为封面文章。该工作的第一作者是我所102组博士研究生阮慧文。上述工作得到国家自然科学基金、我所创新基金等项目的支持。（文/图 王卫国、阮慧文）　　文章链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jasms.3c00324