化学疗法

外泌体创新疗法：机遇、挑战和应对策略多宁生物科技外泌体是细胞外囊泡的一种亚型，后者是源自细胞的脂质双层闭合结构，几乎由所有类型的细胞分泌，包括外泌体（30-150 nm）、微泡（150 nm 至 1 μm）和凋亡小体（1-5 μm）。长期以来，这些囊泡被认为是一种装载细胞代谢废物的方式，负责运输细胞产生的废物。直到80年代，科研人员在研究绵羊网织红细胞的发育时，才初步确定了一些30-150 nm的囊泡的作用，并命名为外泌体。在电子显微镜下观察，外泌体的形状一般呈杯状或球状，其在细胞间保护和递送功能性大分子，包括核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物，将它们的“货物”转移到受体细胞。基于外泌体的临床试验的分析（J. Rezaie, et al., 2022）基于多年的研究，行业已经认识到了外泌体在多种应用中的潜力。在目前的临床试验中，外泌体被用作生物标志物、无细胞疗法（外泌体疗法）、药物递送系统以及抗肿瘤疫苗等。其来源包括间充质细胞、T 细胞和树突状细胞以及其它工程细胞系。外泌体作为药物递送载体具有不可替代的优势，包括低免疫原性、优异的生物相容性和生物稳定性。除了使用未经任何基因/化学修饰的天然外泌体外，对于将有效载荷载入外泌体，主要有两种方式：在直接方法中，外泌体在制备和纯化后装载治疗药物（外源性加载），而在间接方法中，适当的细胞经过基因工程处理或与治疗药物共培养以产生工程外泌体（内源性加载）。将不同有效载荷加载到外泌体中的策略。A. 未经任何基因/化学修饰的天然外泌体。B. 通过亲代细胞工程（树突细胞、间充质干细胞、成纤维细胞和其它细胞）将货物装载到外泌体中。这种策略能够通过在外泌体生物发生之前简单地增加它们在亲代细胞细胞质中的浓度来加载核酸、蛋白质和/或小分子量药物，从而将所需分子包装到新形成的外泌体的腔中。C. 通过膜透化或加载策略将货物加载到外泌体（分离后）。这种策略能够通过被动或主动载荷装载方法装载核酸、蛋白质和/或小药物。然后细胞外环境中的外泌体可以被受体细胞吸收。(D. Ferreira, et al., 2022)对于外源性加载，行业已经探索了各种策略，以将药物加载到外泌体中，最大化其递送潜力，包括简单的孵育以及电转、超声处理、冻融等。研究之间通常存在一些差异，归因于不同的亲本细胞的生物学行为和试剂特性。此外，外泌体天生就装载有天然蛋白质和核酸，这大大降低了所需的载荷装载效率。实现最佳装载的正确方法，又在一定程度上取决于载荷分子，必须事先仔细选择，并且应该考虑负载能力、药物保留和对外泌体特性的潜在影响。直接加载策略的局限性限制了基于外泌体的疗法在临床试验中的使用。创建和使用合理且目的性设计、具有高度定义和可再现属性、同时具有一个已知作用机制的工程外泌体是天然源性外泌体的一个令人信服的替代选择，因为天然源性外泌体通常具有较高的异质性，且作用机制不明确，而工程外泌体对于重要新药物的开发来说，是更加可行的基础。但工程方法需要在维持理想的外泌体理化特性和提高装载效率方面实现一定的改进。而另一个挑战在于，大部分用于外泌体工程的方法都难以在稳定载入所需载荷以及表面修饰 vs. 保持外泌体生物相容性之间找到平衡。基于外泌体的治疗产品的cGMP生产流程（J. Rezaie, et al., 2022）在将基于外泌体的疗法扩展到工业规模生产并随后进入临床的另一个瓶颈是大规模临床级外泌体的产生。外泌体的产量高度依赖于其亲本细胞，受限于细胞分泌外泌体的能力不同以及大规模细胞培养的高难度和高成本。对于药用外泌体行业，扩大到工业水平仍处于起步阶段，最重要的是尽早决定能够生产所需数量并含有治疗性有效载荷的外泌体的方法。大规模外泌体分离方法的低效性是临床级外泌体开发的另一个障碍。不同细胞类型释放的外泌体的数量、物理化学特征和组成可能不同。目前，基于不同原理的技术已用于外泌体分离，包括差速/超速离心、过滤、尺寸排阻层析、基于免疫亲和捕获、聚合物沉淀等。尽管已经开发并优化了一些外泌体纯化方法，但仍然很难找到一种特定的方法解决所有相关的挑战，如分离效率低、样品损失、外泌体回收率和纯度低、以及批次间差异。相应地，全面表征外泌体也至关重要，特别是在大小、形态、浓度、外泌体标记物/内容物的存在以及污染物的去除方面。常用的外泌体分离方法及其优、缺点虽然仍存在挑战和限制，但各种制药公司和初创企业已经铺平了临床级外泌体疗法的发展之路。越来越多的公司专注于开发此类基于外泌体的疗法，以解决各种疗法的药物输送问题，包括小分子、RNA 疗法、蛋白质、病毒基因疗法，甚至成簇规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 基因编辑工具。其中一些公司也在寻求更加创新的外泌体工程方法来设计基于外泌体的治疗药物，以增加载药量，提高靶向能力。递送 RNA、蛋白质和化学药物的传统方法已经显示出一些局限性，而外泌体作为药物递送载体具有免疫原性低、长期安全和无细胞毒性等巨大优势，在基于外泌体的药物在临床转化、大规模生产、稳定的制备、存储方案和质量控制方面仍存在必须克服的挑战。进一步开发细胞衍生的工程外泌体及其分离、纯化和药物装载技术将有助于克服这些缺点。工程外泌体在提高生产力方面具有显著的商业优势。此外，通过将特定的表面分子锚定在外泌体上，可以增加外泌体在靶细胞或目标疾病部位的局部浓度，从而降低毒性和不良反应，并最大限度地提高治疗效果。未来，行业将可能开发新型多功能化工程外泌体来改善医疗保健，因此，需要进一步的研究来探索外泌体介导疗法的新策略。参考文献：D. Ferreira, J.N.Moreira, L.R. Rodrigues, New advances in exosome-based targeted drug delivery systems. Critical Reviews in Oncology / Hematology, 2022,172:103628.J.Rezaie, M. Feghhi, T.Etemadi, A review on exosomes application in clinical trials: perspective, questions, and challenges. Cell Communication and Signaling, 2022: 20:145.S.Bashyal, C.Thapa, S.Lee, Recent progresses in exosome-based systems for targeted drug delivery to the brain. Journal of Controlled Release, 2022, 348:723-744.

p style="text-indent: 2em "10月27日，记者从国内基因编辑领域先锋博雅辑因（EdiGene, Inc.）获悉，公司当天宣布中国国家药品监督管理局药品审评中心已经受理其针对输血依赖型β地中海贫血的基因编辑疗法产品ET-01（受理号：CXSL2000299），即CRISPR/Cas9基因修饰BCL11A红系增强子的自体CD34+造血干祖细胞注射液的临床试验申请。/pp style="text-indent: 2em "这是中国首个获药品审评中心受理的基因编辑疗法临床试验申请。据介绍，此项临床试验计划在输血依赖型β地中海贫血患者中评价ET-01单次移植的安全性和有效性。/pp style="text-indent: 2em "ET-01，即CRISPR/Cas9基因修饰BCL11A红系增强子的自体CD34+造血干祖细胞注射液，是处于研究阶段的、用于治疗输血依赖型β地中海贫血的产品。ET-01原液通过采集患者自体动员外周血单个核细胞，富集CD34+细胞群后用CRISPR/Cas9系统编辑BCL11A基因的红系增强子制成。/pp style="text-indent: 2em "此前的2018年，博雅辑因在广州南沙区建立了cGMP标准的基因编辑临床转化应用基地，并于2019年在第61届美国血液学年会(ASH)上发布了ET-01规模化生产及临床前安全性和有效性实验数据。/pp style="text-indent: 2em "地中海贫血是指一组由珠蛋白基因缺失或点突变致使珠蛋白肽链合成被部分或完全抑制的遗传性溶血性贫血疾病。临床上，最常见的为α地中海贫血和β地中海贫血，由组成正常成年人的血红蛋白(HbA, α2β2)的两种多肽链（α或β）之一减少导致。/pp style="text-indent: 2em "据2015年《中国地中海贫血蓝皮书》，中国地中海贫血病基因携带者高达3000万人，中重型地中海贫血病患者达30万人。β地贫患儿出生后病情进行性加重，除贫血症状外，易并发脾肿大、发育落后及免疫力低下导致的多器官功能受损50%重型地贫患者5岁之前夭折，如不进行有效治疗，很少能活过20岁。/pp style="text-indent: 2em "“我们非常高兴看到公司取得这一重要里程碑，继续将ET-01向临床试验阶段推进。”博雅辑因首席执行官魏东博士表示，“我们一直致力于将前沿的基因编辑技术转化为变革性疗法，为患者带去更优的治疗选择，并为一些疾病的患者带去一次性治愈的可能。我们期待ET-01的临床试验获得许可开展的时刻，更期望我们的产品能够真正改变患者的生活，帮助他们活得更健康长久。”/pp style="text-indent: 2em "值得注意的是，自2013年以来，基因编辑领域持续火热。埃马纽埃尔· 卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗· 杜德纳（Jennifer A. Doudna）两位CRISPR基因编辑系统的开发者也最终摘得今年的诺贝尔化学奖。/pp style="text-indent: 2em "仅在过去的一年半中，就至少有11项基因编辑研发项目在美国、欧盟进入临床开发阶段，其中有6项基于CRISPR基因编辑系统。而在地中海贫血治疗方面，2018年，生物医药企业CRISPR Therapeutics和美国制药企业福泰制药(Vertex Pharmaceuticals)的CTX001获得了美国和欧洲监管机构的新药研究申请批件，这也是全球首个由制药公司发起的体外CRISPR疗法的新药临床试验，目前处于I/II期临床试验阶段。/pp style="text-indent: 2em "此外，基因编辑技术ZFN的持有者Sangamo Therapeutics公司针对地中海贫血使用ZFN技术针对造血干细胞进行修复，该项目是和赛诺菲子公司Bioverativ合作开发，现在也已经进入I/II期临床研究阶段。/pp style="text-indent: 2em "博雅辑因成立于2015年，总部位于北京，在广州以及美国剑桥设有分公司。官网介绍，博雅辑因是一家致力于通过国际前沿的基因组编辑技术，为多种遗传疾病和癌症加速药物研究以及开发创新疗法的生物医药企业。/pp style="text-indent: 2em "博雅辑因科学创始人为北京大学生命科学学院教授魏文胜。现年51岁的魏文胜出生于江苏，1991年获得北京大学生物化学学士学位，1999年获得密西根州立大学遗传学博士学位，之后赴斯坦福大学医学院从事博士后研究，师从美国科学院院士Stanley Cohen教授。魏文胜还担任北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）及北大-清华生命科学联合中心（CLS）研究员以及北京大学基因组编辑研究中心主任等多项职务。/pp style="text-indent: 2em "值得一提的是，就在10月13日，博雅辑因宣布了完成4.5亿元人民币的B轮融资。这是国内基因编辑疗法研发企业中截至目前最大金额融资，也是首个B轮融资。2018年8月至今，博雅辑因在过去2年总融资金额达7亿元人民币。/ppbr//p

分享：基因编辑技术能否有助于将细胞疗法用于治疗实体瘤？珀金埃尔默旗下Horizon Discovery的乔纳森弗兰普顿 (Jonathan Frampton) 在给Laboratory News的一篇撰文中，介绍了如何利用碱基编辑技术来降低当前昂贵的治疗成本，使其成为治疗癌症的主流方法。开发同种异体细胞疗法还需解决一些挑战，包括如何避免破坏患者的免疫系统。目前有两种有效的细胞疗法能治疗“液体肿瘤”（白血病和淋巴瘤）。诺华研发的Kymriah和吉利德科学研发的Yescarta两种药物使用的细胞均属于嵌合抗原受体(CAR) T细胞——两者最初均表现出高反应率，这种高反应率会在部分患者中形成持久的临床反应。虽然这些疗法的前期效果良好，但如何让下一代细胞疗法能够有效治疗实体瘤，仍面临不少问题。2019年，美国新增约176,000名液体肿瘤患者，而实体瘤新增患者约为160万（几乎增长10倍）。此外，由于Kymriah和Yescarta 均属于自体疗法（使用患者体内的细胞用于药物生产），这种个体的治疗成本很高，分别为475,000美元（Kymriah）和373,000美元（Yescarta），这远远超出了大众可以承受的医疗预算范围。相比之下，如使用一般抗癌药物，患者每月的花费约为10,000 美元。这种情况下，需要作出哪些改变，才能让细胞疗法成为治疗癌症的主要方法呢？基因编辑技术—能否将细胞疗法用于治疗实体瘤？尽管细胞疗法是一种复杂的癌症治疗形式，但它可以直接靶向液体肿瘤。细胞疗法可以通过血液进入白血病和淋巴瘤细胞，从而不需要靶向特定的组织或器官，也无需在杂乱无章的毛细血管网络中进行导航以及长时间驻留在免疫抑制和缺氧的实体瘤微环境中。人们普遍认为，需要进一步完善细胞疗法才能应对和克服这些挑战，从而提高患者的生存率。 避免出现脱靶染色体易位要增加存活率、增殖率和持久性，需要精确调节治疗细胞，这可能涉及对多个基因进行编辑。虽然普遍使用的基因编辑器CRISPR-Cas 在改变单个遗传信息时具有很强的稳健性，但这一过程会使得DNA双链产生断裂 (DSB) ，导致细胞出现脱靶染色体易位。借助单编辑或双编辑技术，在正确的指引和谨慎使用下，就很少会出现遗传信息的改变；不过，如需要编辑多个基因，产生染色体易位和其他遗传畸变的风险就会增加，这种风险可能会引起致癌细胞的产生，对于患者来说这无疑是一种潜在的灾难。在需要对一个或两个基因进行编辑，如果可以精确地识别出用于患者治疗的已编辑过细胞，就可避免易位现象。然而，当需要编辑的细胞较多时，很难精确识别已编辑细胞，进而导致致癌易位风险的增加。碱基编辑器：避免出现双链断裂碱基编辑作为基因编辑领域一项相对较新的技术，正在受到人们的关注。碱基编辑器可以在不使用核酸酶来导入DNA 双链断裂的情况下，持续高效地在原代细胞中进行基因编辑。利用碱基编辑在DNA中形成一个缺口（或单链断裂）并借助脱氨酶改变特定的碱基对，这样就可以通过在早期编码外显子中引入终止密码子来实现高效的基因敲除。未来几年，碱基编辑会对细胞疗法的发展产生更明显的影响，尤其是对同种异体细胞、非自体细胞治疗的发展的影响。通用型同种异体细胞疗法？借助同种异体细胞疗法，可以将健康供体转换为通用型治疗细胞，可以大规模生产治疗细胞并集中储存，在治疗需要时可以随时获取。但要开发同种异体细胞疗法会面临一些挑战，包括如何才能避免破坏患者的免疫系统。为了克服这个问题，就必须改造现行的同种异体细胞疗法，使其具有隐身模式，在这种模式下，患者的免疫系统将它视为“自我”的一部分。要开发出这样的细胞，需要修改多个基因，而且这些基因很可能会被敲除。碱基编辑器将在编辑多个基因方面发挥关键作用，这样能够在不使用免疫抑制药物的情况下，延长同种异体治疗细胞在患者体内的存活时间。同种异体细胞疗法的供应链简单、易大规模生产，成本上比自体细胞疗法更低。相关医疗经济研究结果表明，如果能够实现规模经济，同种异体细胞疗法的费用可以降到每剂7500美元，毫无疑问这将有助于进一步推广细胞疗法，使其成为主流疗法。推广细胞疗法持久临床反应的高效细胞疗法是另一个可以实现的目标。它需要将免疫细胞的疗法在治疗液体肿瘤中的成功经验转应用于治疗实体瘤，它需要修改免疫细胞，使其能够适应更为复杂的实体瘤微环境，同时降低此类疗法的成本。这两个目标都可以通过应用高效的基因编辑技术开发同种异体细胞疗法来实现。目前人们正利用CRISPR-Cas进行细胞开发，随着安全性不断提高，未来的同种异体细胞疗法利用碱基编辑器来改变基因信息，将为真正的细胞疗法治疗肿瘤带来雨霖。作者: Jonathan Frampton，珀金埃尔默旗下Horizon Discovery业务发展合伙人（Corporate Development Partner）